Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makrofagi to profesjonalne fagocyty z wrodzonego ramienia układu odpornościowego. W stanie stacjonarnym siedzące makrofagi znajdują się w dorosłych tkankach, gdzie działają jako strażnicy pierwszej linii infekcji i uszkodzenia tkanek. Podczas gdy inne komórki odpornościowe są stale odnawiane z hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) znajdujących się w szpiku kostnym, wykazano, że linia makrofagów, znana jako makrofagi rezydentne, utrzymuje się samoczynnie w tkankach bez wkładu HSPC szpiku kostnego. Przykładem tej linii jest między innymi mikroglej w mózgu, komórki Kupffera w wątrobie i komórki Langerhansa w naskórku. Blaszka właściwa jelita grubego i okrężnicy są jedynymi dorosłymi tkankami pozbawionymi makrofagów niezależnych od HSPC. Ostatnie badania wykazały, że rezydujące makrofagi pochodzą z pozaembrionalnej hematopoezy woreczka żółtkowego od progenitora (przodków) odrębnego od płodowych hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Wśród ostatecznej hematopoezy woreczka żółtkowego, progenitorzy erytromieloidalni (EMP) dają początek zarówno komórkom erytroidalnym, jak i szpikowym, w szczególności makrofagom rezydentnym. EMP są generowane w woreczku żółtkowym tylko między E8,5 a E10,5 dniem rozwoju i migrują do wątroby płodu już po połączeniu krążenia, gdzie rozszerzają się i różnicują aż do co najmniej E16,5. Ich potomstwo obejmuje erytrocyty, makrofagi, neutrofile i komórki tuczne, ale tylko makrofagi pochodzące z EMP utrzymują się w tkankach do dorosłości. Przejściowy charakter powstawania EMP i czasowe nakładanie się na wytwarzanie HSC utrudnia analizę tych czynników progenitorowych. Ustaliliśmy protokół mapowania losu indukowany tamoksyfenem w oparciu o ekspresję promotora receptora cytokin makrofagów Csf1r w celu scharakteryzowania komórek EMP i pochodzących z EMP in vivo za pomocą cytometrii przepływowej.
Wprowadzenie
Istnieje kilka kolejnych, ale nakładających się na siebie fal hematopoetycznych prekursorów podczas rozwoju, których mieloidalne potomstwo pozostaje do dorosłości. Po pierwsze, unipotencjalne "prymitywne" progenitorzy pojawiają się w woreczku z żółtkiem myszy 1,2 między E7.5-E8.25 i dają początek embrionalnym makrofagom bez żadnego monocytowego produktu pośredniego. To, czy makrofagi pochodzące od prymitywnych przodków utrzymują się w dorosłym mózgu jako mikroglej, pozostaje przedmiotem aktywnych badań. Po drugie, prekursory erytro-szpiku (EMP) powstają w woreczku żółtkowym w temperaturze E8,5, dostają się do krwiobiegu i kolonizują zarodek. EMP wyłaniają się z półbłonka hemogennego worka żółtkowego w zależnym od Runx1 przejściu śródbłonkowym do krwiotwórczego 3,4. Podczas gdy EMP może różnicować się w makrofagi w woreczku żółtkowym, kolonizują również wątrobę płodu od dnia embrionalnego (E)95 i różnicują się w erytrocyty, megakariocyty, makrofagi, monocyty, granulocyty i komórki tuczne 6. Makrofagi pochodzące z EMP wykazują zdolność proliferacyjną w tkankach rozwojowych i dorosłych. To, czy makrofagi pochodzące z EMP omijają etap różnicowania monocytów, jest nadal kontrowersyjne, ponieważ bardzo niewiele wiadomo o ich szlaku różnicowania 7,8. Wreszcie hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) pojawiają się w E10,5 w zarodku właściwym z obszaru aorta-gonad-śródnercza i migrują do wątroby płodu. HSC z długoterminową zdolnością do ponownego zasiedlenia są wykrywane dopiero po E11 (w stadium 42 par somitów)9. Tam rozszerzają się i różnicują od E12,5, aż do ostatecznej hematopoezy zaczyna przesuwać się do szpiku kostnego, który staje się dominującym miejscem produkcji komórek krwi na czas życia pourodzeniowego 10.
