Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie pierwotnych kultur neurosfery do badania rzęsek pierwotnych

DOI:

10.3791/55315

⸱

14 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna rzęska jest fundamentalnie ważna w proliferacji neuronalnych komórek progenitorowych, różnicowaniu neuronów i funkcjonowaniu neuronów dorosłych. W tym miejscu opisujemy metodę badania ciliogenezy i transportu białek sygnałowych do rzęsek w nerwowych komórkach macierzystych / progenitorowych i zróżnicowanych neuronach przy użyciu pierwotnych kultur neurosfery.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna rzęska jest fundamentalnie ważna dla proliferacji nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych oraz dla różnicowania neuronów podczas życia embrionalnego, poporodowego i dorosłego. Ponadto większość zróżnicowanych neuronów posiada pierwotne rzęski, w których znajdują się receptory sygnałowe, takie jak receptory sprzężone z białkiem G, oraz cząsteczki sygnałowe, takie jak cyklazy adenylowe. Rzęska pierwotna determinuje aktywność wielu ścieżek rozwojowych, w tym szlaku jeża sonicznego podczas rozwoju neuronów embrionalnych, a także pełni funkcję w promowaniu przedziałowej sygnalizacji subkomórkowej podczas funkcji neuronalnych dorosłych. Nic dziwnego, że defekty w pierwotnej biogenezie i funkcji rzęsek zostały powiązane z anomaliami rozwojowymi mózgu, otyłością centralną oraz deficytami uczenia się i pamięci. Dlatego konieczne jest zbadanie pierwotnej biogenezy rzęsek i transportu rzęsek w kontekście nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych i zróżnicowanych neuronów. Jednak metody hodowli neuronów pierwotnych wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej i nie są podatne na cykle zamrażania i rozmrażania. W tym protokole omawiamy metody hodowli mieszanych populacji nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych przy użyciu pierwotnych neurosfer. Metody hodowli oparte na neurosferze zapewniają połączone korzyści płynące z badania pierwotnych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych: zdolność do wielu przejść i cykli zamrażania i rozmrażania, potencjał różnicowania w neurony/glej oraz transfekcyjność. Co ważne, ustaliliśmy, że neuronalne komórki macierzyste / progenitorowe pochodzące z neurosfery i zróżnicowane neurony są orzęsione w hodowli i lokalizują cząsteczki sygnałowe istotne dla funkcji rzęsek w tych przedziałach. Wykorzystując te kultury, dalej opisujemy metody badania ciliogenezy i transportu rzęsek w nerwowych komórkach macierzystych / progenitorowych i zróżnicowanych neuronach. Te metody oparte na neurosferze pozwalają nam badać szlaki komórkowe regulowane rzęskami, w tym receptor sprzężony z białkiem G i sygnalizację sonic hedgehog, w kontekście nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych i zróżnicowanych neuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna rzęska to dynamiczna subkomórkowa kompartment oparty na mikrotubulach, który pełni funkcję anteny sensorycznej koordynującej komórkowe szlaki sygnałowe, w tym szlak Sonic Hedgehog (Shh) podczas rozwoju neuronów embrionalnych1,2, oraz podzielona na przedziały sygnalizacja subkomórkowa w funkcji neuronalnej dorosłego3,4. Komponenty sygnalizacyjne tych szlaków, takie jak receptor Shh Patched5; aktywator szlaku Wygładzony (Smo)6; oraz Gpr1617, sierocy receptor sprzężony z białkiem G (GPCR), który negatywnie reguluje szlak Shh, lokalizując się w rzęskach w dynamiczny sposób. Doniesiono, że wiele GPCR lokalizuje się w rzęskach w neuronach w mózgu7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Defekty rzęsek i szlaków sygnałowych generowanych przez rzęski wpływają na wiele tkanek i są zbiorczo znane jako ciliopaty17,18,19. Spektrum chorób ciliopatii często obejmuje wady neurorozwojowe, takie jak nieprawidłowości twarzoczaszki20,21,22. Ponadto rzęski pierwotne w neuronach podwzgórza regulują ośrodkowe szlaki sytości, a defekty skutkują otyłością centralną23, odzwierciedlając otyłość w rzęskach syndromicznych, takich jak zespół Bardeta Biedela24. Ponadto sygnalizacja receptora neuropeptydowego w rzęskach reguluje centralne szlaki sytości11,14. Rzęskowa lokalizacja cyklazy adenylowej III (ACIII) i GPCR, takich jak receptor somatostatyny 3 w neuronach hipokampa, powoduje nowe defekty rozpoznawania obiektów i deficyty pamięci25,26 i odpowiada brakowi integralności rzęsek27. Rozwojowe aspekty sygnalizacji generowanej przez rzęski są ściśle związane z homeostazą tkanek; w szczególności rzęski są ważne dla progresji rdzeniaków zarodkowych podtypu Shh wynikających z komórek progenitorowych ziarnistości w móżdżku28,29. Tak więc pierwotne rzęski odgrywają ważną rolę podczas rozwoju i funkcji neuronów embrionalnych, pourodzeniowych i dorosłych.

