Artykuł metodologiczny

Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

DOI:

10.3791/55331

⸱

17 maja 2017

 , 
1Department of Plant Sciences, University of Oxford

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj jest prosta technika konfokalnego obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości rozwoju korzeni i hipokotylu przez okres do 3 dni przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej i perfluorodekaliny jako medium immersyjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka aspektów rozwoju roślin, takich jak morfogeneza korzeni bocznych, występuje w odstępach kilku dni. Aby zbadać podstawowe procesy komórkowe i subkomórkowe, potrzebne są strategie mikroskopii poklatkowej o wysokiej rozdzielczości, które zachowują warunki fizjologiczne. Tkanki roślinne muszą mieć odpowiednie zaopatrzenie w składniki odżywcze i wodę z ciągłą wymianą gazową, ale po zanurzeniu i unieruchomieniu pod szkiełkiem nakrywkowym są szczególnie podatne na anoksję. Jedną ze strategii, która została z powodzeniem zastosowana, jest zastosowanie systemu perfuzyjnego w celu utrzymania stałego dopływu tlenu i składników odżywczych. Jednak takie układy mogą być skomplikowane, uciążliwe i wymagać specjalistycznego sprzętu. Przedstawiono alternatywną strategię dla prostego systemu obrazowania wykorzystującego perfluorodekalinę jako medium immersyjne. System ten jest łatwy w konfiguracji, wymaga minimalnego sprzętu i można go łatwo zamontować na stoliku mikroskopowym, co pozwala na ustawienie i obrazowanie kilku komór obrazowania równolegle. W tym systemie tempo wzrostu korzeni bocznych jest nie do odróżnienia od tempa wzrostu w standardowych warunkach na płytkach agarowych przez pierwsze dwa dni, a wzrost korzeni bocznych trwa w zmniejszonym tempie przez co najmniej kolejny dzień. Tkanki roślinne są zaopatrywane w składniki odżywcze za pośrednictwem płyty agarowej, która może być również używana do podawania szeregu związków farmakologicznych. System został stworzony do monitorowania rozwoju korzeni bocznych, ale można go łatwo dostosować do obrazowania innych organów roślinnych, takich jak hipokotyle i korzenie pierwotne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby badać procesy komórkowe i subkomórkowe, które leżą u podstaw rozwoju roślin, rośnie zapotrzebowanie na długoterminowe strategie obrazowania poklatkowego w wysokiej rozdzielczości. Kluczowym wyzwaniem w takich eksperymentach obrazowych jest utrzymanie warunków fizjologicznych, w tym wystarczającej wymiany gazowej oraz zaopatrzenia w wodę i składniki odżywcze1,2,3. Aby wykorzystać obiektywy o dużych aperturach numerycznych w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości optycznej, próbki powinny być umieszczone w bliskiej odległości i zorientowane równolegle do szkiełka nakrywkowego. Ruch w kierunkach x, y i z powinien być idealnie minimalny podczas obrazowania.

Podczas gdy siewki są często montowane w wodzie lub roztworze wodnym do krótkotrwałego obrazowania, woda ma niską zdolność do rozpuszczania CO2 i O2 (odpowiednio 1,54 mg/ml i 0,04 mg/ml w temperaturze 20 °C, 0,1 MPa)4, co czyni ją nieodpowiednią do długich eksperymentów poklatkowych. Jednym z rozwiązań tego problemu są systemy perfuzyjne, które utrzymują stały poziom tlenu i składników odżywczych, a zostały opracowane zarówno dla konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM)1,2,3, jak i mikroskopii z użyciem lekkiej blachy (LSM)5. Systemy takie jak RootChip2 i RootArray3 zostały zaprojektowane specjalnie do obrazowania poklatkowego rozwijających się korzeni i obejmują kiełkowanie nasion w specjalnie zbudowanym urządzeniu z wieloma próbkami. Układy te zapewniają minimalne zakłócenia mechaniczne i są przeznaczone do równoległej analizy wielu siewek, ale nie są zoptymalizowane pod kątem obrazowania struktur subkomórkowych. Calder i współpracownicy zaprojektowali bardziej skomplikowaną komorę obrazowania opartą na perfuzji, zoptymalizowaną do obrazowania struktur subkomórkowych, w których próbka jest utrzymywana w pozycji przez siatkę, aby umożliwić użycie soczewek zanurzeniowych o dużym powiększeniu1.

