Pobieranie nasienia ptaków za pomocą masażu kloacznego i izolacji DNA z plemników

Podsumowanie

Ten protokół opisuje masaż kloaczny, nieinwazyjną technikę manualną pobierania nasienia od ptaków, oraz ekstrakcję DNA z plemników ptaków za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji z modyfikacjami.

Streszczenie

Pobieranie nasienia może być przydatne do szerokiego zakresu zastosowań, w tym do badań dotyczących jakości nasienia, dynamiki telomerów plemników i epigenetyki. Ptaki są szeroko stosowanymi obiektami w badaniach biologicznych i idealnie nadają się do badań obejmujących powtarzające się próbki nasienia. Jednak obecnie dostępnych jest niewiele zasobów dla tych, którzy chcą dowiedzieć się, jak zbierać i ekstrahować DNA z plemników ptaków. Tutaj opisujemy masaż kloaczny, delikatną, nieinwazyjną manualną technikę pobierania plemników ptaków. Chociaż technika ta jest ugruntowana w literaturze, może być trudno nauczyć się jej na podstawie dostępnych opisów. Dostarczamy również informacji na temat ekstrakcji DNA z nasienia ptaków za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji z modyfikacjami. Masaż kloaką można z łatwością zastosować u każdego małego i średniego samca ptaka w stanie rozrodczym. Po pobraniu nasienie można natychmiast wykorzystać do testów ruchliwości lub zamrozić w celu ekstrakcji DNA zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym dokumencie. Ten protokół ekstrakcji został udoskonalony dla plemników ptaków i został z powodzeniem zastosowany na próbkach pobranych od kilku gatunków wróblowych (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus i Turdus migratorius) i jednego kolumbida (Columba livia).

Wprowadzenie

Ptaki są idealnymi obiektami do badań nad jakością nasienia i konkurencją¹, dynamika telomerów plemników², epigenetics³, i podobne tematy, ponieważ są szeroko stosowane w badaniach biologicznych, a plemniki można łatwo pobrać za pomocą masażu kloacznego. Masaż kloaką to delikatna, nieinwazyjna technika manualna służąca do pobierania nasienia od ptaków^4,5,6. Powtarzające się próbki można łatwo uzyskać i nie są wymagane żadne specjalne narzędzia, co ułatwia wykonywanie ich w terenie lub w laboratorium. Chociaż masaż kloaką jest stosowany od dziesięcioleci, trudno jest dowiedzieć się tego z dostępnych pisemnych opisów. Niniejsza publikacja ma na celu skrócenie czasu i niepewności związanych z nauką masażu kloacznego.

Nasienie pobrane od ptaków za pomocą masażu kloacznego może być natychmiast wykorzystane do oceny ruchliwości^4,7 lub sztuczne zapłodnienie⁸, lub zamrożone do innych zastosowań, takich jak zaawansowane obrazowanie i ekstrakcja DNA. Próbki nasienia ptaków wróblowych są małe, ale zawierają gęsto upakowane plemniki. DNA jest ekstrahowane przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji dla uproszczenia, z modyfikacjami w celu przezwyciężenia specjalistycznych cech ochronnych spermy⁹. Po ekstrakcji telomery plemników można zmierzyć za pomocą qPCR¹⁰.

Protokół

Niniejszy protokół obejmuje zwierzęta kręgowce i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Dakota Północna.

1. Pobieranie nasienia od ptaka wróblowego za pomocą masażu kloaki

UWAGA: Masaż kloaki jest skuteczną techniką pobierania nasienia wyłącznie u ptaków aktywnych rozrodczo, jednak może zostać z sukcesem przeprowadzony poza sezonem lęgowym w odpowiednich warunkach niewoli. Przed zastosowaniem masażu kloaki należy określić aktywność rozrodczą gatunków docelowych. Technikę tę można stosować u ptaków dzikich bezpośrednio po odłowieniu lub u ptaków przetrzymywanych w niewoli.

1. Zaczynając od samca ptaka (w stanie hodowlanym), trzymając go chwytem obrączkarskim w niedominującej dłoni, przenieś ptaka do dłoni dominującej tak, aby jego strona brzuszna dotykała wnętrza dłoni (Rysunek 1).
   1. Upewnij się, że głowa ptaka znajduje się najbliżej bocznej krawędzi dłoni. Delikatnie unieruchom głowę i ciało, używając małego, serdecznego i środkowego palca. W ten sposób kloaka i ogon ptaka pozostają odsłonięte.
   2. Pozostaw nogi ptaka luźno lub lekko unieruchom je wnętrzem dłoni.

