Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55312

⸱

25 lutego 2017

 , 
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy czułe, żelowe testy nieciągłe, aby zbadać kinetykę inicjacji opóźnionej nici przy użyciu białek replikacyjnych bakteriofaga T7.

Streszczenie

Tutaj udostępniamy protokoły do badania kinetycznego syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacyjne bakteriofaga T7. Replisom T7 jest jednym z najprostszych znanych systemów replikacji, składającym się tylko z czterech białek, co jest atrakcyjną cechą dla eksperymentów biochemicznych. Szczególny nacisk kładziony jest na syntezę starterów rybonukleotydowych przez prymazę-helikazę T7, które są wykorzystywane przez polimerazę DNA do inicjacji syntezy DNA. Ponieważ mechanizmy replikacji DNA są zachowane w całej ewolucji, protokoły te powinny być stosowane lub użyteczne jako koncepcyjna odskocznia dla badaczy korzystających z innych systemów modelowych. Opisane tutaj protokoły są bardzo czułe, a doświadczony badacz może przeprowadzić te eksperymenty i uzyskać dane do analizy w ciągu około jednego dnia. Jedynym wymaganym specjalistycznym sprzętem jest przyrząd do szybkiego wygaszania, ale ten sprzęt jest stosunkowo powszechny i dostępny z różnych źródeł komercyjnych. Do głównych wad tych testów należy jednak zastosowanie radioaktywności i stosunkowo niska przepustowość.

Wprowadzenie

Replikacja DNA jest zachowaną cechą całego życia komórkowego. Chociaż tożsamość i liczba komponentów replikacji są bardzo różne, ogólne mechanizmy są wspólne dla wszystkich evolution1. W tym miejscu opisano żelowe, nieciągłe eksperymenty kinetyczne z wykorzystaniem substratów promieniotwórczych, mające na celu zrozumienie kinetyki syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez składniki replikosomu T7. Maszyneria replikacji bakteriofaga T7 jest bardzo prosta, składa się tylko z czterech białek (polimerazy DNA, gp5 i jej czynnika procesywności, tioredoksyny E. coli, dwufunkcyjnej prymazy-helikazy gp4 i jednoniciowego białka wiążącego DNA, gp2.5)2. Ta cecha sprawia, że jest to atrakcyjny system modelowy do badania konserwatywnych mechanizmów biochemicznych zaangażowanych w replikację DNA.

Szczególny nacisk kładziony jest na tworzenie starterów rybonukleotydowych przez prymazę DNA T7, co jest kluczowym krokiem w inicjacji syntezy DNA. Ponadto można również zbadać zastosowanie tych starterów przez polimerazę DNA T7 lub inne białka replikacyjne, włączając je do mieszaniny reakcyjnej. Helikaza prymazy T7, gp4, katalizuje tworzenie starterów do syntezy DNA w określonych sekwencjach DNA zwanych miejscami rozpoznawania prymazów lub PRS (5'-GTC-3'). Cytozyna w PRS jest tajemnicza, jest niezbędna do rozpoznania witryny, ale nie jest kopiowana do product3. Pierwszy etap syntezy starterów przez gp4 polega na utworzeniu dinukleotydu pppAC, który jest następnie rozszerzany do trimera, a ostatecznie do funkcjonalnych starterów tetranukleotydowych pppACCC, pppACCA lub pppACAC w zależności od sekwencji w szablonie4. Te startery mogą być następnie wykorzystane przez polimerazę DNA T7 do zainicjowania syntezy DNA, która jest również procesem wspomaganym przez gp45,6. W związku z tym domena prymazowa stabilizuje niezwykle krótkie tetrarybonukleotydy z matrycą, zapobiegając ich dysocjacji, angażuje polimerazę DNA w sposób sprzyjający zabezpieczeniu startera/matrycy w miejscu aktywnym polimerazy7. Etapy te (synteza startera RNA, przekazanie startera do polimerazy i wydłużenie) są powtarzane w wielu cyklach w celu replikacji opóźnionej nici i muszą być skoordynowane z replikacją nici wiodącej.

