Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55306

⸱

8 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Biological Research Facility, The Francis Crick Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie wymazów z miski olejowej i analizy osadu w systemach danio pręgowanego, co prowadzi do zwiększenia wykrywalności w porównaniu do samego użycia wartowników do wykrywania patogenów, takich jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa. Zaproponowano również system monitorowania jaj P. tomentosa w kwarantannie.

Streszczenie

Systemy monitorowania zdrowia są rozwijane i używane w ośrodkach badawczych nad danio pręgowanymi, ponieważ patogeny Danio rerio, takie jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa mogą potencjalnie zaszkodzić dobrostanowi zwierząt i badaniom naukowym. Ryby są zwykle analizowane post mortem w celu wykrycia drobnoustrojów. Wykorzystanie wskaźników wybiórczych jest sugerowanym sposobem poprawy czułości nadzoru i zmniejszenia liczby zwierząt do pobrania. Opisano ustawienie zbiornika wskaźnikowego filtracji wstępnej z systemu recyrkulacji. Technika ta została opracowana w celu zapobiegania zanieczyszczeniu wody i reprezentowania populacji ryb poprzez staranny dobór wieku, płci i szczepów. W celu wykorzystania jak najmniejszej liczby zwierząt szczegółowo opisano również techniki monitorowania środowiska. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) na wymazach z miski olejowej jest stosowana w celu znacznej poprawy wykrywania niektórych rozpowszechnionych i chorobotwórczych gatunków prątków, takich jak Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilum i Mycobacterium chelonae. Inna metoda środowiskowa polega na przetwarzaniu osadu na dnie zbiornika retencyjnego lub studzienki w poszukiwaniu jaj P. tomentosa. Jest to tania i szybka technika, którą można zastosować w kwarantannie, gdzie urządzenie hodowlane jest zanurzone w zbiorniku hodowlanym importowanych zwierząt. Na koniec do próbki osadu nakłada się PCR i wykrywa A. hydrophila na dnie i powierzchni studzienki. Ogólnie rzecz biorąc, te środowiskowe techniki przesiewowe zastosowane do tych konkretnych patogenów doprowadziły do zwiększonej czułości w porównaniu z testowaniem wskaźników wstępnej filtracji.

Wprowadzenie

W celu ochrony badań i dobrostanu zwierząt1,2, obecność patogenów jest monitorowana w obiektach dla zwierząt. W przypadku danio pręgowanego, monitorowanie zdrowia3,4,5,6,7,8,9,10,11 często opiera się na zwierzętach analizowanych pośmiertnie za pomocą histopatologii, hodowli bakteriologicznej lub metod molekularnych. Badanie wyłącznie zwierząt z kolonii nie jest zalecaną metodą ze względu na liczbę ryb i związane z tym wydatki, które byłyby wymagane do wykrycia patogenów o niskiej częstości występowania. Dlatego preferowaną metodą jest narażenie niewielkiej grupy zwierząt na większe obciążenie zanieczyszczeniami. Ryby te nazywane są strażnikami przed filtracją. To narażenie trwa miesiącami i wiąże się ze zwiększonym obciążeniem pracą opiekuna zwierząt i/lub jakimś specjalnie opracowanym rozwiązaniem inżynieryjnym. Kolejnym wyzwaniem jest kontrola importowanych linii w kwarantannie, w której płodne zwierzęta mają być utrzymywane przy życiu, co nie jest zgodne z rutynowymi badaniami tusz.

Opisujemy tutaj kilka metod wykrywania niektórych patogenów danio pręgowanego (A. hydrophila, Mycobacterium spp. i P. tomentosa) poprzez badanie środowiska wodnego. Celem jest zmniejszenie liczby ryb wykorzystywanych do monitorowania stanu zdrowia oraz optymalizacja obrotu, kosztów i czułości wykrywania. Takie metody stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt, a niektóre techniki można zastosować do kontroli importu w kwarantannie. Na przykład Mocho9 był w stanie zidentyfikować więcej patogennych gatunków prątków, wykonując PCR na wymazach z miski olejowej, a nie na danio pręgowanych (w tym wskaźnikowych), i uzyskano to przy mniejszej liczbie próbek. W tym samym badaniu jaja P. tomentosa wykryto z większą czułością poprzez badanie przesiewowe osadu w zbiorniku za pomocą flotacji i mikroskopii, a nie badanie ryb za pomocą PCR i histopatologii.