Rysunek 1Chwyt do masażu kloaki. Ptaka należy lekko unieruchomić w dłoni dominującej tak, aby jego strona brzuszna stykała się z wnętrzem dłoni, a głowa była przytrzymywana palcem małym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Umieść palec wskazujący i kciuk dominującej dłoni po obu stronach górnego końca kloaki i lekko zaciśnij palce, wywierając bardzo delikatny nacisk w kierunku ogona ( Rysunek 2). Kloaka wywinięcie się, odsłaniając śluzówkę kloaki (różowe wnętrze).
   UWAGA: Jeśli ptak nie produkuje obecnie nasienia, wyniosłość kloaki może być niewielka, a kloaka trudna do wywinięcia. Dzięki doświadczeniu można łatwo odróżnić kloaki samców aktywnych i nieaktywnych rozrodczo^5,1.

Rysunek 2Pozycja palca i wybrzuszenie kloaki. Wyewersuj kloakę, wywierając lekki nacisk na jej górny koniec (A). U reprodukcyjnie aktywnego samca wróblokształtnych guzowatość kloakowa jest wyraźna i twarda (B). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Niedominującą ręką należy oprzeć opuszkę palca wskazującego o grzbietową stronę nasady ogona, aby ustabilizować dłoń, a następnie umieścić koniec kciuka tuż poniżej wywiniętej kloaki.
   UWAGA: Krótki i gładki paznokieć u kciuka jest korzystny podczas wykonywania masażu kloaki i chroni ptaka przed przypadkowym zranieniem.
4. Niedominujący kciuk należy przesuwać głęboko i w kierunku głowowym w powtarzalnym ruchu z umiarkowanym naciskiem, pozostając poniżej kloaki. Czynność tę kontynuuje się aż do momentu ejakulacji ptaka. W zależności od osobnika zazwyczaj wymaga to od jednego do kilkudziesięciu ruchów.
5. Natychmiast po ejakulacji należy zebrać nasienie do rurki mikrohematokrytowej. Masaż kloaki można powtórzyć, aby uzyskać kilka ejakulatów.
   ​UWAGA: Nasienie wróblowych ma jasnobrązowy kolor i zazwyczaj dość gęstą konsystencję. Białe lub ciemne substancje wydzielane z kloaki nie są nasieniem i mogą zanieczyścić próbkę. Pojawienie się niewielkiej ilości krwi na kloace lub zmieszanej z nasieniem jest zazwyczaj spowodowane zbyt dużym naciskiem podczas masażu.
6. W celu ekstrakcji DNA nasienie należy umieścić w probówce do mikrocentryfugi z 20 µL 1x PBS (pH 7.4). UWAGA: Nasienie przechowywane w 1x PBS nie nadaje się do sztucznego zapłodnienia, ale może być wykorzystane do późniejszej ekstrakcji DNA, jeśli jest przechowywane w temperaturze -80 °C. Roztwór PBS może być w temperaturze pokojowej lub schłodzony, lecz w momencie dodawania próbki nasienia musi być w stanie ciekłym.
   1. Obecność plemników w próbce należy potwierdzić, oglądając niewielką ilość rozcieńczonej próbki pod mikroskopem złożonym (Rysunek 3).
7. Rozcieńczone nasienie należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji.

2. Izolacja DNA z nasienia ptaków

UWAGA: Protokół ten został przetestowany z wieloma komercyjnymi zestawami do ekstrakcji DNA, jednak pomyślne wyniki uzyskano jedynie przy zastosowaniu jednego zestawu do DNA¹². Kroki zmodyfikowane względem protokołu producenta zestawu zostały oznaczone symbolem *.

