Infuzja przewodu trzustkowego jest ważną techniką, która pozwala na śledzenie linii, wprowadzanie genów i celowanie specyficzne dla linii komórkowych. Przedstawiono tutaj technikę infuzji przewodu trzustkowego do dostarczania leków i wirusów do komórek trzustki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wlew z przewodu trzustkowego: skuteczna i selektywna metoda dostarczania leków i wirusów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Trzustka jest dwufunkcyjnym organem zawierającym zarówno składniki endokrynne, jak i zewnątrzwydzielnicze. Trzustkę może dotykać wiele patologii, w tym cukrzyca, zapalenie trzustki i rak trzustki. Wszystkie te trzy choroby wyznaczają aktywne obszary badań, nie tylko w celu opracowania natychmiastowej terapii, ale także w celu lepszego zrozumienia ich patofizjologii. Istnieje niewiele narzędzi do rozwijania tych obszarów badań. Wlew do przewodu trzustkowego jest ważną techniką, która może pozwolić na śledzenie linii, wprowadzanie genów i celowanie specyficzne dla linii komórkowej. Technika ta wymaga skomplikowanego wypreparowania drugiej części dwunastnicy i bańki, a następnie niedrożności przewodu żółciowego i kaniulacji przewodu trzustkowego. Chociaż technika ta jest początkowo trudna technicznie, zastosowań jest niezliczona ilość. Niejasności w szczegółach procedury między grupami uwypukliły potrzebę wprowadzenia standardowego protokołu. W pracy opisano ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) w trzustce po infuzji przewodu trzustkowego wektora wirusowego wyrażającego GFP w porównaniu z pozorowaną operacją. Napar, a tym samym ekspresja, jest specyficzna dla trzustki, bez ekspresji obecnej w żadnym innym typie tkanki.
Wprowadzenie
Trzustka jest dwufunkcyjnym organem, zawierającym zarówno składniki endokrynne, jak i zewnątrzwydzielnicze. Trzustkę może dotykać wiele patologii, w tym cukrzyca, zapalenie trzustki i rak trzustki1. Wszystkie te trzy choroby wyznaczają aktywne obszary badań, nie tylko w celu opracowania natychmiastowej terapii, ale także w celu lepszego zrozumienia ich patofizjologii.
Ukierunkowana metoda terapeutyczna byłaby korzystna. Opracowaliśmy technikę infuzji przewodu trzustkowego, która jest skuteczną i selektywną metodą dostarczania leków i wirusów do komórek trzustki. W tym modelu przewód trzustkowy jest selektywnie kaniulowany, a wspólny przewód żółciowy jest niedrożny, co pozwala na dostarczenie wyłącznie do trzustki.
Ta technika może pozwolić na śledzenie linii określonych typów komórek, aby dokładniej wyjaśnić szlaki rozwojowe ważne dla rozwoju i patologii trzustki2,3. Różne promotory w wektorach wirusowych pozwalają na specyficzne ukierunkowanie linii komórkowych i wprowadzenie genów do tych linii komórkowych4,5. Praca ta demonstruje ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) w trzustce po infuzji przewodu trzustkowego wektora wirusowego wyrażającego GFP w porównaniu z pozorowaną operacją.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań i Opieki nad Zwierzętami w Szpitalu Dziecięcym w Pittsburghu oraz Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Wziewny izofluran (1 - 3% w leczeniu podtrzymującym i do 5% w indukcji) należy podawać przez stożek nosowy do odpowiedniego poziomu znieczulenia. Monitoruj adekwatność znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi kleszczami. Brak odpowiedzi jest uważany za wystarczający i należy pamiętać, aby nie przesadzać z lekami, ponieważ może wystąpić depresja oddechowa.
