Ten protokół opisuje masaż kloaczny, nieinwazyjną technikę manualną pobierania nasienia od ptaków, oraz ekstrakcję DNA z plemników ptaków za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji z modyfikacjami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie nasienia ptaków za pomocą masażu kloacznego i izolacji DNA z plemników
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pobieranie nasienia może być przydatne do szerokiego zakresu zastosowań, w tym do badań dotyczących jakości nasienia, dynamiki telomerów plemników i epigenetyki. Ptaki są szeroko stosowanymi obiektami w badaniach biologicznych i idealnie nadają się do badań obejmujących powtarzające się próbki nasienia. Jednak obecnie dostępnych jest niewiele zasobów dla tych, którzy chcą dowiedzieć się, jak zbierać i ekstrahować DNA z plemników ptaków. Tutaj opisujemy masaż kloaczny, delikatną, nieinwazyjną manualną technikę pobierania plemników ptaków. Chociaż technika ta jest ugruntowana w literaturze, może być trudno nauczyć się jej na podstawie dostępnych opisów. Dostarczamy również informacji na temat ekstrakcji DNA z nasienia ptaków za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji z modyfikacjami. Masaż kloaką można z łatwością zastosować u każdego małego i średniego samca ptaka w stanie rozrodczym. Po pobraniu nasienie można natychmiast wykorzystać do testów ruchliwości lub zamrozić w celu ekstrakcji DNA zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym dokumencie. Ten protokół ekstrakcji został udoskonalony dla plemników ptaków i został z powodzeniem zastosowany na próbkach pobranych od kilku gatunków wróblowych (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus i Turdus migratorius) i jednego kolumbida (Columba livia).
Wprowadzenie
Ptaki są idealnymi obiektami do badań nad jakością nasienia i konkurencją1, dynamika telomerów plemników2, epigenetics3, i podobne tematy, ponieważ są szeroko stosowane w badaniach biologicznych, a plemniki można łatwo pobrać za pomocą masażu kloacznego. Masaż kloaką to delikatna, nieinwazyjna technika manualna służąca do pobierania nasienia od ptaków4,5,6. Powtarzające się próbki można łatwo uzyskać i nie są wymagane żadne specjalne narzędzia, co ułatwia wykonywanie ich w terenie lub w laboratorium. Choc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Niniejszy protokół obejmuje zwierzęta kręgowce i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Dakota Północna.
1. Pobieranie nasienia od ptaka wróblowego za pomocą masażu kloaki
UWAGA: Masaż kloaki jest skuteczną techniką pobierania nasienia wyłącznie u ptaków aktywnych rozrodczo, jednak może zostać z sukcesem przeprowadzony poza sezonem lęgowym w odpowiednich warunkach niewoli. Przed zastosowaniem masażu kloaki należy określić aktywność rozrodczą gatunków docelowych. Technikę tę można stosować u ptaków dzikich bezpośrednio po odłowieniu lub....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Masaż kloaki oraz ekstrakcja DNA z zastosowaniem opisanego protokołu zostały przeprowadzone u kilku gatunków wróblowych oraz jednego gołębiowatego (Tabela 1). Obecność plemników w próbkach nasienia pobranych za pomocą masażu kloaki potwierdzono, oglądając niewielką ilość rozcieńczonych próbek pod mikroskopem złożonym przy powiększeniu 40X (Rysunek 3). Po wyekstrahowaniu DNA z próbek nasienia pobranych od wróbli domowych zgodnie z tutaj opisan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy prostą i niezawodną metodę pobierania nasienia od małych i średnich ptaków w stanie czynnym rozrodczość oraz ekstrakcji DNA z plemników ptaków.
Opisany protokół ekstrakcji DNA nasienia jest zmodyfikowany z zestawu dla uproszczenia, ale został udoskonalony do stosowania na nasieniu ptaków. Plemniki są odporne na lizę przez standardowe chemikalia do ekstrakcji 9,13, a próbki nasienia pobrane z wróblowych są dość małe (zwykle ki.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Jose Noguera za wczesną pomoc w masażu kloaicznym oraz Jeffreyowi Kittilsonowi za wsparcie laboratorium. Praca ta została wsparta nagrodą ND EPSCoR FAR0022429 dla BJH. Koszty publikacji zostały hojnie wsparte przez Wydział Nauk Biologicznych NDSU.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurki kapilarne mikrohematokrytu | Fisherbrand | 22-362566 | Można użyć dowolnego dostawcy. Mniejsze probówki mogą być bardziej skuteczne w pobieraniu małych próbek nasienia, takich jak bardzo małe ptaki wróblowate, takie jak wróbel ćwierkający. |
| Probówki do mikrowirówek | Dowolna | ||
| 1x PBS | Dowolna | Służy do przechowywania próbek nasienia przed ekstrakcją DNA. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Baza Tris | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Można użyć dowolnego dostawcy. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Można skorzystać z dowolnego dostawcy. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Można użyć dowolnego dostawcy. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Można skorzystać z dowolnego dostawcy. |
| Zestaw QIAamp DNA micro | Qiagen | 56304 | Zalecany jest szczególnie zestaw Qiagen QIAamp DNA micro. Ten protokół ekstrakcji DNA został wypróbowany z innymi komercyjnymi zestawami, ale z niewielkim powodzeniem. Przyczyny tego są nam nieznane. |
Bibliografia
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