Nerwowe komórki macierzyste (NSC) znajdują się w strefie podkomorowej (SVZ) komory bocznej, strefie podziarnistej zakrętu zębatego hipokampa oraz w strefie komorowej trzeciej komory w podwzgórzu u ssaków30,31,32. NSC są multipotencjalne, posiadają zdolność do samoodnawiania się i są ważne dla rozwoju mózgu i medycyny regeneracyjnej30. Większość NSC w SVZ jest w stanie spoczynku i posiada pojedynczą rzęskę pierwotną, która w wielu przypadkach rozciąga się do komory bocznej33. Pierwotna rzęska sygnalizuje poprzez lokalizację różnych receptorów, indukując dalsze odpowiedzi komórkowe, szczególnie w odniesieniu do szlaków Shh, TGFβ i receptorowej kinazy tyrozynowej2,34,35,36. Ponieważ rzęski pierwotne rozciągają się do komory bocznej, przypuszcza się, że rzęski pierwotne wykrywają cytokiny w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), aby aktywować NSCs37. Ostatnie badania sugerują, że szlak sygnałowy Shh i rzęski pierwotne mają kluczowe znaczenie dla aktywacji komórek macierzystych w naprawie i regeneracji wielu tkanek, w tym nabłonka węchowego, płuc i nerek38,39,40,41. Nie są jednak znane mechanizmy, za pomocą których płyn mózgowo-rdzeniowy komunikuje się z NSC i czy zaangażowane są rzęski pierwotne. Przylegające NSC w kulturze są orzęsione; lokalizować składniki szlaku Shh, takie jak Smo i Gpr161 w rzęskach; i są responsywne Shh42. W związku z tym NSC mogą służyć jako ważny system modelowy do badania szlaku Shh, transportu rzęskowego i szlaków różnicowania neuronów. Ponadto neurony zróżnicowane od NSC mogą być również wykorzystywane do testów transportu rzęskowego.

Neurosfery składają się z klastrów swobodnie unoszących się komórek, powstałych w wyniku proliferacji nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, które rosną w obecności specyficznych czynników wzrostu i powierzchni nieadhezyjnych43,44. Neurosfery służą jako ważne modele hodowli in vitro do badania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w prawidłowym rozwoju i chorobie31,45,46,47. W tym miejscu opisujemy test oparty na neurosferze do hodowli nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych i różnicowania w neurony / glej. Szczególnie kładziemy nacisk na transport składników sygnałowych do rzęsek nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych i zróżnicowanych neuronów (ryc. 1). W przeciwieństwie do hodowli neuronów pierwotnych, neurosfery pierwotne są stosunkowo łatwe do hodowli, są podatne na wielokrotne pasaże i cykle zamrażania-rozmrażania oraz mogą ulegać różnicowaniu w neurony/glej. Co ważne, ustaliliśmy, że neuronalne komórki macierzyste / progenitorowe pochodzące z neurosfery i zróżnicowane neurony są orzęsione w hodowli i lokalizują cząsteczki sygnałowe istotne dla funkcji rzęsek w tych przedziałach. Metody hodowli oparte na neurosferze mogą służyć jako idealny system modelowy do badania ciliogenezy i transportu rzęsek w NSC i zróżnicowanych neuronach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja neurosfer od mózgu dorosłej myszy