Opisane tutaj testy są bardzo czułe i mogą być wykonane w umiarkowanym czasie. Są one jednak stosunkowo mało przepustowe i należy zachować dużą ostrożność przy stosowaniu i usuwaniu materiałów promieniotwórczych. W zależności od szybkości, z jaką przebiega reakcja, można użyć przyrządu do szybkiego wygaszania, aby uzyskać próbki w skalach czasowych nadających się do miarodajnej analizy przebiegów czasu reakcji w stanie ustalonym lub wstępnym. Ostatnio użyliśmy opisanych tutaj testów, aby dostarczyć dowodów na znaczenie uwalniania starterów z domeny prymazowej gp4 w inicjacji fragmentów Okazaki. Ponadto znaleźliśmy dowody na regulacyjną rolę jednoniciowego białka wiążącego DNA T7, gp2.5, w promowaniu wydajnego tworzenia i wykorzystania starterów8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Przestrzegaj wszystkich przepisów instytucjonalnych dotyczących bezpiecznego używania i usuwania materiałów radioaktywnych, w tym, ale nie ograniczając się do używania środków ochrony osobistej, takich jak rękawice, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i odpowiednie osłony akrylowe.

UWAGA: Standardowy bufor składa się z 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM glutaminianu potasu, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (ten bufor jest wstępnie przygotowany przy 5-krotnym stężeniu) i 0,3 mM każdego dNTP. Białka replikacyjne T7 są oczyszczane zgodnie z opisem8,9,10. Jednoniciowe DNA zawierające pojedyncze miejsce rozpoznawania prymazy T7 (5'-GGGTC-3', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3') można kupić w różnych firmach zajmujących się syntezą DNA (długość ssDNA może zależeć od wybranego enzymu, w przypadku prymazy T7 pentamer to minimalna długość matrycy do syntezy startera o pełnej długości11, ponieważ kryptyczne C jest niezbędne, jednak jeśli starter ma być rozszerzony przez polimerazę, dodatkowe nukleotydy muszą być obecne na końcu 3' matrycy. Reakcje rozpoczyna się przez dodanie końcowego stężenia 10 mM MgCl2 i inkubuje w temperaturze 25 °C. Ręczne pobieranie próbek sprawdza się w przypadku punktów czasowych wynoszących 5 sekund lub więcej. Jeśli wymagane są krótsze punkty czasowe, zaleca się użycie przyrządu do szybkiego wygaszania w celu uzyskania dokładnych danych.

1. Reakcja syntezy starterów z wieloma obrotami przez ręczne pobieranie próbek

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy podatkować 2 μl buforu barwnika formamidowego (93% (v/v) formamidu, 50 mM EDTA, 0,01% cyjanolu ksylenowego i 0,01% błękitu bromofenolowego) do 8 probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml. Ogólnie rzecz biorąc, liczba rur jest równa liczbie analizowanych punktów czasowych.
  2. Przygotuj mieszaninę o objętości 20 μl składającą się z 1x buforu, 0,1 mM ATP i CTP, 0,25 mCi/ml [α-32P] CTP, 0,1 μM matrycy ssDNA i 0,1 μM gp4 (wyrażonej jako stężenie heksameru - 0,6 μM monomeru).
  3. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Usunąć 2 μl mieszaniny za pomocą pipetora i wymieszać z 2 μl buforu barwnika formamidowego w probówce o pojemności 1,5 ml przygotowanej w kroku 1.1 w celu kontroli braku reakcji (czas zerowy).
  5. Dodać 2 μL 0,1 M MgCl2 do mieszaniny reakcyjnej (do końcowego stężenia 10 mM).
  6. Ręcznie pobrać 2 μl próbek mieszanin reakcyjnych za pomocą pipetora w odstępach 10 s i wymieszać z barwnikiem formamidowym wstępnie dozowanym w probówkach o pojemności 1,5 ml przygotowanych w kroku 1.1.
  7. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut w bloku grzewczym.
  8. Załadować podwielokrotności próbek do żelu denaturującego. Małe produkty starterów tetrarybonukleotydowych syntetyzowane przez prymazę T7 są dobrze rozdzielone na 25% akryloamidzie o grubości 0,4 mm i zawartości 25% akryloamidu (19:1), 3 M mocznika, 1x TBE (100 mM tris-boran, 1 mM EDTA).
  9. Umieść cały żel na bibule chromatograficznej i przykryj folią. Wysuszyć żel za pomocą suszarki do żelu.
  10. Przygotować serię rozcieńczeń pozostałej części mieszaniny reakcyjnej i umieścić tę samą objętość załadowaną na żel na bibułę chromatograficzną, tj. umieścić 4 μl rozcieńczenia, jeśli załadowano 4 μl próbki.
    nuta: Będzie to służyć jako krzywa standardowa do określenia stężenia produktów powstających podczas reakcji. Na przykład pięciokrotne rozcieńczenia przy użyciu buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) działają dobrze, obejmując zakres od 1:25 do 1:15,625 (52-5 6), ale rozcieńczenia należy dostosować w zależności od poziomu aktywności.
  11. Odsłonięty suchy żel i wzorzec za pomocą sita fosforowego. Określ ilościowo radioaktywność w serii rozcieńczeń i skonstruuj krzywą standardową zgodnie z opisem 8,12
    nuta: Włączenie polimerazy DNA T7 do mieszaniny reakcyjnej pozwala na zbadanie wykorzystania starterów tetrarybonukleotydowych przez ten enzym. Optymalnie stężenie polimerazy powinno być nasycone, aby uprościć interpretację danych. Stężenie polimerazy 0,4 μM lub wyższe daje dobre wyniki. Ponadto w ten sposób można zbadać wpływ innych białek, takich jak jednoniciowe białka wiążące DNA, na syntezę starterów lub inicjację opóźnionej nici.