Przedstawione tutaj jest alternatywne, proste rozwiązanie tego problemu, które nie opiera się na systemach perfuzyjnych, ale wykorzystuje perfluorodekalinę (PFD), perfluorowęglowodór, który ostatnio zyskał popularność jako podłoże montażowe do obrazowania Arabidopsis6,7,8. W takich zastosowaniach wysoka zdolność PFD do rozpuszczania CO2 i O2 (1,9 g / ml dla O2 w PFD w porównaniu do 0,04 mg / ml w wodzie) 9, umożliwia wymianę gazową przez zanurzoną tkankę. Ponadto PFD jest niefluorescencyjny, a jego współczynnik załamania światła (1,313) jest porównywalny z indeksem wody (1,333) i jest bliższy cytozolowi (~1,4) niż powietrzu (1,000)6. Doniesiono, że perfluorowęglowodory mają minimalny wpływ fizjologiczny na różne rośliny i tkanki roślinne6, przy czym nasiona rzodkiewki łatwo kiełkują po zanurzeniu w PFD i wykazują normalny wzrost i rozwój przez co najmniej dwa pełne dni, gdy są dostarczane z wodą10. Podobne obserwacje poczyniono w odniesieniu do kiełkujących nasion rzodkiewnika (Arabidopsis6. Opierając się na stymulowanym rozpraszaniu Ramana w celu bezpośredniego zobrazowania rozmieszczenia PFD w tkankach liści Arabidopsis po infiltracji, Littlejohn i współpracownicy doszli do wniosku, że PFD prawdopodobnie nie jest pobierany przez żywe komórki8. PFD był wcześniej używany głównie do obrazowania tkanek powietrznych, gdzie znacznie zwiększa głębokość obrazowania, ponieważ łatwo infiltruje przestrzenie powietrzne ze względu na niskie napięcie powierzchniowe6. W tym przypadku PFD jest stosowany do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwijających się korzeni bocznych. W tej konfiguracji jedną lub więcej sadzonek umieszcza się na płycie pożywki wzrostowej zestalonej agarem i zanurza w PFD. PFD umożliwia wymianę gazową w komorze obrazowania, zapobiegając anoksji. PFD jest wysoce lotny, więc jest zatrzymywany przez uszczelkę z gumy poli(dimetylosiloksanowej), która ma również wysoką przepuszczalność gazów (1,5 x 10-12 pmol m-1 s-1 Pa-1 dla CO2)11. Składniki odżywcze i woda są dostarczane przez płytę pożywki zestaloną z agarem. W tym samym czasie ta płyta agarowa delikatnie dociska korzeń do szkiełka nakrywkowego, ustalając w ten sposób jego względne położenie w komorze obrazowania i umożliwiając stosowanie soczewek zanurzeniowych w wodzie o wysokiej rozdzielczości. Ponadto płyta agarowa może być używana do podawania szeregu zabiegów farmakologicznych, w tym deksametazonu, oryzaliny i izoksabenu. Komory obrazowania można montować w dużych ilościach ze standardowych szkiełek mikroskopowych przy użyciu minimalnego sprzętu. Komory obrazowania zostały opracowane i scharakteryzowane w celu badania rozwoju korzeni bocznych, ale można je przystosować do obrazowania innych narządów siewek, takich jak pierwotne wierzchołki korzeni i hipokotyle.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie komory

  1. Za pomocą noża do szkła wytnij paski o szerokości 3 mm od końca szkiełka mikroskopowego o grubości 1 mm. Używając super-kleju cyjanoakrylowego lub taśmy dwustronnej, przyklej te szklane paski w odległości około 45 mm od siebie na szerokości drugiego szkiełka mikroskopowego (Rysunek 1A). Wymagane jest jedno szkiełko na komorę oraz dodatkowe szkiełka do nalewania płyt agarowych (z jednego szkiełka można uzyskać 2-3 płytki agarowe). Slajdy mogą być ponownie wykorzystane.
  2. Pomiędzy szklanymi paskami uformuj uszczelkę o identycznej wysokości z gumy poli(dimetylosiloksanowej) przepuszczanej przez gaz. Umieść kulkę gumy poli(dimetylosiloksanowej) na szkiełku (Rysunek 1B), zwilż drugie szkiełko niewielką ilością 100% bezwzględnego etanolu i spłaszcz kulkę gumy poli(dimetylosiloksanowej) drugim szkiełkiem, aż osiągnie wysokość pasków szkła (Rysunek 1C).
    1. W razie potrzeby odetnij nadmiar gumy poli(dimetylosiloksanowej) żyletką i powtórz spłaszczanie.
  3. Za pomocą odpowiedniego noża lub żyletki zwilżonej absolutnym etanolem usuń wewnętrzną część gumy poli(dimetylosiloksanowej), aby utworzyć wgłębienie, w którym później znajdzie się sadzonka i płyta agarowa (Rysunek 1D).
  4. Ostrożnie przytnij żel żyletką, aby utworzyć uszczelkę o końcowej grubości ścianki około 2 mm (Rysunek 1E). Przepuszczalność gazów przez barierę z poli(dimetylosilaksanu) jest niezależna od grubości powyżej 50 μm11.