1. Przygotować 1 M roztwór ditiotreitolu (DTT) w wodzie i wymieszać za pomocą wortexa.*
   1. Rozdzielić roztwór DTT na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Do każdej próbki przeznaczonej do ekstrakcji wymagane jest 10 µL roztworu 1 M DTT.*
2. Przygotować bufor zawierający 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 20 mM NaCL oraz 4% SDS. Do każdej próbki przeznaczonej do ekstrakcji wymagane jest 90 µL tego buforu.*
   1. Przechowywać bufor w temperaturze pokojowej. W przypadku wytrącenia osadu podgrzać do 56 °C w celu rozpuszczenia.*
3. Rozgrzać inkubator z wbudowaną kołysarką lub wytrząsarką do 65 °C.*
4. Bezpośrednio przed rozpoczęciem ekstrakcji, dla każdej próbki przeznaczonej do ekstrakcji, zmieszać 10 µL roztworu DTT z 90 µL buforu przygotowanego w kroku 2.2, np. 90 µL buforu oraz 10 µL roztworu DTT przy ekstrakcji 10 próbek. Mieszaninę tę nazwano buforem DTT-buffer.*
5. Do całej rozcieńczonej próbki nasienia dodać 70 µL 1x PBS i dobrze wymieszać za pomocą wortexa.*
6. Do próbki dodać 100 µL buforu DTT-buffer oraz 10 µL roztworu proteinazy K. Mieszać w vortexie przez 20 sekund, a następnie inkubować w rozgrzanym inkubatorze przez 1 godzinę na kołysarce lub wytrząsarce.*
7. Dodać 20 µL buforu AL oraz 200 µL świeżego EtOH (10%) i mieszać w vortexie przez 20 sekund.*
8. Przenieść całą próbkę do kolumny wiriówek i wirować przez 1 minutę przy 6,0 x g. Usunąć probówkę zbiorczą.
9. Umieścić kolumnę w nowej probówce i dodać 500 µL przygotowanego buforu AW1. Wirować przez 1 minutę przy 6,0 x g. Usunąć probówkę zbiorczą.
10. Umieścić kolumnę w nowej probówce i dodać 50 µL przygotowanego buforu AW2. Wirować przez 1 minutę przy 6,0 x g. Usunąć filtrat i ponownie umieścić kolumnę w probówce.
11. Wirować przez 3 minuty przy 20,0 x g. Usunąć probówkę zbiorczą i umieścić kolumnę w probówce do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL.
12. Nanieść pipetą 35 µL buforu AE bezpośrednio na membranę kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.*
13. Wirować przez 1 minutę przy 14,00 x g. Usunąć kolumnę wiriówek i przechowywać wyekstrahowane próbki w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Masaż kloaki oraz ekstrakcja DNA z zastosowaniem opisanego protokołu zostały przeprowadzone u kilku gatunków wróblowych oraz jednego gołębiowatego (Tabela 1). Obecność plemników w próbkach nasienia pobranych za pomocą masażu kloaki potwierdzono, oglądając niewielką ilość rozcieńczonych próbek pod mikroskopem złożonym przy powiększeniu 40X (Rysunek 3). Po wyekstrahowaniu DNA z próbek nasienia pobranych od wróbli domowych zgodnie z tutaj opisan...

Dyskusja

Opisujemy prostą i niezawodną metodę pobierania nasienia od małych i średnich ptaków w stanie czynnym rozrodczość oraz ekstrakcji DNA z plemników ptaków.

Opisany protokół ekstrakcji DNA nasienia jest zmodyfikowany z zestawu dla uproszczenia, ale został udoskonalony do stosowania na nasieniu ptaków. Plemniki są odporne na lizę przez standardowe chemikalia do ekstrakcji ^9,13, a próbki nasienia pobrane z wróblowych są dość małe (zwykle ki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurki kapilarne mikrohematokrytu	Fisherbrand	22-362566	Można użyć dowolnego dostawcy. Mniejsze probówki mogą być bardziej skuteczne w pobieraniu małych próbek nasienia, takich jak bardzo małe ptaki wróblowate, takie jak wróbel ćwierkający.
Probówki do mikrowirówek	Dowolna
1x PBS	Dowolna		Służy do przechowywania próbek nasienia przed ekstrakcją DNA.
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Baza Tris	Sigma-Aldrich	10708976001	Można użyć dowolnego dostawcy.
EDTA	Sigma-Aldrich	1233508	Można skorzystać z dowolnego dostawcy.
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	Można użyć dowolnego dostawcy.
SDS	Sigma-Aldrich	1614363	Można skorzystać z dowolnego dostawcy.
Zestaw QIAamp DNA micro	Qiagen	56304	Zalecany jest szczególnie zestaw Qiagen QIAamp DNA micro. Ten protokół ekstrakcji DNA został wypróbowany z innymi komercyjnymi zestawami, ale z niewielkim powodzeniem. Przyczyny tego są nam nieznane.