Tabela 1 podsumowuje różne cechy programów sentinel3,4,5,6,7,8,9,10 używany przez szereg obiektów dla danio pręgowanego. Strażnicy po filtracji otrzymują wodę w taki sam sposób, jak każda ryba kolonijna, podczas gdy strażnicy przed filtracją otrzymują wodę, gdy najpierw przepłynie ona przez akwarium kolonijne. Na przykład w systemie recyrkulacyjnym można ustawić wartowniki filtracji wstępnej, które w sposób ciągły odbierają wodę z miski olejowej. Może to nie być możliwe, gdy w jednym pomieszczeniu znajduje się wiele niezależnych systemów. W takim przypadku jeden zbiornik strażników filtracji wstępnej może być wykorzystany do przesiewania całego pomieszczenia. Strażnicy znajdują się w zbiorniku statycznym, poza systemem recyrkulacyjnym, a ich woda jest regularnie wymieniana, przy użyciu wyłącznie wody z filtracji wstępnej, tj. wody ze studzienki ze wszystkich systemów w pomieszczeniu. Technika ta została opisana poniżej jako punkt odniesienia do porównania ze skutecznością badań przesiewowych w warunkach środowiskowych. Proponowana konfiguracja ma na celu kontrolę problemów z jakością wody, takich jak spadek pH lub zanieczyszczenie azotem.

Koncepcja badania środowiska bakteryjnego opiera się na hipotezie, że bakterie są wykrywalne w biofilmie, takim jak ten znajdujący się na ścianie studzienki na powierzchni wody lub w szlamie na dnie zbiornika. Studzienka wydaje się idealnym punktem pobierania próbek w recyrkulacyjnym systemie akwakultury, ponieważ zbiera odpady (wodę, kał, paszę i inny materiał organiczny) ze wszystkich zbiorników przed filtracją. Powierzchnia studzienki jest często łatwo dostępna, pobieranie wymazu jest szybkie i można je wykonywać aseptycznie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbki (na przykład w rękawiczkach). Koncepcja ta jest używana do identyfikacji rozpowszechnionych chorobotwórczych Mycobacterium spp. w systemach danio pręgowanego9,12. Technika jest opisana poniżej, a my również informujemy o wykryciu A. hydrophila w wymazach z powierzchni studzienek danio pręgowanego i szlamie.

Środowiskowe badanie przesiewowe na obecność jaj pasożytów opiera się na detekcji przeprowadzonej przez Murraya i wsp.13 a technika flotacji jest rutynowo stosowana do parazytologii i mikroskopijnych badań przesiewowych jaj pasożytów w kale14. Mocho9 zaproponował alternatywę dla procesu pobierania próbek i pokazał, że technika ta może być wykorzystana do wykrywania innych gatunków biotopu ryb. Zakażone D. rerio przepuszczają jaja P. tomentosa wraz z kałem, a jaja pasożyta pozostają na dnie zbiornika, w szlamie. Można je tam zbierać, ponieważ ich gęstość jest większa niż wody. Gęstość jaj jest również wykorzystywana do przetwarzania próbki środowiskowej. Pierwsza flotacja z odwirowaniem oddziela wodę i lekkie zanieczyszczenia od cięższej materii. Drugie wirowanie opiera się na nasyconym roztworze cukru (o gęstości większej niż gęstość jaj P. tomentosa), aby umożliwić pojawienie się jaj pasożyta na powierzchni probówki.

Badanie przesiewowe na obecność bakterii w biofilmie i na obecność P. tomentosa z dna zbiornika można połączyć poprzez wykonanie PCR dla wszystkich tych patogenów na osadzie próbki osadu uzyskanej po pierwszym odwirowaniu. Optymalizuje to czas próbkowania. Metoda jest opisana poniżej. Proponujemy również stosowanie tych technik w kontekście kwarantanny. Aby przesiać importowane dorosłe rybo danio pręgowanego, które muszą być utrzymywane przy życiu, do zbiornika kwarantanny umieszcza się urządzenie hodowlane. Po tygodniu kał i inne odpady w urządzeniu hodowlanym są zbierane i badane pod kątem mikroskopii lub PCR. Technika jest opisana poniżej i w tym kontekście niektóre jaja P. tomentosa zostały wykryte za pomocą mikroskopii.