2. Tworzenie zastygłej płyty z agarem

  1. Na szkiełku mikroskopowym z dwoma szklanymi paskami umieścić szkiełko nakrywkowe (22 mm x 50 mm) tak, aby spoczywało na obu paskach szkła.
  2. Stopioną pipetą pożywkę wzrostową Murashige i Skoog o połowie mocy zawierającą 1% sacharozy i 1,5% agaru (1/2 MS) należy umieścić pipetą w powstałej przestrzeni poniżej szkiełka nakrywkowego, aż to ostatnie zostanie całkowicie wypełnione (około 1 ml całkowitej objętości) i pozostawić do zastygnięcia agaru (około 5 min).
    Uwaga: Związki farmakologiczne można podawać przez płytę agarową, dodając odpowiednie stężenia do płynnego podłoża przed wylaniem płyty. Zostało to pomyślnie przetestowane dla deksametazonu12, izoksabenu, 2,6-dichlorobenzonitrylu (DCB), oryzaliny i latrunkuliny B.

3. Kończenie konfiguracji komory

  1. Powietrze równoważy PFD, potrząsając niewielką objętością PFD w rurce7. Dodać niewielką ilość (około 200 μl) PFD o równowadze powietrznej do studzienki uszczelki żelowej, ale nie napełniać całkowicie komory. Ten PFD pomoże uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod płytą agarową podczas jej umieszczania w komorze.
  2. Usuń szkiełko nakrywkowe z płyty agarowej (w kroku 2.2 powyżej) i użyj żyletki, aby odciąć część o pożądanym rozmiarze i kształcie. Następnie umieść go w studzience uszczelki żelowej (Rysunek 1F). Wokół uszczelki powinna być szczelina 2-4 mm.
  3. Całkowicie napełnij komorę PFD równoważonym powietrzem.
  4. Umieść jedną lub więcej sadzonek A. thaliana (do 3 sadzonek do obrazowania przez 2-3 dni) na płycie agarowej z liścieniami i hipokotylem zwisającymi z krawędzi, unoszącymi się w PFD (Rysunek 1G).
  5. Aby uzyskać sadzonki, wysterylizuj nasiona 70% etanolem, posadź na 1/2 MS pożywki uzupełnionej 1% sacharozy i 0,8% agaru, rozwarstwiaj przez 2-4 dni w temperaturze 4 °C i hoduj na pionowo ustawionych płytkach w temperaturze 22 °C w 16 godzin światła / 8 godzin ciemności. W przypadku obrazowania korzeni bocznych hoduj rośliny przez 7-10 dni przed przeniesieniem do komór obrazowania.
  6. Aby zamknąć komorę, nałóż szkiełko nakrywkowe dopasowane do układu optycznego obiektywu, delikatnie dociskając je krawędzią szkiełka mikroskopowego, aż szkiełko nakrywkowe oprze się na obu paskach szkła (Rysunek 1H).
  7. W razie potrzeby zabezpiecz szkiełko nakrywkowe paskami taśmy chirurgicznej z mikroporami o szerokości 1,25 cm, przeciętymi na pół wzdłuż na każdym końcu (Rysunek 1I). Pozostawić próbkę do osiadania przez około 30 minut przed obrazowaniem. Minimalizuje to ruch próbki podczas obrazowania.
  8. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu pionowego, aby utrzymać kontrolowane podłoże do wzrostu. Używaj obiektywów 20X/0,7NA lub 63X/1,2NA CS2.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzenie boczne rosną w fizjologicznym tempie w komorach obrazowania.