  1. Poddać eutanazji dorosłą mysz (w wieku około 2 miesięcy) przez przedawkowanie izofluranu. Dokładnie sprawdź, czy mysz przestała oddychać i przeprowadź sekcję zwłok natychmiast po śmierci.
  2. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby otworzyć czaszkę. Usuń mózg.
  3. Umieść mózg w zimnym PBS w 10 cm naczyniu na lodzie. Postępuj zgodnie z metodą preparacji całego montażu, aby uzyskać SVZ z komory bocznej48.
  4. Umieścić komorę boczną w probówce o pojemności 1,5 ml, dodać 500 μl 0,05% trypsyny-EDTA do PBS i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
  5. Po 15 minutach dodać 500 μl pożywki zatrzymującej i delikatnie pipetować 20 - 30 razy końcówką o pojemności 1 ml. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla przeżycia komórki.
  6. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 8 minut. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml PBS i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując 5x końcówką o pojemności 1 ml.
  7. Wirować w temperaturze 500 x g przez 8 minut. Odlać supernatant za pomocą końcówki o pojemności 1 ml i dodać 1 ml podłoża podstawowego.
  8. (Opcjonalnie) Jeśli zaobserwuje się szczątki komórkowe, przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μm.
  9. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru; ogólnie uzyskuje się około 30 000 - 60 000 komórek/SVZ.
  10. Umieścić komórki z jednego SVZ w 10-centymetrowym naczyniu z 10 ml pożywkiNSC i hodować w temperaturze 37 °C z 5% CO 2 .
  11. (Opcjonalnie) Aby uniknąć fuzji między kulami49, umieść 1,000 komórek w jednym dołku 6-dołkowej płytki o bardzo niskiej wiązalności, która jest wstępnie wypełniona 1,5 ml pożywki NSC i hoduj w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Po 5-7 dniach można zaobserwować neurosfery (ryc. 2A). Okres hodowli może różnić się w zależności od wieku myszy lub tła genetycznego.
  12. Dodawać 2 ml pożywki NSC co 3-4 dni, aby utrzymać kulturę (nie usuwać istniejącej pożywki).

2. Analiza zdolności różnicowania neurosfer i testy ciliogenezy

  1. Aby przeanalizować zdolność różnicowania, przeanalizuj neurosfery w warunkach przylegających w pożywce różnicowej.
  2. Przed użyciem wysterylizuj okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w autoklawie lub pod wpływem promieniowania UV. W celu uzyskania przylegającej hodowli komórkowej należy umieścić wysterylizowane okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 12 mm w studzience na płytce 24-dołkowej w warunkach aseptycznych.
  3. Pokryj szkło nakrywkowe przez 10 s 500 μl 0,002% poli-L-lizyny (PLL). Odessać roztwór i suszyć go przez 10-15 minut.
  4. Dodać 500 μl roztworu lamininy (5 μg/μl). Inkubować szkło nakrywkowe przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  5. Odessać lamininę i dodać 500 μl pożywki różnicującej lub pożywki NSC (kontrola niezróżnicowana).
  6. W celu przeprowadzenia testu różnicowania należy wziąć pod mikroskop kulę o średnicy 100 - 200 μm z końcówką o pojemności 200 μl. Dodaj 5-10 neurosfer do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i hoduj przez 7-10 dni w pożywce różnicującej.
  7. Aby przeanalizować niezróżnicowane neurosfery, dodaj 5-10 neurosfer do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i hoduj przez 1-2 dni w pożywce NSC. Przyłączone neurosfery rozprzestrzeniają się i rosną jako monowarstwa (ryc. 2B).
  8. Po ostrożnym usunięciu pożywki utrwalić komórki 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć PBS dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Płytka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące.
    UWAGA: Aby uwidocznić nerwowe komórki macierzyste / progenitorowe w pożywce NSC i zróżnicowane komórki w pożywce różnicowej, wykonaj barwienie immunologiczne przeciwko Nestin (marker nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych), β–tubulinie III (monoklonalny TUJ1, marker neuronalny), GFAP (kwaśne białko fibrylarne glejowe, marker astrocytów) i O4 (marker oligodendrocytów) (Figura 2B-E). Aby przeanalizować rzęski, wykonaj barwienie immunologiczne przeciwko Arl13b (pierwszorzędowy marker rzęsek) i Gpr161 (rzęskowy GPCR) (ryc. 3).
  9. Zamontuj szklankę nakrywkową z roztworem montażowym na szybie przesuwnej. Przechyl szklaną prowadnicę, aby usunąć nadmiar roztworu.