Przestrzenne i czasowe nakładanie się na siebie, jak również wspólne markery immunofenotypowe, jak dotąd utrudniały nam rozróżnianie specyficznych wkładów tych fal embrionalnych hematopoetycznych progenitorów. Podczas gdy zarówno EMP, jak i HSC są generowane w sposób zależny od Runx1 i wyrażają między innymi czynnik transkrypcyjny Myb i receptor czynnika wzrostu Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, znany również jako Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor), EMP można odróżnić od HSC po braku potencjału limfatycznego, zarówno in vitro, jak i in vivo, braku długoterminowego potencjału ponownego zasiedlania i braku powierzchniowej ekspresji markera linii Sca-1 11. Genetyczne modele mapowania losu są niezbędne do scharakteryzowania ontogenezy makrofagów, ponieważ pozwalają na celowanie w embrionalne komórki progenitorowe w sposób specyficzny dla komórki i czasu. Tutaj przedstawiamy protokół mapowania losu stosowany w naszym laboratorium do rozróżniania dwóch linii makrofagów znajdujących się w większości dorosłych tkanek: makrofagów naciekających pochodzących z HSC i makrofagów rezydentnych niezależnych od HSC.
Makrofagi rezydujące w tkankach zostały prześledzone do niezależnych od Myb komórek prekursorowych wyrażających receptor cytokin Csf1r12 i są obecne w zarodku w E8.5-E10.5 przy użyciu trzech uzupełniających się strategii mapowania losu 6. W celu zbadania hematopoezy woreczka żółtkowego bez znakowania płodowych HSC, używamy transgenicznego szczepu, Csf1rMeriCreMer, wyrażającego indukowane tamoksyfenem białko fuzyjne "ulepszonej" rekombinazy Cre i dwa mysie receptory estrogenowe (Mer-iCre-Mer) pod kontrolą promotora Csf1r. W związku z tym rekombinaza Cre będzie aktywna w komórkach eksprymujących Csf1r w ograniczonym oknie czasowym. W przypadku stosowania ze szczepem reporterowym zawierającym białko fluorescencyjne za kasetą lox-STOP-lox (Rosa26LSL-eYFP), doprowadzi to do trwałego znakowania genetycznego komórek obecnych w momencie indukcji, ale także ich potomstwa. Podanie w E8.5 aktywnej formy tamoksyfenu, 4-hydroksytamoksyfenu (OH-TAM), znakuje EMP i makrofagi, bez znakowania woreczka żółtkowego jednosilnych "prymitywnych" progenitorów lub płodowych HSC. W ten sposób scharakteryzowaliśmy immunofenotyp EMP i ich potomstwa podczas rozwoju embrionalnego, a także oceniliśmy udział makrofagów pochodzących z woreczka żółtkowego w pulach dorosłych makrofagów. Konieczne są dalsze prace, aby scharakteryzować, czy prymitywne makrofagi pochodzące od przodków są również znakowane przy użyciu tego podejścia i czy mogą przyczyniać się do tworzenia puli dorosłych makrofagów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym instytucjonalnym komitetem ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania przy Instytucie Pasteura (CETEA).
1. Znakowanie impulsów in utero w zarodkach Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP
- Przygotować roztwór podstawowy 4-hydroksytamoksyfenu (OH-TAM, 50 mg/ml).
- Pod wpływem oparów otworzyć fiolkę 25 mg OH-TAM i dodać 250 μl etanolu (100%).
- Przenieść roztwór OH-TAM do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml ze ściętą końcówką i wirować z maksymalną prędkością przez 10 minut.