Długości korzeni bocznych roślin w komorach obrazowania były mierzone w odstępach godzinowych (Rysunek 2A, po lewej, Film 1, n = 23) i tempo wzrostu porównano z tempem wzrostu korzeni bocznych rosnących na standardowych płytkach Petriego zawierających to samo zestalone podłoże agarowe (Rysunek 2A, po prawej, film 2, n = 23). Tempo wzrostu może się znacznie różnić między korzeniami bocznymi, przy czym długość korzenia jest jednym z decydujących czynników ze względu na coraz dłuższe strefy wzrostu i proliferacji13. W związku z tym wybrano zestawy korzeni bocznych tak, aby reprezentowały korzenie o różnych długościach początkowych (od 50 μm do 1150 μm) zarówno w komorze obrazowania, jak i na płytce agarowej. Średnia długość korzenia bocznego na początku eksperymentu była podobna w każdym zestawie (odpowiednio 439 i 442 μm dla komór obrazowania i płytek). W analizowanym przedziale czasowym 27 godzin boczny wzrost korzeni był w przybliżeniu liniowy zarówno w komorach obrazowania, jak i na płytkach, ze średnią szybkością wzrostu 52 μm/h (R2 = 0,997) na płytkach i 51 μm/h w komorach obrazowania (R2 = 0,993) (Rysunek 2B). Tempo wzrostu poszczególnych korzeni bocznych było bardzo zmienne zarówno na płytkach, jak i w komorach obrazowania (Rysunek 2C), w zakresie od 17 μm/h do 82 μm/h w komorach obrazowania i od 13 μm/h do 87 μm/h na płytkach. Podczas gdy tempo wzrostu na ogół wzrastało wraz z długością korzenia, tempo wzrostu nadal różniło się znacznie między korzeniami o podobnej długości, ale wariancja była podobna w komorach obrazowania i na płytkach.

Korzenie boczne mnożą się w komorach obrazowania i mogą być obrazowane przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej.

Korzenie boczne współwyrażające marker błony plazmatycznej NPSN12-YFP14 i marker mikrotubul UBQ1::mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6)15 zostały zobrazowane przez CLSM10 w odstępach 1 godziny w celu udokumentowania zachowania mikrotubul podczas proliferacji komórek w komorach obrazowania (Rysunek 2D, film 3). W tych komorach korzenie boczne były bardzo stabilne w swoim położeniu na osiach x, y i z, co pozwalało na pozyskiwanie ciągłych poklatkowych stosów konfokalnych przez kilka godzin. Komórki merystematyczne stale się namnażały, co widać po tworzeniu prążków preprofazowych (Rysunek 2D, zielone strzałki), wrzecion mitotycznych (Figura 2D, białe strzałki) i fragmoplastów (Figura 2D, niebieskie strzałki). Podobnie jak w przypadku siewek na płytkach Petriego, w pełni wydłużone komórki korzeniowe w komorach obrazowania zainicjowały włośniki korzeniowe (Rysunek 2A, Rysunek 2D, groty strzałek), co wskazuje dalej, że rozwój w komorach obrazowania przebiegał zgodnie z oczekiwaniami. Aby zapewnić szerokie pole widzenia, obrazy w Rysunek 2D uzyskano za pomocą obiektywu 20x/0,7 NA. Możliwe było również uzyskanie obrazów korzeni bocznych w wysokiej rozdzielczości przy użyciu obiektywu zanurzeniowego w wodzie 63x/1,2 NA o dużej aperturze numerycznej (Rysunek 2E).

Wzrost korzeni bocznych utrzymuje się w komorach obrazowania przez okres do trzech dni.