3. Analiza ciliogenezy w neurosferach

  1. Aby przeanalizować komórki w nienaruszonych neurosferach za pomocą barwienia immunologicznego, przenieś 1 ml pożywki zawierającej wiele neurosfer do probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 500 x g przez 8 minut. Utrwal kulki 4% (PFA) po usunięciu pożywki przez 15 minut i przemyj PBS. Wiruj kulki przy 500 x g przez 8 min, usunąć supernatant i inkubować kulki O/N z 30% sacharozą w temperaturze 4°C.
  2. Odrzucić supernatant za pomocą końcówki o pojemności 1 ml i dodać 500 μl roztworu OCT za pomocą odciętej końcówki o pojemności 1 ml. Odetnij krawędź końcówki, aby poszerzyć otwór, ponieważ OCT jest lepki.
  3. Przenieś roztwór OCT zawierający neurosfery do jednorazowej plastikowej formy do zamrażania (10 mm x 10 mm x 5 mm).
  4. Zamrozić formę na suchym lodzie na co najmniej 15 minut.
  5. (Opcjonalnie) Przerwij eksperyment i przechowuj formę w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
  6. Wytnij sekcje kriostatem; grubość odcinków powinna wynosić 15-30 μm.
  7. Aby uwidocznić rzęski pierwotne w neurosferze, wykonaj barwienie immunologiczne przeciwko Arl13b (ryc. 4).

4. Kultura i przejście neurosfer i przylegających NSC

  1. Przejdź przez neurosfery, gdy rozmiar kuli wynosi od 100 do 200 μm; gdy neurosfery są zbyt duże (300 μm lub więcej), nie są idealne do eksperymentów.
  2. Przenieś neurosfery do probówki o pojemności 50 ml za pomocą końcówki o pojemności 1 ml i wiruj w dół przy 500 x g przez 8 minut.
  3. Odrzucić supernatant za pomocą aspiratora, dodać 500 μl 0,05% trypsyny-EDTA do PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Ilość trypsyny różni się w zależności od liczby kulek.
  4. Dodać 500 μl pożywki surowicy i delikatnie pipetować 20 razy końcówką o pojemności 1 ml.
  5. Wirować w temperaturze 500 x g przez 8 minut. Odlać supernatant za pomocą końcówki o pojemności 1 ml i dodać 1 ml podłoża podstawowego.
  6. (Opcjonalnie) Jeśli widoczne są szczątki komórkowe lub niezdysocjowane neurosfery, przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μm.
  7. Umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu o gęstości 10 000 komórek/cm2 w pożywce NSC; komórki będą gotowe do następnego przejścia po tygodniu.
  8. (Opcjonalnie) Aby zamrozić komórki, dodaj pożywkę zamrażającą, aby wytworzyć od 500 000 do 1 000 000 komórek/ml zawiesiny. Zamrozić komórki za pomocą pojemników do kriozamrażania; Niezdysocjowane neurosfery również mogą zostać zamrożone.
  9. W przypadku hodowli adherentnej rozcieńczyć komórki do 50 000 komórek/cm2 na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PLL i Lamininą pożywką NSC i hodować przez 1-2 dni.