Protokół

1. Ekspozycja strażników filtracji wstępnej z systemu recyrkulacyjnego

  1. Wyjmij czysty zbiornik o pojemności 8 l z systemu recyrkulacji. Napełnij go wodą pochodzącą ze studzienek. Dodaj 2 ceramiczne kulki lub kostki gąbki z biopożywkami z systemów do przesiewania (Rysunek 1). Dodać 1 - 2 D. rerio/L (tj. 12 ryb). W obiekcie należy używać ryb typu dzikiego o dominującym tle genetycznym, na przykład AB.
    1. Wybierz co najmniej 6 ryb w następujący sposób: co najmniej jedną samicę i jednego samca w wieku poniżej 6 miesięcy, jedną samicę i jednego samca w wieku od 6 do 18 miesięcy oraz jedną samicę i jednego samca w wieku powyżej 18 miesięcy.
  2. Karm raz dziennie. Zmieniaj diety (np. sucha dieta, krewetki solankowe), aby upewnić się, że wartowniki są narażone na wszystkie diety stosowane w obiekcie dla danio pręgowanego. Zmieniaj wodę w poniedziałki, środy i piątki, tj. trzy razy w tygodniu przez 4 miesiące.
    1. Aby przeprowadzić wymianę wody, przenieś wartowniki i biomedia do tymczasowego zbiornika. Całkowicie opróżnij zbiornik wartowniczy i wyczyść go. Napełnij zbiornik wartowniczy tylko wodą ze studzienki. Odłóż z powrotem strażników i biomedia.
  3. Wystaw wartowniki na 4 miesiące, aby zebrać wodę. Rybę należy poddać eutanazji za pomocą zatwierdzonej metody, takiej jak zanurzenie w roztworze 2-fenoksyetanolu (3 ml/l) roztworu dla przedawkowania.
  4. Aby potwierdzić zgon, odczekaj 10 minut po ustaniu ruchu wieczka.
    1. Chwycić zwłoki kleszczami i zamrozić je w całości w temperaturze -80 °C w oznaczonym pojemniku. Będzie to używane dla PCR12,15.
    2. Alternatywnie, odetnij ogon na szypułce ogonowej, nacinaj ścianę brzucha i ustaw w 4% formalinie.
      UWAGA: Do histopatologii używać rękawiczek i dygestoriów. Oznacz pojemnik na próbkę.

2. Wymazy z miski olejowej

  1. Użyj sterylnego suchego wacika z plastikowym trzonkiem. Nosić rękawice. Zlokalizuj powierzchnię do wymazu (ściana studzienki na powierzchni wody) i usuń wszelkie przedmioty uniemożliwiające łatwy dostęp do powierzchni. Wybierz powierzchnię studzienki o niskim przepływie.
  2. Wyjmij wacik, zdejmując opakowanie zewnętrzne i wystawij sterylną bawełnianą końcówkę na działanie powietrza. Unikaj zanieczyszczenia krzyżowego wacika, uważając, aby nie dotykać nieprzetestowanych powierzchni.
    1. Przetrzyj ścianę studzienki na głębokości 5 - 10 cm, aby wchłonąć wodę i biofilm na poziomie powierzchni studzienki.
    2. Schowaj wacik z powrotem lub wbij końcówkę do sterylnej probówki wirówkowej. Oznaczyć próbkę i wysłać do testu PCR lub zamrozić w temperaturze -80 °C.

3. Wykrywanie jaj P. tomentosa na dnie zbiornika

  1. Analiza osadu za pomocą mikroskopii
    1. Użyj strzykawki o pojemności 60 ml9, aby zassać szlam na dnie studzienki lub dowolnego zbiornika, w którym znajdują się ryby, w tym wartowniki. Podzielić próbkę na probówki o pojemności 15 ml. Zamknij rurki zakrętkami i oznacz rurki.
    2. Przygotować roztwór nasycony cukrem (ciężar właściwy = 1,27), mieszając 227 g cukru pudru w 177 ml gorącej wody za pomocą mieszadła magnetycznego14.
    3. Odwirować probówki o pojemności 15 ml przy 175 - 250 x g przez 10 minut w wirówce z odchylanymi wiadrami. Zdekantować probówki i zatrzymać osad w ich probówce.
    4. Napełnij probówki do połowy roztworem nasyconym cukrem. Zamknij probówki zakrętką i dokładnie wymieszaj osad z roztworem.
    5. Umieść probówki w obrotowych wiadrach wirówki i napełnij je roztworem nasyconym cukrem do góry. Delikatnie umieść jedną szklankę nakrywkową na wierzchu każdej probówki i w kontakcie z roztworem nasyconym cukrem.
    6. Wirować przy 175 - 250 x g przez 10 minut. Należy pamiętać, że niektóre szkła nakrywkowe mogą spaść i pęknąć podczas wirowania, dlatego na każde 60 ml próbki przypadają 4 probówki. Podnieś szklankę nakrywkową i umieść ją na szkiełku podstawowym. Oznacz slajd ołówkiem lub markerem.
      1. W przypadku wystąpienia zbyt wielu pęknięć szkła nakrywkowego, napełnij większą część probówki roztworem nasyconym cukrem, odwiruj przy 175 - 250 x g przez 10 minut, napełnij do góry roztworem nasyconym cukrem, a następnie delikatnie ustaw szkło nakrywkowe. Poczekaj 30 minut.
    7. Poszukaj jaj P. tomentosa za pomocą mikroskopu13 (Rysunek 2 i Wideo 1). Zidentyfikuj wtyki bipolarne w powiększeniu 400X6.
      UWAGA: Rozmiar jaj to 57 - 78 μm długości i 27 - 39 μm średnicy16,17. Należy pamiętać, że wystarczy jeden dodatni preparat, aby próbka o objętości 60 ml została uznana za pozytywną.
  2. Badania przesiewowe przywożonych zwierząt poddanych kwarantannie na obecność jaj P. tomentosa
    1. Umieść samca i samicę D. rerio w zbiorniku. Dodaj do zbiornika urządzenie zwykle używane do zbierania i przechowywania ikry tarłowej, ale użyj go tutaj do zbierania kału (Rysunek 3).
      UWAGA: Na przykład pełny zbiornik hodowlany o pojemności 1 litra (zbiornik zewnętrzny i zbiornik wewnętrzny z kratowanym dnem) jest całkowicie zanurzony w zbiorniku o pojemności 13 litrów, co umożliwia rybom swobodny dostęp do wchodzenia i wychodzenia z urządzenia hodowlanego.
    2. Po tygodniu wyjąć urządzenie hodowlane i zebrać zebrany osad w urządzeniu hodowlanym zgodnie z opisem w kroku 3.1 "analiza osadu pod mikroskopem".