Aby zbadać, jak długie komory obrazowania mogą wspierać boczny wzrost korzeni w tempie fizjologicznym, określono ilościowo długość korzeni bocznych w komorach obrazowania (n = 27) i na płytkach (n = 33) po 0 godzinach, 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach. Wybrane korzenie były krótsze niż 200 μm po 0 godzinach, ze średnią długością korzenia bocznego 117 μm w komorach obrazowania i 121 μm na płytkach. Ponieważ krótsze korzenie rosną średnio wolniej (Rysunek 2C), rzadziej wyrastały poza krawędź płyty agarowej i były łatwiejsze do zobrazowania. Średni wzrost wszystkich korzeni bocznych nie różnił się istotnie w komorach obrazowania w porównaniu z płytkami Petriego w ciągu pierwszych 48 godzin (Ryc. 3A). Jednak średni wzrost został znacznie zmniejszony między 48 a 72 godzinami (Rysunek 3A). Podczas gdy tempo wzrostu wydaje się generalnie zwalniać w komorach obrazowania po 48 godzinach, tempo wzrostu między osobnikami pozostaje bardzo zmienne (Rysunek 3B, 3C), co oznacza, że istnieje znaczny podzbiór korzeni bocznych, który rośnie w porównywalnym tempie na płytkach i w komorach przez cały okres wzrostu 72 godzin. 23 z 33 korzeni bocznych rosnących na płytkach (69,7%) osiąga długość z dokładnością do jednego odchylenia standardowego średniej długości po 72 godzinach (między 927 a 3 163 μm, Rysunek 3B, czerwony). 10 z 27 (37,0%) korzeni bocznych w komorach obrazowania osiąga długość w tym przedziale (Ryc. 3B, czerwony).

Komory obrazowania można łatwo dostosować do starszych korzeni bocznych, korzeni pierwotnych i hipokotylów.

Jednym z ograniczeń oryginalnego projektu komory obrazowania było to, że podczas gdy sztywna płyta agarowa zapewniała pewien opór mechaniczny, grawitropowo rosnące korzenie w końcu przeniknęły przez płytę agarową, powodując utratę jakości obrazu (Rysunek 4B) i wzrost poza zasięg roboczy soczewek o wysokiej NA, nawet przy stosunkowo dużym zasięgu roboczym (0,3 mm) 63X/1,3 NA CS2. Młode korzenie boczne nie mają komórek kolumelli zawierających statlit, wymaganych do grawitropizmu17, więc początkowo rosły równolegle do szkiełka nakrywkowego w komorach obrazowania (Ryc. 2E). W miarę wydłużania się i tworzenia się kolumelli i statolitów, korzenie boczne wykazują rosnący dodatni grawitropizm, podczas gdy korzenie pierwotne wykazują silną odpowiedź grawitropową od momentu kiełkowania. Ogranicza to do kilku godzin okres, w którym można obrazować korzenie pierwotne, i poważnie ogranicza początkową długość korzeni bocznych, które można obrazować w sposób ciągły przez 48 godzin lub dłużej. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, komora została zmodyfikowana w taki sposób, że wzrost jest utrzymywany równolegle do szkiełka nakrywkowego przez celulozową membranę celofanową, która działa jak bariera penetracyjna na powierzchni płyty agarowej (Rysunek 4A). Początkowe próby użycia 1,5% maty agarowej spowodowały zmniejszony wzrost korzeni w ciągu pierwszych 24 godzin, być może z powodu naprężeń mechanicznych. Zbadano niższe stężenia agaru w matce i stwierdzono, że w komorach z płytą zawierającą 0,8% agaru i folii celulozowej, tempo wzrostu młodych korzeni bocznych nie różniło się znacząco od tempa wzrostu w konwencjonalnych komorach przez pierwsze 48 godzin. Dla 0-24 h średni wzrost korzeni w komorach celulozowych i konwencjonalnych wynosił odpowiednio 242 μm i 262 μm (p = 0,78 t-Testu), a dla 24-48 h wynosił odpowiednio 330 μm i 355μm1 (p = 0,67 t-Test Studenta); n = 12 i n = 11, odpowiednio. Taki układ skutecznie zapobiegał odrastaniu korzeni bocznych od szkiełka nakrywkowego do agaru, a także umożliwił obrazowanie korzeni pierwotnych przez okres do 48 godzin (Ryc. 4C).

Aby sprawdzić, czy komory obrazowania mogą być przystosowane do organów innych niż korzenie, wybrano hipokotyle Arabidopsis. Hipokotyle są znacznie grubsze niż korzenie, więc w konwencjonalnej komorze obrazowania najwyższe komórki były ściskane do szkiełka nakrywkowego, co prowadziło do deformacji. W związku z tym opracowano alternatywny projekt wykorzystujący szkiełka wnękowe, które zawierają owalne wgłębienie w środku (Rysunek 4D). W tej konfiguracji, płyta agaru o grubości 1 mm (przygotowana jak w 2.2 powyżej) została umieszczona z jednym końcem wystającym na kilka mm w głąb wnęki szkiełka (Rysunek 4D). Hipokotyle umieszczono nad wgłębieniem w szkiełku, natomiast korzeń umieszczono powyżej części poziomej. Zapewniło to, że sadzonka została unieruchomiona w przestrzeni przez korzeń, ale hipokotyl nie został zgnieciony. Podczas gdy tempo wzrostu w komorach w porównaniu z płytkami nie było systematycznie określane ilościowo, hipokotyle w komorach obrazowania wykazywały dobrze opisaną falę wzrostu podłużnego migrującego w górę hipokotylu (Rysunek 4E, 4F)16.