5. Głód i analiza rzęsek

  1. Przygotuj pożywkę głodową (tabela 1).
  2. 1-2 dni po początkowym posiewie przylegających komórek po dysocjacji, zmień pożywkę na NSC w jednej studzience (kontrola) i pożywkę głodową w innej studzience (eksperyment).
  3. Hodować przylegające komórki przez 24 godziny.
  4. Utrwalić komórki 4% PFA w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przemyć dwukrotnie PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. (Opcjonalnie) Przerwać eksperyment i przechowywać 24-dołkowe płytki z szkiełkami nakrywkowymi w PBS w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące.
  6. Wykonaj protokół immunofluorescencji do barwienia7,50.
  7. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą rozwiązania montażowego. Wysuszyć szkiełko szkiełkowe O/N przy RT w ciemności.
  8. Rejestruj obrazy pod mikroskopem złożonym w wymaganym powiększeniu. Używaj mikroskopu, kamery i obiektywów (40X/1.3 oleju i 63X/1.4 oleju), sterowanych za pomocą dołączonego oprogramowania. Wykonaj wystarczającą ilość przekrojów z w odstępach 0,5-0,8 μm (ryc. 5).
  9. W celu analizy ilościowej lokalizacji rzęsek w przylegających komórkach, należy uzyskać stosy obrazów z 3-8 kolejnych pól z łączącymi się komórkami, patrząc na kanał DAPI. Określ ilościowo liczbę rzęsek pierwotnych za pomocą ImageJ/Fiji. Zazwyczaj użyj narzędzia "Licznik komórek" w oknie dialogowym ImageJ Plugins>Analyze, aby policzyć komórki z rzęskami GPCR-dodatnimi; Maksymalne projekcje ze stosów obrazów można również wyeksportować z ImageJ/Fiji.Do celów zliczania i eksportowania należy używać podobnych parametrów intensywności i kontrastu obrazu dla wszystkich obrazów z tego samego eksperymentu.