4. PCR na osad osadowy

  1. Odessać osad z dna zbiornika lub studzienki za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml9 i przenieść próbkę do probówki o pojemności 60 ml. Zamknij rurkę zakrętką i oznacz rurkę. Wyrzucić strzykawkę.
  2. Wstrząśnij probówką o pojemności 60 ml i przenieś 15 ml do probówki o pojemności 15 ml. Zamknij rurkę zakrętką i oznacz rurkę.
  3. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml przy 175 - 250 x g przez 10 minut w wirówce z odchylanymi wiadrami. Zdekantować probówki i utrzymać osad w probówce.
  4. Wyjmij wacik, zdejmując opakowanie zewnętrzne i wystawij sterylną bawełnianą końcówkę na działanie powietrza. Unikaj zanieczyszczenia krzyżowego wacika, uważając, aby nie dotykać nieprzetestowanych powierzchni.
    1. Wytrzyj osad w probówce przez 15 sekund.
    2. Schowaj wacik z powrotem lub wbij końcówkę do sterylnej probówki wirówkowej. Oznaczyć próbkę, zamrozić w temperaturze -80 °C i wysłać do testu PCR.
      UWAGA: W probówce o pojemności 60 ml pozostało 45 ml. Można je przechowywać w celu wykrycia jaj P. tomentosa za pomocą analizy osadu pod mikroskopem, jak opisano w kroku 3.1, na przykład w celu potwierdzenia wyniku PCR. Test PCR w osadzie można przeprowadzić w celu przeprowadzenia badań przesiewowych importowanych zwierząt zgodnie z krokiem 3.2.

Wyniki

Zalety stosowania wymazów z osadników w celu identyfikacji powszechnie występujących gatunków Mycobacterium sp. w porównaniu z próbkami ryb znajdują potwierdzenie w wynikach przedstawionych na Rysunku 4. Spośród 115 przebadanych ryb, M. chelonae i M. haemophilum wykryto odpowiednio w 5% i 3% próbek. Nie zidentyfikowano żadnych innych patogennych gatunków prątków. Z tych samych systemów pobrano 49 wymazów z osadników, które ujawniły obecność 5 gatunków prątków. Iloraz szans obliczono przy założeniu hipotezy, że M. chelonae i M. fortuitum są częściej wykrywane metodą PCR w wymazach z powierzchni osadników niż w próbkach ryb. Wynik ten jest istotny statystycznie, z odpowiednimi wartościami ilorazu szans wynoszącymi 11 (95% CI: 4 do 29; p <0,0001) oraz 306 (95% CI: 18 do 5208; p = 0,0001). Wyniki pokazują, że technika wymazów z powierzchni osadników stanowi wartościową alternatywę dla wyłącznego stosowania zwierząt sentinelnych w celu przesiewowego badania zaplecza dla danio pręgowanych pod kątem Mycobacterium spp. Próbki środowiskowe wykorzystano również do wykrywania A. hydrophila. Bakterie te zidentyfikowano w rybach, osadach oraz próbkach powierzchniowych (Rysunek 4). Potwierdza to ponadto skuteczność proponowanych technik w badaniu biotopu ryb.