- Sonikacja 30 minut w kąpieli sonikołatora.
- Dodać 250 μl oleju rycynowego PEG-35 pod wyciąg, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml.
UWAGA: Olej rycynowy PEG-35 to rozpuszczalnik o właściwościach amfifilowych, który wiąże cząsteczki hydrofobowe i rozpuszcza je w rozpuszczalnikach wodnych. - Wirować przez około 5 minut z maksymalną prędkością i sonikować przez 30 minut w kąpieli sonicyjnej.
- Podwielokrotność 90 μl (4,5 mg) na probówkę do mikrowirówki (1 podwielokrotność na wstrzyknięcie).
- Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień lub w temperaturze -20 °C przez długi czas, zgodnie z wcześniejszym opisem 13.
- Przygotować roztwór podstawowy progesteronu (10 mg/ml)
- Dodać 250 μl 100% etanolu do 25 mg progesteronu, aby przygotować zawiesinę 10 mg/100 μl pod dymem. Wiruj delikatnie.
- Dodaj 2250 μl autoklawizowanego oleju słonecznikowego, aby uzyskać 10 mg/ml roztworu progesteronu pod maską.
- Wirować przez około 5 minut z maksymalną prędkością, porcjować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Należy pamiętać, że roztwór jest klarowny podczas przechowywania.
- Tamoksyfen podawanie
UWAGA: Rozwój embrionalny oszacowano, biorąc pod uwagę dzień powstania czopa pochwowego jako dzień embrionalny (E) 0,5. Rekombinacja jest indukowana przez pojedyncze wstrzyknięcie w E8,5 ciężarnym samicom Csf1rMeriCreMer 12. Uzupełnij OH-TAM o 37,5 μg na g progesteronu w celu zmniejszenia liczby poronień po podaniu tamoksyfenu. Wstrzyknąć o godz. 13 (w przypadku czopa dopochwowego obserwowanego rano).- Rano w dniu wstrzyknięcia należy poddać sonikacji podwielokrotność roztworu OH-TAM przez 10 minut (lub do całkowitego zawieszenia).
- Dodać 360 μl NaCl 0,9% pod dymem, aby uzyskać roztwór 10 mg/mL OH-TAM i dokładnie odwirować. Sonikować do momentu, gdy roztwór będzie klarowny i całkowicie ponownie zawieszony (co najmniej 30 minut).
- Podgrzej progesteron do temperatury pokojowej.
- Wymieszać 450 μl OH-TAM i 225 μl progesteronu w probówce do mikrowirówki. Wir.
- Sonikować przez co najmniej 10 minut i naładować do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25G.
- W pomieszczeniu dla zwierząt należy zważyć ciężarną samicę (samice Csf1rMeriCreMer mają wsobne podłoże genetyczne FVB i zazwyczaj ważą od 25 do 33 g).
- Wykonaj wstrzyknięcie dootrzewnowe, powoli wstrzykując obliczoną objętość myszy. Po wyjęciu igły delikatnie przycisnąć ranę po wkłuciu i masować brzuch, aby rozprowadzić OH-TAM.
UWAGA: Dawka OH-TAM do wstrzykiwań wynosi 75 mg/kg, a dawka progesteronu wynosi 37,5 mg/kg. W Tabeli 1 podano objętość do wstrzyknięcia ciężarnym kobietom.
| Waga myszy (g) | Całkowita objętość do wstrzyknięcia z mieszanki (μl) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 Rozdział 27 | Rozdział 303 |
| 28 | Rozdział 315 |
| 29 | Rozdział 326 |
| Rozdział 30 | 338 |
| Rozdział 31 | 348 |
| Rozdział 32 | 360 pkt |
| 33 Rozdział 33 | Lokal mieszkalny 371 |
| Rozdział 34 | Okręg wyborczy 382 |
| 35 | Okręg wyborczy 394 |
Tabela 1: Objętość wstrzyknięcia 4-OH-tamoksyfenu (OH-TAM). Objętość wymagana do pojedynczego wstrzyknięcia w dawce E8,5 wynoszącej 75 μg na g (masa ciała) OH-TAM uzupełniona 37,5 μg / g progesteronu.