2. Reakcja syntezy starterów wieloobrotowych przy użyciu przyrządu do szybkiego wygaszania

  1. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych
    1. Przygotuj 400 μl roztworu A, zawierającego 1x bufor, 0,2 μM heksameru gp4, 0,2 μM matrycy ssDNA, 0,6 mM dNTP, 0,2 mM ATP i CTP (w tym 0,5 mCi/ml [α-32P] CTP.
    2. Przygotować 400 μl roztworu B, zawierającego 1x bufor i 20 mM MgCl2.
  2. Działanie przyrządu do szybkiego wygaszania
    1. Włącz przyrząd do szybkiego wygaszania; po wyświetleniu menu głównego wpisz 7 na klawiaturze instrumentu, aby przesunąć sterownik strzykawki do pozycji wyjściowej.
    2. Otwórz pozycję strzykawki buforowej na "LOAD".
  3. Ładowanie strzykawek buforowych
    1. Podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml zawierającą bufor do portu strzykawki napędu. Zmień pozycję pokrętła strzykawki na "LOAD".
    2. Za pomocą strzykawek o pojemności 10 ml napełnić zbiornik buforowy instrumentu A i B 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA i napełnić strzykawkę C roztworem gaszącym (250 mM EDTA i 0,2% SDS). Usunąć pęcherzyki powietrza, wciskając i wysuwając tłoki.
    3. Zmień pozycje pokrętła na "FIRE". Wpisz 2, aby wyregulować położenie pręta sterownika strzykawki. Naciśnij przycisk "ADJUST DOWN", aby opuścić strzykawkę, aż bufor wyjdzie z pętli wyjściowej: (7-schodzi w dół; 8-duży krok w dół; 9-mały krok w dół). Wpisz "ESC", aby powrócić do menu głównego.
  4. Umyj rurki
    1. Podłącz przewód wyjściowy do próżni. Zmień sample pokrętła na "FLUSH". Zamknąć strzykawkę z buforem, ustawiając pokrętła w pozycji poziomej. Włącz próżnię i zanurz 2 pętle spłukujące w H2O na 10 s, a następnie zanurz w MeOH na 10 s. Suszyć pętle, zasysając powietrze przez ~15 s lub do wyschnięcia.
  5. Ładowanie próbek
    1. Zmień pozycję pokrętła próbki na "LOAD". Umieścić roztwór A w strzykawce o pojemności 1 ml. Podłączyć strzykawkę do jednego z portów ładowania próbki. Powtórzyć te czynności dla roztworu B i umieścić w przeciwległym porcie ładowania próbki.
  6. Zbieranie punktów czasowych
    1. W menu głównym wpisz 1 dla przebiegu wygaszania. Wprowadź czas reakcji (s) i naciśnij "ENTER". Zostanie wyświetlony numer pętli reakcyjnej, której należy użyć. Przełącz na wymaganą pętlę reakcyjną. Powtórz procedurę prania w kroku 2.2.4.
    2. Przekręć sample pokrętła w położenie "LOAD". Załaduj mieszaniny reakcyjne w pętlach próbki, aż znajdą się tuż poza centralną komorą mieszania. Przekręć wszystkie pokrętła w położenie "FIRE". Upewnij się, że wszystkie pokrętła są we właściwej pozycji.
    3. Umieść probówkę o pojemności 1.5 ml na końcu pętli wyjściowej. Naciśnij "GO", aby uruchomić reakcję. Powtórz procedurę prania w kroku 2.2.4. Załaduj strzykawki buforowe A i B, aż uderzą w kierowcę.
    4. Powtórz kroki 2.2.6.2-2.2.6.3 dla każdego żądanego punktu czasowego. Wyjątek: Nie należy ładować roztworu zawierającego odczynnik początkowy (tj. w tym przypadku MgCl2) podczas hartowania kontroli punktu zerowego.
    5. Po zakończeniu pobierania próbek wprowadź "ESC", aby powrócić do menu głównego. Naciśnij "7", aby przywrócić sterownik strzykawki buforowej do pozycji wyjściowej.
  7. Czyszczenie instrumentów
    1. Wyjąć strzykawki z mieszaniną reakcyjną. Przekręć pokrętło ładowania próbki do pozycji "LOAD". W próżni przemyć każdą pętlę próbki 10 ml 0,2 N NaOH, a następnie 10 ml 0,3 N H3PO4 i 10 ml MeOH.
    2. Przekręć pokrętła strzykawki do pozycji "LOAD". Nacisnąć wszystkie 3 tłoki strzykawki, aby pobrać reakcyjne i wygaszające. Umyć strzykawki 5 mlH2Oco najmniej dwa razy.
    3. Ponownie napełnić strzykawki 5 ml H2O i przekręcić pokrętła do pozycji "FIRE". Zmień pozycje pokrętła i włącz podciśnienie, aby usunąć H2O. Spłukiwać jak w kroku 2.2.4. Wyłącz instrument.
      nuta: Produkty są analizowane zgodnie z opisem w krokach 1.7-1.12. Ponadto polimeraza DNA T7 i inne białka replikacyjne mogą być dodawane do mieszaniny reakcyjnej w celu przeanalizowania ich wpływu na syntezę lub wydłużenie starterów.