W odniesieniu do analizy osadów w celu wykrycia jaj P. tomentosa, Mocho9 wykrył pasożyta metodami PCR i histopatologii w 27% próbek ryb, podczas gdy jaja stwierdzono w 93% analizowanych osadów z tego samego systemu. W niniejszej pracy technikę tę przetestowano pod kątem odzwierciedlenia przesiewowej kontroli kwarantannowej. W tym kontekście nie można pobierać próbek z importowanych zwierząt, a szybka ocena ich stanu zdrowia wspomaga zarządzanie biosecurity. Ryby o nieznanym stanie zdrowia z placówki z dodatnim wynikiem na P. tomentosa umieszczono w 8 zbiornikach z urządzeniami do rozrodu: maksymalnie 16 ryb na zbiornik o pojemności 13 L, z 7 linii transgenicznych i 1 linii typu dzikiego, obu płci, w wieku od 4 do 24 miesięcy. Osady zebrano z urządzeń po jednym tygodniu i przeanalizowano mikroskopowo. Jaja P. tomentosa zaobserwowano w 7 (88%) próbach. Na koniec przetestowano detekcję PCR pasożyta w wymazach z sumpa oraz w osadach. 4 z 6 próbek osadu uzyskały wynik dodatni w teście PCR, natomiast wszystkie wyniki z wymazów powierzchniowych były ujemne. Nie jest to zaskakujące, ponieważ przesiewowe badanie osadów opiera się na zdolności jaj do opadania na dno zbiornika. Wykazuje to, że techniki analizy osadów mogą być stosowane do badania akwariów z D. rerio pod kątem infekcji P. tomentosa oraz że metody te można dostosować do kontroli importowanych zwierząt.

Zebry w akwarium do eksperymentu biologicznego; ustawienie badania behawioralnego, metoda badań wodnych.
Rysunek 1: Zbiornik strażniczy do wstępnej filtracji poza systemem recyrkulacyjnym. Zbiornik o pojemności 8 L jest napełniany wodą oraz bio-medią z sumpów systemów w celu przesiewania. Dwie białe ceramiczne kulki bio-medii znajdują się na dnie zbiornika (na środku zdjęcia). Wybieranych jest 12 ryb zgodnie z ich wiekiem, szczepem i płcią, a następnie są one przenoszone do zbiornika strażniczego. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Obraz mikroskopowy jaja Ascaris; podkreśla anatomię i cechy morfologiczne pasożyta.
Rysunek 2: Jajo P. tomentosa wykryte podczas analizy osadów za pomocą mikroskopii. Zastosowane powiększenie wynosiło 400X. Strzałki wskazują korki bipolarne. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zebry w zbiorniku laboratoryjnym, wykorzystywane do badań genetycznych, przesiewania leków i badań rozwojowych.
Rysunek 3: Urządzenie hodowlane zanurzone w zbiorniku dla ryb w celu zbierania osadu do analizy. Zbiornik ten został ustawiony na stole laboratoryjnym na potrzeby zdjęcia; w systemie recyrkulacyjnym jest on rozmieszczony w inny sposób. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy wyników PCR przedstawiający procent pozytywnych wyników dla różnych powierzchni bakteryjnych i próbek.
Rysunek 4: Procent identyfikacji Mycobacterium spp., A. hydrophila oraz P. tomentosa metodą PCR w rybach, wymazach z powierzchni sumpa oraz osadzie z sumpa. Procent uzyskano poprzez podzielenie liczby wyników pozytywnych dla każdego gatunku patogenu przez liczbę badanych próbek. Procent wyników pozytywnych podano w zależności od rodzaju próbki jako FISH (ryby), SURFACE (powierzchnia) lub SLUDGE (osad), co zaznaczono po nazwie bakterii. Pod kątem identyfikacji Mycobacterium spp. metodą PCR przebadano 115 ryb i 49 wymazów z powierzchni sumpa. Dane zestawiono z wynikami Mocho9, ponieważ niniejsza praca stanowi rozszerzenie tamtego badania. Ryby to głównie zwierzęta wskaźnikowe z etapu przedfiltracji, zgodnie z sekcją 1 protokołu. Rzadko, w przypadku braku zwierząt wskaźnikowych, pobierano próbki od osobników, które uciekły z innych zbiorników, oraz od starszych ryb z kolonii (>18 miesięcy). Wszystkie systemy testowane pod kątem Mycobacterium spp. badano w rybach i wymazach z sumpa. Ilorazy szans obliczono przy założeniu hipotezy, że M. chelonae i M. fortuitum są wykrywane metodą PCR częściej w wymazach z powierzchni sumpa niż w próbkach z ryb. Jest to statystycznie istotne przy odpowiednich ilorazach szans wynoszących 11 (95% CI: 4 do 29; p <0.0001) i 306 (95% CI: 18 do 5208; p = 0.0001). Wyniki PCR dla Mycobacterium marinum były negatywne dla wszystkich próbek, w związku z czym uznano ten gatunek za nieobecny w badanych obiektach i nie uwzględniono go w analizie. Pod kątem obecności A. hydrophila metodą PCR przebadano 12 ryb, 14 wymazów z powierzchni sumpa i 6 próbek osadu z sumpa. Pod kątem obecności P. tomentosa przebadano 6 sumpów na powierzchni i w osadzie. PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy. CI = przedział ufności. * i ** oznaczają istotność statystyczną; pozostałe porównania nie były istotne statystycznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy, równowaga statyczna; mikroorganizmy, analiza komórkowa, badania biologiczne.
Wideo 1: Poszukiwanie jaja P. tomentosa za pomocą mikroskopu. Preparat uzyskano z analizy osadu, zgodnie z opisem w kroku 3.1. Pole widzenia jest skanowane w celu wykrycia jaja P. tomentosa. Po rozpoznaniu struktury zwiększa się powiększenie, aby potwierdzić identyfikację przy wyższej rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