2. Rozwarstwienie woreczka żółtkowego (YS) i wątroby płodu (FL)
UWAGA: Rygorystyczne techniki sterylne nie są konieczne podczas manipulowania embrionami, chyba że mają być używane do długotrwałej hodowli. Niemniej jednak obszar roboczy musi być czysty i pokryty folią pod chłonnym papierem.
- Przygotuj lodowato zimną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i mieszankę do trawienia (PBS zawierający 1 mg/ml kolagenazy D, 100 U/ml dezoksyrybonukleazy I (DNazy I) i 3% płodowej surowicy bydlęcej).
- Uśmiercać ciężarne samice przez zwichnięcie szyjki macicy w wymaganym dniu ciąży (np. stadium embrionalne E10.5).
- Uszczypnij skórę tuż nad genitaliami i wykonaj małe nacięcie nożyczkami na linii środkowej. Pociągnij skórę w kierunku głowy, aby całkowicie odsłonić ścianę ciała bez sierści. Przetnij mięśnie brzucha, aby odsłonić narządy wewnętrzne i popchnij jelito, aby odsłonić dwa rogi macicy.
- Za pomocą kleszczy średniej wielkości chwyć poduszeczkę tłuszczową przymocowaną do jajnika i delikatnie pociągnij macicę. Przeciąć na poziomie szyjki macicy rogów macicy i podnieść rogi z jamy otrzewnej. Usuń poduszkę tłuszczową, aby całkowicie uwolnić rogi macicy i odetnij rogi z jajnika z każdej strony.
- Włóż rogi do lodowatego PBS na 10 mm szalce Petriego. Szybko chwyć warstwy mięśni macicy na jednym końcu (koniec szyjki macicy) i wsuń cienkie nożyczki między warstwę mięśniową a tkankę dziesiętną, aby uwolnić zarodki z otaczającą tkanką dziesiętną.
UWAGA: Mięśnie mają tendencję do gwałtownego kurczenia się po ekstrakcji, więc ten krok musi być tak szybki, jak to możliwe. - Użyj jednej pary cienkich kleszczy, aby odciąć błonę Reicherta i łożysko.
- Delikatnie wyjmij woreczek żółtkowy i umieść go na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z 0,5 ml mieszanki do trawienia.
UWAGA: Na tym etapie można pobrać krew zarodkową.- Natychmiast po przecięciu naczyń pępowinowych i witelinowych należy przenieść zarodek do 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 10 mM lodowatego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Odetnij zarodek za pomocą ostrych, drobnych nożyczek, starając się jak najbardziej ograniczyć widoczność tkanek. Inkubować na lodzie przez 10-15 minut i zebrać EDTA zawierającą krew.
- Usuń owodnię otaczającą zarodek.
- Dla etapów
- Odetnij głowę zarodka za pomocą kleszczy lub cienkich nożyczek. Przenieść głowę do 24-dołkowej płytki z 0,5 ml mieszanki do wytrawiania.
UWAGA: Neuroektoderma i mózg w późniejszych stadiach są dalej preparowane do analizy cytometrii przepływowej; Ostrożnie usuń otaczający splot naczyniowy. - Przetnij zarodek powyżej kończyny tylnej i usuń kończyny przednie.
- Aby wyizolować wątrobę, otwórz klatkę piersiową za pomocą pary cienkich kleszczy. Ściśnij z przodu serca i delikatnie pociągnij, używając drugich kleszczy, aby uwolnić narządy z ciała.
- Ostrożnie oddziel wątrobę płodu od serca i jelit. Przenieś wątrobę płodu na 24-dołkową płytkę z 0,5 ml mieszanki trawiącej. Uważnie monitoruj transfer pod mikroskopem preparacyjnym.