figure-results-1
Rysunek 1: Montaż komory obrazowania. Wszystkie szczegóły są opisane w tekście. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Korzenie boczne rosną w warunkach fizjologicznych w komorach obrazowania. orazRozwój korzenia bocznego rzodkiewnika w komorze obrazowej (po lewej) i na płytce (po prawej) przez 25 godzin (światło stałe, inkubacja pozioma, obrazowanie symultaniczne). Podziałka = 200 μm. (B) Wykres przedstawiający długości korzeni bocznych w ciągu 27 godzin (mierzone w odstępach 1 godzin) korzeni bocznych, jak pokazano w (A). Pojedyncze korzenie wykreślone na szaro (n = 23 dla płytek i komór obrazowania), średnia długość jako czerwone kółka. Słupki błędów = 1 SD. Czerwona linia to dopasowanie liniowe przez średnie długości. (C) Wykres przedstawiający średnią szybkość wzrostu dla wszystkich korzeni bocznych pokazanych w (B) w stosunku do ich początkowej długości. (D) Projekcje maksymalnej intensywności stosów konfokalnych 3D uzyskanych z korzeni bocznych wyrażających NPSN12-YFP i RFP-TUB6 w kolejnych punktach czasowych. Wstawka: Powiększenie obszaru ramkowego. Zielone strzałki: pasma preprofazy; białe strzałki: wrzeciona mitotyczne; niebieskie strzałki: fragmoplasty; Groty strzał: włośniki. (E) projekcje maksymalnej intensywności obrazów o wysokiej rozdzielczości uzyskanych z młodego korzenia bocznego linii transgenicznej pokazanej w (D) przy użyciu obiektywu 63X/1,2 NA i próbkowania Nyquista (wymiary piksela 77 nm x 77 nm) po 0 i 16 godzinach; gwiazdki lokalizują identyczne komórki w każdym punkcie czasowym; Strzałka wskazuje komórkę, która dzieli się od 0 godz. do 16 godz. Podziałka = 50 μm (A-C); 20 μm (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Długotrwały rozwój korzeni bocznych w komorach obrazowania. (A) Wykres przedstawiający średni bezwzględny przyrost korzeni w trzech kolejnych odstępach 24 godzin w komorach obrazowania w porównaniu z płytkami. n.s. oznacza p >0,05; Wskazuje p <0,001 (test t-Studenta). n = 33 (płytki) i n = 27 (komory obrazowania). (B) Wykres przedstawiający boczne długości korzeni w kolejnych punktach czasowych na wszystkich korzeniach użytych w (A). Czerwony: wszystkie korzenie boczne o końcowej długości w granicach 1 SD średniej wszystkich korzeni bocznych wyhodowanych na płytkach (między 927 a 3163 μm). (C) Projekcje maksymalnej intensywności reprezentatywnych 3D stosów konfokalnych markera błony plazmatycznej NPSN12-YFP w korzeniach bocznych, uzyskane w kolejnych punktach czasowych w ciągu 72 godzin. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Komory obrazowania mogą być dostosowane do innych organów roślinnych. (A-C) Adaptacja komory obrazowania do korzeni pierwotnych. (A) Schemat konstrukcji komory obrazowania. Jest to identyczne ze standardowym projektem (Rysunek 1) z wyjątkiem dwóch modyfikacji: płyta pożywki MS zawiera 0,8% agaru zamiast 1,5%, a folia celulozowa (czerwona) jest umieszczana między agarem a rośliną, aby zapobiec wzrostowi w agarze. (B) Projekcje maksymalnej intensywności XY (na górze) i XZ (na dole) reprezentatywnych stosów konfokalnych 3D markera błony plazmatycznej NPSN12-YFP w pierwotnym korzeniu 7-dniowej sadzonki zobrazowanej po 0 godzinach i 48 godzinach w konwencjonalnej komorze obrazowania. Zwróć uwagę, że korzeń wrasta w agar ze względu na jego reakcję grawitropową. (C) Projekcje XY (na górze) i XZ (na dole) maksymalnej intensywności reprezentatywnych konfokalnych stosów 3D markera błony plazmatycznej NPSN12-YFP w pierwotnym korzeniu siedmiodniowej sadzonki zobrazowanej po 0 godzinie i 48 godzinie w komorze obrazowania z folią celulozową. Przed nałożeniem folia celulozowa została wysterylizowana w 80% etanolu i nasączona płynnym 1/2 MS pożywki. Należy pamiętać, że zapobiega się grawitropowemu wzrostowi korzenia do agaru. (D-F) Adaptacja komory obrazowania dla hipokotylów. (D) Schemat przedstawiający konstrukcję komory obrazowania hipokotylu. Uszczelka z gumy poli(dimetylosiloksanowej) (szara) jest produkowana na szkiełku wnękowym między dwoma paskami szklanymi (żółta). Na szkiełku umieszcza się płytę z 1,5% agaru o równej grubości (beżową), częściowo sięgającą do wnęki. Komora wypełniona jest PFD (kolor niebieski). Sadzonki umieszcza się na płycie agarowej tak, że hipokotyl zajmuje nachylony w dół obszar płyty agarowej w jamie, podczas gdy korzeń jest umieszczony w poziomej części agaru. Komora zamykana jest szkiełkiem nakrywkowym. (E) Projekcje maksymalnej intensywności reprezentatywnych 3D stosów konfokalnych markera błony plazmatycznej NPSN12-YFP w hipokotylu dwudniowej sadzonki zobrazowane przez 48 godzin w kolejnych punktach czasowych. (F) Podłużny wzrost w dwóch kolejnych przedziałach czasowych pojedynczych komórek wzdłuż osi od podstawy do wierzchołka (względne pozycje w 0 h wzdłuż osi pokazanej w E) hipokotylu pokazanego w (E). Zwróć uwagę na wcześniej opisaną falę wzrostu migrującą w górę klasy hipokotyl16. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Film 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