AutorzyWiek w momencie rozpoczęcia ekspozycjiCzas trwania ekspozycjiWiek podczas pobierania próbekPrzed lub po
filtracją		PłećSzczep(y)
Barton et al.34 miesiące6 miesięcy10 miesięcyPrzed filtracjąN/DN/D
Borges et al.46 miesięcy6 miesięcy12 miesięcyPrzed filtracjąN/DAB wild type
Collymore et al.5Tak młode, jak to możliwe3 miesiące<6 miesięcyPrzed filtracjąN/DN/D
Geisler et al.64 miesiące4 miesiące8 miesięcyPrzed i po
filtracją		N/DAB wild type
Liu et al.73 miesiące1-6 miesięcy4-9 miesięcyPrzed i po
filtracją		N/DWild type
Martins et al.83 miesiące3 miesiące6 miesięcyPrzed filtracjąN/DWild type
Mocho9<6 miesięcy,
6 - 12 miesięcy,
>18 miesięcy		4 miesiące7 - 24 miesiącePrzed filtracją1 samica i
1 samiec z
każdej grupy wiekowej		AB wild type
Murray et al.103-4 miesiące3 miesiące, 6 miesięcy, 1 rok7, 10 i 16
miesięcy		Przed i po
filtracją		N/DAB wild type

Tabela 1: Porównanie ustawień ryb sentinelnych w zapleczach dla danio pręgowanego. Ryby sentinelne mogą być dobierane ze względu na wiek, płeć lub szczep. Są one eksponowane przez określony czas i otrzymują wodę przed lub po systemie filtracji. Dane zostały zestawione z wydania specjalnego czasopisma Zebrafish z 2016 roku dotyczącego zdrowia ryb3,4,5,6,7,8,9,10.

Dyskusja

Ograniczenia technik, kroków krytycznych i rozwiązywania problemów:

Wiek, płeć, szczep i czas ekspozycji wartowników nie są znormalizowane. Przedstawiono to w tabeli 1. Badania przesiewowe ryb w wieku poniżej 6 miesięcy lub ryb w wieku poniżej 6 miesięcy są bardzo ograniczone. Mogą istnieć pewne patogeny, które wpływają na młode ryby, ponieważ istnieją pewne patogeny, które są bardziej rozpowszechnione w starszej populacji 10,18,19,20. Podobnie, płeć nie jest brana pod uwagę przy doborze niektórych grup wskaźnikowych, mimo że niektóre doniesienia wskazują na uprzedzenia ze względu na płeć w przypadku niektórych patogenów21. Proponowana technika ma na celu rozwiązanie tych problemów, chociaż wybór szczepu może być dokonany w zależności od konkretnego patogenu, który ma być monitorowany. Na przykład TU może pomóc w wykrywaniu Mycobacterium spp.12,22, ale istnieje ryzyko, że wartowniki będą wtedy działać jako rezerwuar lub wykazywać objawy kliniczne. Jeśli chodzi o długość ekspozycji, podejście Międzynarodowego Centrum Zasobów Danio Pręgowanego10 zwiększa szanse na wykrycie patogenów, które mogłyby zostać pominięte przy nieodpowiednim okresie zanieczyszczenia. Konieczność długotrwałego narażenia oznacza, że wartowniki nie są łatwo dostępne. Dodanie próbek środowiskowych pozwala na pewną elastyczność i zwielokrotnienie zdarzeń przesiewowych. Na przykład pobieranie próbek może odbywać się co drugi miesiąc w odstępach 4 miesięcy między każdą metodą przesiewową. Może to skrócić czas, jaki upływa przed wykryciem nowo wprowadzonego patogenu.