3. Reakcja syntezy startera jednoobrotowego

UWAGA: Testy syntezy/przedłużania starterów jednoobrotowych są przeprowadzane podobnie jak reakcje wielokrotnej rotacji, z kilkoma zasadniczymi różnicami: testy te następują po przemianie znakowanego radioaktywnie ATP w produkty startera lub przedłużenia, jednak stężenie substratów i białek jest znacznie wyższe. Ponadto, aby uzyskać rozdzielczość milisekundową umożliwiającą analizę reakcji syntezy starterów, należy użyć maszyny o szybkim przepływie.

  1. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych.
    1. Przygotuj 400 μl roztworu A, zawierającego 1x bufor, 3 μM heksameru gp4, 6 μM matrycy ssDNA, 0,6 mM dNTP, 1 mM CTP i 2 nM [γ-32P] ATP. Przygotować 400 μl roztworu B, zawierającego 1x bufor i 20 mM MgCl2.
  2. Praca z szybkim przepływem hartowania
    1. Przeprowadzić reakcje zgodnie z opisem w kroku 2.2. W razie potrzeby dodać polimerazę DNA T7 lub białko wiążące jednoniciowe DNA T7 w stężeniu odpowiednio 15 μM i 20 μM. W takim przypadku produkty przedłużające gromadzą się w reżimie czasowym, który pozwala na ręczne pobieranie próbek reakcji.