figure-results-6
Film 2: Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

figure-results-7
Film 3: Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda jest prostą strategią obrazowania konfokalnego w wysokiej rozdzielczości rozwijających się korzeni bocznych przez dwa i do trzech dni. Przez okresy do 48 h nie zaobserwowano niekorzystnego wpływu systemu obrazowania na rozwój korzeni bocznych. Po 48 godzinach średni wzrost korzeni bocznych zaczął zwalniać, chociaż znaczna część korzeni (37%) nadal rosła w tempie porównywalnym ze średnim wzrostem korzeni na płytkach. Dlatego poprzez obrazowanie wystarczająco dużej liczby korzeni można wykluczyć korzenie, których wzrost spowalnia po 48 godzinach. Nie przeprowadzano systematycznych badań komór obrazowych przez okres dłuższy niż 72 godziny, ale w przypadku pożądanych dłuższych okresów obrazowania zalecane są alternatywne strategie. Komory obrazowania mogą być pozostawione na stoliku mikroskopu w sposób ciągły, jeśli zapewnione są odpowiednie warunki środowiskowe, lub przeniesione do urządzenia do hodowli i okresowo zwracane do mikroskopu. Pozwala to na równoległe obrazowanie wielu komór.

Jedną z zalet opisywanych tutaj komór jest to, że korzenie boczne są zamocowane w swojej pozycji i mogą być obrazowane za pomocą soczewek zanurzeniowych o wysokiej rozdzielczości. Stabilność przestrzenna zależy krytycznie od stężenia agaru zastosowanego w nośnej płycie agarowej. Początkowo przetestowano zakres różnych stężeń od 0,8% agaru do 2% agaru, ujawniając, że wysokie stężenia w tym zakresie stabilnie unieruchomiły korzenie w przestrzeni, ale wzrost korzeni spowolnił szybciej, a niektóre korzenie wykazywały oznaki naprężeń mechanicznych, w tym zmniejszone wydłużenie komórek. W przeciwieństwie do tego, niskie stężenia agaru nie zapewniały wymaganego wsparcia, a korzenie dryfowały w x, y i z podczas obrazowania. Optymalna 1,5% płyta agarowa ustala pozycję próbki bez niekorzystnych skutków mechanicznych. W tych warunkach, po osiedleniu się w ciągu pierwszych 30 minut, korzenie są stabilne przez wiele godzin, co pozwala na nocne pozyskiwanie danych. Podczas pozyskiwania danych 4D, zakresy stosów z były zwykle ujęte w nawiasy przez dodatkowe 5-10 μm, ale miało to głównie na celu dostosowanie się do wzrostu korzeni bocznych poza płaszczyzną, a nie dryfu z lub chybotania. Chociaż standardowe stężenie agaru zapewnia pewną odporność na penetrację, korzenie rosnące grawitropowo w końcu przenikną do agaru. Jednak dzięki niewielkiej modyfikacji komory obrazowania, wzrost korzeni mógł być utrzymany równolegle do szkiełka nakrywkowego, co pozwoliło na obrazowanie starszych korzeni bocznych i korzeni pierwotnych. Co więcej, podstawową komorę obrazowania można łatwo dostosować do hipokotylów. Hipokotyle swobodniej unoszą się w tym układzie, dlatego wspornik osi Z do akwizycji obrazu został zwiększony zwykle do około 20 μm. W tym badaniu przez cały czas używano mikroskopu pionowego, który pozwolił na kontrolowanie właściwości podłoża. Komora obrazowania może być przystosowana do konfiguracji mikroskopu odwróconego, ale konieczne będzie oszacowanie zależnego od czasu wpływu sztywnego szkiełka nakrywkowego na narządy przechwytujące.