Techniki badań przesiewowych w środowisku polegają na wykrywaniu patogenów w środowisku. Patogeny są wydalane przez ryby, a zatem rozcieńczane w wodzie systemowej. Nie zbadano możliwości wychwytywania patogenów za pomocą filtracji wodnej23 . Metody, które opisujemy, są skuteczne tylko wtedy, gdy patogeny mają wystarczająco dużo czasu na namnażanie się w rybach i biofilmie, aby osiągnąć próg zanieczyszczenia umożliwiający wykrycie. To ograniczenie technik jest zminimalizowane przez krytyczny wybór miejsc pobierania próbek: próbki pobiera się z osadu w zbiorniku, a nie z osadu ze studzienki, a próbki wody i biofilmu pobiera się na powierzchni studzienki, a nie w zbiorniku lub po filtracji. Niemniej jednak jest mało prawdopodobne, aby wszystkie próbki z tego samego systemu dały takie same wyniki. Pozytywne wyniki dla P. tomentosa można potwierdzić za pomocą innego testu (histopatologia, PCR lub analiza osadu). Dodatnie wyniki Mycobacterial PCR można potwierdzić za pomocą posiewu lub innego laboratorium diagnostycznego. Jednak przy ustalaniu statusu zdrowotnego zaleca się pobranie dodatkowych próbek w celu potwierdzenia negatywnych wyników wszelkich technik badań przesiewowych w warunkach środowiskowych.

Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod:

Mycobacterium spp. są pospolite w środowisku, a ich obecność w studzience nie pozwala na przesądzenie o ich chorobotwórczości12. Mocho9 wykazał, że monitorowanie wskaźników śmiertelności jest kluczem do badania rozwoju problemów zdrowotnych. Wykorzystanie próbek zwierzęcych pozostaje niezbędne we wszelkich dochodzeniach weterynaryjnych. Monitorowanie stanu zdrowia oznacza wykrywanie wszystkich patogenów rozpowszechnionych w obiekcie, a tego nie można osiągnąć wyłącznie przy użyciu technik badań przesiewowych w środowisku. Niemniej jednak brak czułości narzędzi diagnostycznych może opóźnić lub uniemożliwić dokładny opis stanu zdrowia. Podczas gdy wykorzystanie wskaźników wykrywających zmniejsza liczbę ryb potrzebnych do wykrycia drobnoustroju występującego w populacji, brak czułości zwiększa wagę stosowania kombinacji metod, w tym badań przesiewowychw środowisku 5,23. Rzeczywiście, status wolnego od specyficznego czynnika chorobotwórczego jest zwykle definiowany jako brak gatunku w obiekcie, w związku z czym próbki środowiskowe i zwierzęce muszą być ujemne24,25.

Wyniki wymazu z miski olejowej w celu identyfikacji Mycobacterium spp. pokazują, że poleganie na próbkach ryb może prowadzić do fałszywie ujemnego stanu zdrowia. 6 badanych gatunków prątków jest opisanych jako chorobotwórcze lub potencjalnie chorobotwórcze u danio pręgowanego15 , a niektóre z nich nie zostałyby wyeliminowane przez dezynfekcję powierzchni jaj chlorem26 , jak rutynowo przeprowadza się w kwarantannie. W związku z tym wynik fałszywie ujemny może mieć pewne konsekwencje dla współpracowników, którzy importują wiersze. Na przykład M. fortuitum został pominięty przez PCR na próbce ryb, ale wykryła go ponad połowa PCR z wymazu z miski olejowej. Biorąc pod uwagę, że prątki te są bardziej odporne na chlor niż inne i ich zdolność do rozwoju w systemach wodnych27, stanowi to ryzyko dla nieskażonego zakładu importującego. Aby zezwolić na importowanie linii, menedżerowie muszą ufać raportom o kondycji zakładu eksportującego i porównywać je ze swoimi. Program oceny działania ICLAS28 ma kluczowe znaczenie dla tego procesu u gryzoni. Sieć RESAMA informuje o wykryciu M. gordonae i M. mucogenicum u francuskiego D. rerio11. Te prątki nie są proponowane w panelach komercyjnych laboratoriów, z których korzystamy. Przydatne byłoby rozszerzenie programu ICLAS i ujednolicenie testów diagnostycznych, jak również wykazu gatunków chorobotwórczych29.

A. hydrophila jest również patogenem, który może zostać wprowadzony podczas importu zwierząt, chociaż jego podatność na chlor30 sprawia, że jego eliminacja jest bardziej prawdopodobna podczas rutynowej dezynfekcji powierzchni jaj. Wyniki studzienki, wymazu i osadu pokazują, że do wykrycia tego patogenu można zastosować badania przesiewowe w środowisku. Inne bakterie, takie jak Mycobacterium spp., zostały wykryte w osadzie za pomocą PCR23. Ten rodzaj próbki jest szczególnie istotny, ponieważ umożliwia wykrycie wydalanych patogenów. Na przykład innym nowym zastosowaniem jest analiza osadu w celu przesiewania importowanych ryb objętych kwarantanną na obecność P. tomentosa. Pasożyt stanowi zagrożenie dla zdrowia zwierząt13 i modele neoplazji16. Ponadto stężenia chloru stosowane w rutynowej dezynfekcji powierzchni ikry danio pręgowanego nie są skuteczne31. W związku z tym możliwość badania przesiewowego importowanych zwierząt z tygodniową rotacją i bez eutanazji ryb wydaje się bardzo atrakcyjna. Technika ta może wpłynąć na zasady kwarantanny i bioasekuracji, umożliwiając klasyfikację importowanych towarów. Następnie opracowuje się proces decyzyjny w zależności od czynników chorobotwórczych występujących w zakładzie wywozu, wykrytych czynników chorobotwórczych w próbkach pochodzących z przywożonych ryb oraz ryzyka pogorszenia statusu zdrowotnego zakładu przywozu10.

Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tych technik:

Nawet jeśli wybraną opcją jest rutynowe leczenie kwarantanną, skuteczność takiego leku 32,33,34,35,36 można ocenić za pomocą analizy osadu za pomocą urządzenia hodowlanego. Mówiąc bardziej ogólnie, badania przesiewowe w środowisku mogą być wykorzystywane do testowania związków przeciwko bakteriom i zwalczaniu pasożytów, w tym w biotopie ryb. Innym niszowym zastosowaniem badań przesiewowych w środowisku jest monitorowanie populacji patogenów w paszy na żywo 37,38. Chociaż głównym zastosowaniem tych technik jest cenne uzupełnienie zestawu narzędzi diagnostycznych do monitorowania stanu zdrowia w obiektach danio pręgowanego. Dzięki dokładniejszemu, oszczędniejszemu i bardziej efektywnemu kosztowo i czasowo określeniu stanu zdrowia, wymazy z studzienki ściekowej i analiza osadu stanowią uzupełnienie nadzoru wartowniczego i rutynowej praktyki kwarantanny. Rzeczywiście, przyszłość tych technik ma być rutynową częścią każdego raportu o stanie zdrowia w laboratorium wodnym.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować zespołowi BRF Aquatics z Francis Crick Institute za ich pomoc techniczną i krytyczny wkład. Prace te były wspierane przez Francis Crick Institute, który otrzymuje podstawowe fundusze od Cancer Research UK (FC001999), UK Medical Research Council (FC001999) i Wellcome Trust (FC001999).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aqua-Sed 250 mlVetark2-fenoksyetanol
Rurka sterylna sucha końcówka wacikaMW100Powierzchnia miski olejowej
BD Plastipak Jednorazowa strzykawka 50 ml EkscentrycznaBecton
Dickinson		300866W rzeczywistości są
z podziałką do 60 ml
Probówka wirówkowa 15 ml CorningCorning 430766
Wirówka stołowa Centaur 2 z 4 x 200 ml Swing– Zewnętrzny wirnik (nieuszczelniony)SanyoMSB020. CX1.5
Szkło osłonowe 22 mm x22 mmMenzel-GlaserMNJ-350-020H
Zwykły wacik Sterylny plastikowy aplikator Białe nasadki ze sztucznego jedwabiuSterilin Ltd Thermo Fisher ScientificF155CAWymaz z osadu
50 ml Wolnostojąca probówka wirówkowa CentriStar CapCorning430921
Zestaw tacek tarłowych w zbiornikuMBK Installations Ltd

Bibliografia

  1. Schroeder, P., Mocho, J. P. A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare. Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).
  2. Mason, T., et al. Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility. Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).
  3. Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).
  4. Borges, A. C., et al. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).
  5. Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).
  6. Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).
  7. Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories. Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).
  8. Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research. Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).
  9. Mocho, J. -P. Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).
  10. Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).
  11. Legendre, L., et al. RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).
  12. Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).
  13. Murray, K. N., Peterson, T. S. Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish. J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).
  14. Foreyt, W. J. Veterinary Parasitology Reference Manual. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).
  15. Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R. Mycobacteriosis in zebrafish colonies. ILAR J. 53 (2), 95-105 (2012).
  16. Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies. Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).
  17. Moravec, F. Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873). Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).
  18. Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction. Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).
  19. Watral, V., Kent, M. L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).
  20. Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities. FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).
  21. Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan). J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).
  22. Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).
  23. Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).
  24. Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).
  25. Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).
  26. Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).
  27. Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).
  28. Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. First trial in the developmental phase of the "performance evaluation program" based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS. Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).
  29. Nogueira, C. L., et al. Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).
  30. Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains. J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).
  31. Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs. J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).
  32. Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes. Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).
  33. Samaee, S. M. Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).
  34. Collymore, C., et al. Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).
  35. Chang, C. T., Whipps, C. M. Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish. Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).
  36. Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. , (2017).
  37. Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).
  38. Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Monitorowanie stanu zdrowia danio pr gowanychprzygotowanie zbiornika z rybami stra niczymidetekcja metod PCRanaliza osad wwykrywanie Mycobacteriumbiobezpiecze stwo kwarantannynadz r nad patogenami ryb
Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.