6. Transfekcja neurosfer

  1. Przylegaj zdysocjowane komórki do szkiełek nakrywkowych przez 24 godziny. Użyj gęstości komórek zwykle od 75 000 do 150 000 komórek w 500 μl pożywki NSC w jednym dołku na 24-dołkowej płytce.
  2. Wymieszać 25 μl zredukowanej pożywki surowicy i 1,5 μl odczynnika do transfekcji w mikroprobówce o pojemności 0,5 ml, wirując przez 5 s.
  3. Dodać 2,5 μg plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn do oddzielnej mikroprobówki o pojemności 0,5 ml zawierającej 25 μl zredukowanej pożywki surowicy i mieszać przez wirowanie przez 5 sekund.
  4. Dodać 1 μl odczynnika do transfekcji do drugiej mikroprobówki zawierającej DNA i mieszać przez wirowanie przez 5 s.
  5. Dodać mieszaninę z probówki zawierającej DNA do pierwszej mikroprobówki i wymieszać pipetując.
  6. Inkubować mieszaninę przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji delikatnie dodawać kroplami mieszaninę transfekcyjną do studzienek na wierzchu pożywki NSC (500 μl/studzienkę).
  7. Zmienić pożywkę 24 godziny po transfekcji na pożywkę kontrolną (pożywka NSC) lub pożywkę głodową (500 μl/studzienkę).
  8. Utrwal komórki, zmieniając pożywkę na 4% PFA po 24 godzinach i wykonaj barwienie immunologiczne; zazwyczaj przy użyciu tego protokołu uzyskuje się do 10% skuteczności transfekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po tygodniowym posiewaniu komórek z SVZ w pożywce NSC, zaobserwowano unoszące się w powietrzu neurosfery (Rysunek 2A). Rozmiary kul wahały się od 50 do 200 μm. Aby zbadać, czy kulki pochodzą z nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych, neurosfery posiewano na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PLL i Lamininą w pożywce NSC przez 2 dni. Następnie poddano je barwieniu immunologicznemu na podstawie markera nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, Nestin. Potrze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy metodę generowania i utrzymywania kultur neurosfery z dorosłych myszy SVZ. Oto kilka istotnych punktów dotyczących kultur. Po pierwsze, rozmiary kul wynoszą zwykle od 50 do 200 μm. Z naszego doświadczenia wynika, że gdy neurosfera osiąga średnicę większą niż 300 μm, nie osiągnięto optymalnego czasu na pasażowanie. Te większe kule zawierają martwe komórki w jądrze. Po drugie, ponieważ neurosfery są powszechnie używane do badania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, ważne jest, aby używa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium S.M. jest finansowana z grantów rekrutacyjnych od CPRIT (R1220) i NIH (1R01GM113023-01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Okrągła szklana osłona 12 mmFisherbrand12-545-80 
Płytka 24-dołkowaFalcon353047
4% paraformaldehydu (PFA)Affymetrix19943
probówka 50 mlFalcon352098
szalka Petriego 95 mm x 15 mm, pokrywka wsuwanaFisherbrandFB0875714G10 cm naczynie
70 µ Filtr siatkowy do komórek mFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Osioł anty Królik, Alexa 488 przeciwciało wtórne
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
Suplement B-27 (50X), bez surowicyWirówka
ThermoFisher Scientific 17504001 B27Thermo scientificST 40R
Fiolka kriogenicznaCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigmaD5025-15KUDnaza I
DimetylosulfotlenekSigmaD8418-100MLDMSO
Jednorazowe formy do próbek winyluSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco 10X, modyfikowana, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, płynna, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowychSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5Kleszcze Narzędzia naukowe11254-20
Surowica bydlęca płodu (FBS)SigmaF9026-500ML
RoztwórFluoromount-GRozwiązanie montażowe Southern Biotech0100-01
GFAPDAKOZ0334
Kozie przeciwciało wtórne anty mysie IgG1, koniugat Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA-21127Koza anty mysie IgG1, Alexa 555 przeciwciało drugorzędowe
Kozioł anty Mysz IgG2a Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 555 koniugatThermoFisher ScientificA-21137Koza anty mysz IgG2a, Alexa 555 przeciwciało wtórne
Gpr161domowej robotyN/A
ludzki bFGFSigmaF0291Hemocytometr FGF
Hausser Scientific0,100 mmgłębokości ulepszony neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Izofluoran
Laminina z błony podstawnej mięsaka Engelbreth-Holm-SwarmSigmaL2020
L-Glutamina L-Glutamina (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamina 3000 Odczynnik do transfekcjiThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
Suplement N-2 (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Podłoże neuropodstawoweGibco21103-049
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121
Związek OCTSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicylina-StreptomycynaSigmaP4333-100ML
Poli-L-lizyna (PLL)SigmaP4707
Rekombinowane ludzkie białko EGF, systemy CFR i D236-EG-200
EGF NożyczkiNarzędzia precyzyjne14060-10
Szkiełko mikroskopowe Superfrost plusFisher scientific12-550-15Szkiełka
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Roztwór trypsyny-EDTA (10X)SigmaT4174-100Trypsyna
COSTAR 6-dołkowa płytka, z pokrywką Płaskie dno Bardzo niska powierzchnia mocowania Polistyren, sterylnyCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulina IIICovanceMMS-435PTUJ1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
  3. Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
  4. Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
  5. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
  6. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
  7. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
  8. Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
  9. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
  10. Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
  11. Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
  12. Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857(2013).
  13. Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902(2010).
  14. Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422(2015).
  15. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
  16. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
  17. Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
  18. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  19. Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
  20. Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
  21. Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
  22. Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G. Primary cilia in neurodevelopmental disorders. Nat Rev Neurol. 10, 27-36 (2014).
  23. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
  24. Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
  25. Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
  26. Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
  27. Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576(2014).
  28. Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
  29. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
  30. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
  31. Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
  32. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669(2014).
  33. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
  34. Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
  35. Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
  36. Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
  37. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  38. Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
  39. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  40. Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
  41. Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
  42. Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
  43. Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
  44. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  45. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  46. Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
  47. Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
  48. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  49. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
  50. Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
  51. Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
  52. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
  53. Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
  54. Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
  55. Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
  56. Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
  57. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neuronalne kom rki macierzystehodowla neurosferbiogeneza rz sektransport wewn trzrz skowyimmunobarwieniemarker ARL13Blokalizacja GPR161sekcja strefy podkomorowejmikroskopia konfokalna

Powiązane artykuły