Littlejohn i współpracownicy zwrócili uwagę, że PFD sam w sobie nie rozpuszcza łatwo cząsteczek biologicznych, co oznacza, że nie może być używany bezpośrednio do dostarczania związków farmakologicznych. Problem ten został rozwiązany poprzez dostarczanie takich związków przez płytę zestalonej pożywki wzrostowej, na której spoczywa płyta agarowa. Podczas gdy systemy perfuzyjne pozostaną metodą z wyboru w eksperymentach z wymywaniem, komora obrazowania jest z powodzeniem stosowana do podawania deksametazonu12 i innych związków. Jedna uwaga, podczas gdy ten artykuł był w przygotowaniu, von Wagenheimi współpracownicy opisali komorę do obrazowania rozwoju korzeni bocznych za pomocą mikroskopii świetlnej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Prof. Geoffreyowi Wasteneysowi, University of British Columbia, za wyrażenie ziarna RFP-TUB6 oraz anonimowemu recenzentowi za pomocne poprawki. Jesteśmy wdzięczni prof. Hugh Dickinsonowi za zwrócenie uwagi na możliwość stosowania folii celulozowej jako podpory mechanicznej oraz Johnowi Bakerowi za fotografię. Praca ta była wspierana przez granty badawcze BBSRC BB/G013993/1 i BB/D004055/1 dla I.M. oraz nagrodę BBSRC Doctoral Training Award i stypendium Clarendon dla C.K.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PerfluorodekalinaF2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, Wielka BrytaniaFLUTEC PP6
Guma poli(dimetylosiloksan) Zaopatrzenie biologiczne Karoliny; Burlington, NC, USAPozycja # 132700Carolina
Szkiełka mikroskopowe z żelem obserwacyjnymVWR International Ltd, Lutterworth, UK10118-600Wnęka ma średnicę 13 mm i głębokość 0,2-0,4 mm. Prawdopodobnie wystarczy dowolny szkiełko wnękowe
Klej cyjanoakrylowyLoctite604753Prawdopodobnie wystarczy dowolny "super-klej" odpowiedni do szkła
Celulozowa membrana celofanowaAA Packaging Limited, Preston, Wielka BrytaniaFolia celulozowa 325P; Tarcza 80 mm

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22(2015).
  2. Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
  3. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
  4. Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
  5. Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
  6. Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
  7. Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
  8. Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140(2014).
  9. Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
  10. Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
  11. Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
  12. Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
  13. Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
  14. Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
  15. Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430(2011).
  16. Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
  17. Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
  18. von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044(2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie z u yciem perfluorodekalinyrozw j organ w ro linnychprzygotowanie p ytek agarowychkonstrukcja uszczelki z PDMSmonta szkie ek przedmiotowychwzrost korzeni bocznychobrazowanie pods o cabariera z membrany celulozowejmikroskopia time lapse

Powiązane artykuły