- Pobrać obszar ogona (lub jakąkolwiek inną część zarodka) w celu genotypowania za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
UWAGA: Inne tkanki i narządy mogą być pobierane z zarodków E10.5 w celu przeprowadzenia podobnej analizy przy użyciu cytometrii przepływowej. Krew, skóra głowy, obszar aorty-gonady-śródnercza (AGM), serce i neuroektoderma mogą być pobierane w E10.5. Na późniejszych etapach można również pobrać płuca, nerki, śledzionę i trzustkę. Szczegółowy opis rozbioru AGM na różnych etapach rozwoju został wcześniej opisany 14.
3. Przetwarzanie tkanek embrionalnych do cytometrii przepływowej
- Inkubować narządy (umieszczone w mieszance wytrawiającej) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Przenieść tkankę i roztwór enzymatyczny na sitko o wielkości 100 μm umieszczone na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej wypełnionej 6 ml buforu FACS (0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA w 1x PBS). Mechanicznie rozdzielić przez delikatne rozcieranie czarnym gumowym tłokiem strzykawki o pojemności 2 ml w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
UWAGA: Od tej pory wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze 4 °C. - Zebrać zawiesinę komórek za pomocą pipety Pasteura i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
- Wirować przez 7 minut w temperaturze 320 x g w temperaturze 4 °C. Supernatant należy odrzucić przez aspirację.
- Zawiesić osad w 60 μl buforu blokującego Fc (przeciwciało blokujące CD16/CD32 rozcieńczone 1/50 w buforze FACS).
- Przenieść 50 μl zawiesiny jednokomórkowej na studzienkę na płytkę wielodołkową z okrągłym dnem 96. Inkubować przez co najmniej 15 minut na lodzie.
UWAGA: Barwienie można również przeprowadzić w probówkach FACS z polistyrenu o pojemności 5 ml podczas pracy z niewielką liczbą próbek. - Pozostałe 10 μl należy przenieść do probówki FACS z polistyrenu o pojemności 5 ml, aby uzyskać pulę próbek z każdej tkanki. Pula ta będzie służyć jako kontrola (tj. próbki niebarwione i kontrole fluorescencyjne minus jeden (FMO) dla każdego fluorochromu). Przenieść 50 μl puli dla każdej fluorescencji minus jedna kontrola (FMO) (jedna na fluorochrom) do płytki wielodołkowej 96.
UWAGA: Każda kontrola FMO zawiera wszystkie przeciwciała sprzężone z fluorochromem z panelu przeciwciał, z wyjątkiem tego, który jest mierzony. FMO są używane do identyfikacji granic bramek i kontroli nakładania się widma w panelach wielokolorowych. Aby prawidłowo zająć się różnicami w tle i autofluorescencji między różnymi tkankami, ważne jest, aby przygotować te kontrole z puli próbek każdej tkanki. Odpowiednią kontrolą ekspresji YFP będą próbki z zarodków Cre-ujemnych, które są potwierdzone za pomocą genotypowania PCR.
- Przenieść 50 μl zawiesiny jednokomórkowej na studzienkę na płytkę wielodołkową z okrągłym dnem 96. Inkubować przez co najmniej 15 minut na lodzie.
4. Barwienie antygenu powierzchniowego
- Przygotować mieszaninę przeciwciał w buforze FACS (Tabela 2). Przygotować 50 μl mieszaniny przeciwciał na próbkę.
- Należy użyć następujących przeciwciał sprzężonych z fluorochromem: anty-CD45.2 (klon 104); anty-CD11b (klon M1/70); anty-F4/80 (klon BM8); anty-AA4.1 (klon AA4.1); anty-Kit (klon 2B8); i anty-Ter119 (klon Ter119).
- Przygotować sześć mieszanin przeciwciał do kontroli FMO w buforze FACS. Przygotować 50 μl mieszaniny przeciwciał na próbkę kontrolną.
UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał w mieszaninie przeciwciał jest dwa razy bardziej skoncentrowane niż końcowe stężenie wskazane w tabeli materiałów. Dla panelu z sześcioma przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przygotowuje się 6 kontroli FMO. Tabela 2 przedstawia skład mieszaniny przeciwciał i kontroli FMO dla jednej probówki.
| Objętość (μL) przeciwciała (Objętość końcowa: 50 μL) | ||||||||
| przeciwciało | klon | Mieszanka przeciwciał | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4/80 | FMO AA4.1 | Zestaw FMO | FMO Ter119 |
| anty-CD45.2 | Rozdział 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| anty-CD11b | Zobacz materiał M1/70 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| anty-F4/80 | Zobacz materiał BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| anty-AA4.1 | Klasa AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| anty-Kit | Pozycja 2B8 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 |
| anty-Ter119 | Dzielnica ter119 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 |
| Bufor FACS | 45,5 | 46,5 | Rozdział 46 | 46,5 | 46,5 | Rozdział 46 | Rozdział 46 | |
Tabela 2: Objętość przeciwciał używanych do barwienia i kontroli fluorescencyjnej minus jeden (FMO). Objętość (μl) przeciwciała wymagana do uzyskania końcowej objętości 50 μl.
- Dodać 50 μl mieszaniny przeciwciał do próbek na 96-dołkowej płytce (końcowa objętość podczas barwienia wynosi 100 μl). Delikatnie pipetować w górę i w dół dwa razy i inkubować na lodzie przez 30 minut.
- Wirować 96-dołkową płytkę przez 7 minut w temperaturze 320 x g w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant. Zawiesić w 200 μl buforu FACS.
- Powtórzyć procedurę mycia (krok 4.3) dwukrotnie przy użyciu 150 μl buforu FACS.
- Przefiltrować próbki i próbki kontrolne (FMO i niebarwione próbki basenowe) do probówek z polistyrenu o pojemności 5 ml przez sitko o średnicy 70 μm. Przechowywać na lodzie do momentu nabycia.
5. Identyfikacja EMP i makrofagów pochodzących z YS za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany przy użyciu 4-laserowego cytometru przepływowego wyposażonego w fioletowy laser 405 nm, niebieski laser 488 nm, żółty laser 562 nm i czerwony laser 638 nm.
- Przygotuj kulki kompensacyjne dla każdego sprzężonego przeciwciała zgodnie z instrukcjami producenta. Używaj niebarwionych próbek i koralików kompensacyjnych, aby zoptymalizować intensywność lasera.
- Aby zidentyfikować granice bramek, użyj kontroli FMO (fluorescencja minus jeden) dla każdego przeciwciała.
- W celu wykluczenia martwych komórek należy dodać 1 μl DAPI (1 mg/ml) do probówki (zawierającej 200 μl zawiesiny barwionych komórek) 1 minutę przed pobraniem. Użyj silnego sygnału DAPI i parametru rozpraszania w przód (FSC), aby wykluczyć martwe komórki i zanieczyszczenia.
UWAGA: Użyj oprogramowania z cytometru przepływowego, aby narysować bramki podczas akwizycji. Matrycę kompensacyjną i analizę można przeprowadzić po pobraniu próbki za pomocą innego dostępnego na rynku oprogramowania. - Użyj rozproszenia do przodu i z boku (FSC vs SSC), aby przeprowadzić dyskryminację komórek na żywo i dubletów na podstawie wszystkich zdarzeń.
- Utwórz fluorescencyjne wykresy punktowe na osi logarytmicznej skali i narysuj bramki potomne, aby najpierw wykluczyć erytrocyty (Ter119 +), a następnie zidentyfikować komórki progenitorowe (Kit +) i komórki hematopoetyczne (CD45 + Kitneg) (patrz rysunek 1).