4. Analiza danych

  1. Dopasuj krzywe postępu produktu do nieliniowych modeli najmniejszych kwadratów za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania zdolnego do dopasowania metodą najmniejszych kwadratów i/lub integracji numerycznej. Szczegóły operacji będą się różnić w zależności od zastosowanego oprogramowania, ale poniżej znajdują się uogólnione formy równań używanych do dopasowywania danych.
  2. Określ szybkość powstawania produktu w reakcjach syntezy starterów z wieloma obrotami, dopasowując krzywe postępu do równania liniowego. Jeśli krzywizna jest znaczna, użyj metody szybkości początkowej13,14, dopasowując dane do funkcji jednowykładniczej: y=A(e-k t ), gdzie y jest stężeniem produktu, A jest amplitudą reakcji, k jest obserwowaną stałą szybkości, t jest czasem w sekundach. Nachylenie linii stycznej w czasie=0 jest szybkością początkową.
    UWAGA: Dopasuj reakcje syntezy startera w stanie wstępnym do równania liniowego lub do równania wybuchu przed stanem ustalonym y=A (e-k burst t) +ratess t, gdzie A to amplituda reakcji, k burst jest obserwowaną stałą szybkości dla rozbłysku w stanie wstępnym, ratess jest szybkością w stanie ustalonymss = k cat [Enzym]), t oznacza czas w sekundach. Dopasuj krzywe postępu reakcji syntezy startera z pojedynczym obrotem do pojedynczej funkcji wykładniczej y=A(e-k t). W przypadku gp4 dopasuj dane według całkowania numerycznego15, do modelu z trzema etapami kondensacji NTP, gdzie każdy produkt pośredni jest w równowadze z enzymem, przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki przedstawione w Rysunek 1A pozyskano zgodnie z opisem w krok 1 protokołu, t. j.poprzez ręczne pobieranie próbek z reakcji syntezy startera katalizowanej przez gp4 w warunkach wielokrotnego obrotu. W tym przypadku, po elektroforezie żelowej, można zaobserwować szereg produktów przy użyciu CTP znakowanego za pomocą 32P w pozycji α w reakcjach syntezy starterów (Rycina 1A). Oznakowany prekursor, CTP, wykazuje najwy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszym czynnikiem w przeprowadzaniu tych eksperymentów jest dostępność wysoce aktywnego oczyszczonego enzymu. Podczas naszej pracy z gp4 stwierdziliśmy, na przykład, że przechowywanie oczyszczonego enzymu w buforze (20 mM fosforanu potasu, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) zawierającym 50% glicerolu w temperaturze -20 °C prowadzi do zmniejszenia specyficznej aktywności preparatu w ciągu kilku miesięcy. Dlatego teraz zamrażamy małe porcje oczyszczonego gp4 w 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium C.C.R. za komentarze i S. Moskowitzowi za przygotowanie rysunku. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) i GM54397 (C.C.R.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wstępnie ustawione kryształy Tris
pH 7,5		SIGMAT4128
Baza TrisSIGMA93362
Kwas L-glutaminowy sól potasowa monohydratSIGMAG1501 
Sześciowodny chlorek magnezuMallinckrodt Chemicals5958-04
1,4-DitiothreitolJ.T. BakerF780-02
Dodecylosiarczan soduMP Biomedicals811030
(Ethylenedinitrilo) Kwas tetraoctowy, sól disodowa, dihydratMallinckrodt Chemicals4931-04
[α-32P] CTPPerkinElmerBLU508Hradioaktywny, podejmij środki ochronne
γ-32P] ATPPerkinElmerBLU502Aradioaktywny, podejmij środki ochronne
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP Affymetrix77100cztery dNTP część zestawu
100 mM ATP i CTPEpicentrumRN02825część zestawu NTP
konstrukcje ssDNAZintegrowane technologie DNANie dotyczyniestandardowych sekwencji 
metanol Macron Fine Chemicals3017-08
formamidThermo Scientific17899
błękit bromofenolowySIGMAB8026 
Cylen Xyanol SIGMAX4126 
akryloamidSIGMAA9099Toxic
N,N′ -metylenobisakryloamidSIGMAM7279 toksyczny
MocznikBoston BioproductsP-940
Kwas borowyMallinckrodt Chemicals2549
Przyrząd do szybkiego gaszenia Kintek Corp.RQF-3 
Odkrywca KintekKintek Corp.Nie dotyczy
Kaleidagraph Synergy SoftwareN/A
[

Bibliografia

  1. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
  2. Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
  3. Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
  4. Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
  5. Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
  6. Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
  7. Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
  8. Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
  9. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
  10. Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
  11. Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
  12. Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
  13. Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658(2013).
  14. Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
  15. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
  16. Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
  17. Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).
  18. Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aparat do przep ywu z szybkim hartowaniemkinetyka syntezy primer wanaliza fragment w Okazakiprimaza helikaza T7aktywno polimerazy DNAznakowanie nukleotyd w izotopami promieniotw rczymidenaturuj ca elektroforeza w elueksperymenty pojedynczego obrotu
Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.