- Utwórz histogramy fluorescencyjne, aby określić ilościowo skuteczność znakowania YFP wśród różnych zidentyfikowanych populacji w YS (ryc. 2), wątrobie płodu (ryc. 3) i mózgu (ryc. 4).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mapowanie losów genetycznych osiągnięto poprzez podanie OH-TAM w dniu E8.5 samicom Csf1r-Mer-iCre-Mer skrzyżowanym z samcami niosącymi reporter Rosa26-LSL-eYFP. W obecności OH-TAM wycięcie kasety stop prowadzi do stałej ekspresji YFP w komórkach wykazujących ekspresję Csf1r. Pobrano dwie tkanki krwiotwórcze: worek żółtkowy i wątrobę płodową oraz tkankę niekrwiotwórczą, neuroektodermę, z embrionów w dniu E10.5. Zawiesiny pojedynczych komórek uzyskano poprzez dysocjację enzymatyczn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Różne fale hematopoetycznych komórek prekursorowych częściowo nakładają się na siebie w krótkim czasie, co sprawia, że analiza udziału każdej fali rozwojowej hematopoezy do komórek odpornościowych jest technicznie bardzo trudna.
Systemy Cre indukowane tamoksyfenem dają możliwość znakowania określonych komórek w sposób indukowany czasowo oraz przeprowadzania analizy linii produkcyjnej na zarodkach lub osobach dorosłych, bez konieczności hodowli ex vivo lub in vitro lub przeszc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują prof. Fredericowi Geissmannowi i prof. Christianowi Schulzowi za wnikliwe dyskusje; dr Hannah Garner za krytyczną lekturę manuskryptu, dr Xavierowi Montagutelliemu i dr Jeanowi Jaubertowi oraz personelowi ośrodka dla zwierząt Instytutu Pasteura za wsparcie w hodowli myszy; oraz Pascalowi Dardenne i Vytaute Boreikaite, stypendystce Amgen, za ich pomoc techniczną. Badania w laboratorium E.G.P. są finansowane przez Instytut Pasteura, CNRS, Cercle FSER (FRM) oraz pakiet startowy z Instytutu Pasteura i konsorcjum REVIVE. L.I. jest wspierany przez stypendium doktoranckie konsorcjum REVIVE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #5 Kleszcze proste | Narzędzia do nauki | 11251-20 | |
| MC19/B Nożyczki sprężynowe Pascheff-Wolff | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| Nożyczki proste 8,5 cm | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (klon 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | rozcieńczenie 1/200 w FACs Bufor |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (klon 104) | Sony | 1149120 | rozcieńczenie 1/100 w FAC Bufor |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, klon AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | Rozcieńczenie 1/100 w FAC Bufor |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (klon Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 rozcieńczenie w FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (klon BM8) | BD Pharmingen | 123137 | rozcieńczenie 1/100 w FAC Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (klon M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 rozcieńczenie w FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (mysi blok BD Fc, klon 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Kolagenaza D | Roche | 11088882001 | |
| Deoksyrybonukleaza I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 dołków Dolna kultura tkankowa w kształcie litery U płyta | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Strzykawka Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Siatka nylonowa 100 µ m sitka do komórek | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Siatka nylonowa 70 µ m sitka komórkowe | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Probówki Falcon | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Zestaw do filtracji miliporowej, 0,2 μ m | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROKSYTAMOKSYFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | zachować szczególną ostrożność podczas przygotowywania i pracy z tamoksyfenem i jego pochodnymi. Zawsze używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej |
| Progesteron | Sigma | P3972 | Zawsze używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej |
| PEG-35 olej rycynowy (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Olej słonecznikowy | Sigma | S5007-250ML | |
| Etanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Zawsze używaj odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej i używaj pod wpływem oparów |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML W WODZIE) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 cytometr przepływowy | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| Zestaw kulek wychwytujących przeciwciała VersaComp (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | Laboratorium Jacksona | 19098 | |
| B6.129X1-GT(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | Laboratorium Jacksona | 6148 |
Bibliografia
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