- Umieść zwierzę na plecach na stoliku mikroskopu preparacyjnego, z brzuchem wyśrodkowanym w kierunku obiektywu. Unieruchomić zwierzę taśmą chirurgiczną. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Nałóż gładką, grubą warstwę kremu do depilacji i pozostaw go na miejscu na 3 minuty. Sprawdź mały obszar do depilacji. Delikatnie zetrzyj krem i włosy gazą nasączoną 70% etanolem.
- Oczyść i zdezynfekuj brzuch zwierzęcia, przecierając go gazą nasączoną 70% etanolem, a następnie gazą nasączoną betadyną. Utrzymuj sterylne warunki przez cały zabieg chirurgiczny.
2. Właściwa ekspozycja
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry od wyrostka ksyloidalnego do pępka za pomocą skalpela. Podnieś otrzewną za pomocą kleszczy Adson i zrób mały otwór w linii środkowej za pomocą nożyczek.
- Przedłuż nacięcie otrzewnej do długości nacięcia skóry, uważając, aby pozostać na linii środkowej (linea alba).
UWAGA: Spowoduje to laparotomię górnej linii środkowej jamy brzusznej. - Podnieś wątrobę za pomocą retraktorów, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy. Zacisnąć wspólny przewód żółciowy za pomocą zakrzywionego zacisku naczyniowego buldoga.
UWAGA: Ten manewr zapobiega niepożądanemu wlewowi do wątroby.
3. Identyfikacja brodawki trzustkowej i duodenotomii
- Zidentyfikuj dwunastnicę i za pomocą kleszczy Arruga cofnij ją doogonowo, aby wyświetlić brodawkę.
UWAGA: Brodawka to biała plamka na przedniej powierzchni drugiej części dwunastnicy. - Cofnij dwunastnicę doogonowo, co pozwala na identyfikację przebiegu przewodu trzustkowego. Za pomocą igły o rozmiarze 301/2 nakłuć ścianę dwunastnicy stycznie, dokładnie naprzeciwko brodawki.
UWAGA: Igła powinna podążać pod tym samym kątem co przewód, gdy wchodzi do dwunastnicy.
4. Napar.
- Przeprowadź cewnik przez duodenotomię utworzoną w kroku 3.2, aż cewnik będzie widoczny w przewodzie. Wsuń cewnik do kanału nie więcej niż 1 cm, aby zapobiec ominięciu mniejszych dopływów przewodowych.
- Zacisnąć cewnik na miejscu za pomocą drugiego zakrzywionego zacisku naczyniowego buldoga. Włącz pompę i wlej wybraną objętość. Objętość podawanej infuzji może wynosić od 25 do 250 μl, przy idealnej objętości około 150 μl.
- Podaj dootrzewnowe wstrzyknięcie około 1,5 ml soli fizjologicznej, aby zrównoważyć straty. Przykryj odsłonięte jelito wilgotną gazą, aby zapobiec wysuszeniu.
- Po zakończeniu infuzji usuń zacisk buldoga, który utrzymywał cewnik na miejscu. Użyj zacisku buldoga, aby delikatnie usunąć cewnik z przewodu trzustkowego. Zwolnij zacisk ze wspólnego przewodu żółciowego.
- Zamknij otrzewną i skórę w jednej lub dwóch warstwach za pomocą szwu biegowego.
UWAGA: Nie ma potrzeby zamykania duodenotomii, ponieważ ona sama się zapieczętuje. - W analgezji pooperacyjnej należy podać dawkę ketofenu w dawce 5 mg/kg mc. podczas zabiegu i jedną następnego dnia.
- Umieść mysz z powrotem w klatce pod lampą grzewczą, aż dojdzie do siebie. Zapewnij myszy jedzenie i wodę ad libitum.
- Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
5. Przygotowanie próbki
- Umieść zwierzę w komorze na dwutlenek węgla lub wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
- Zbierz trzustkę, ze śledzioną, wątrobą i dwunastnicą jako kontrolą. Utrwalić tkanki w paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C. Cryoprotect próbkę w 30% sacharozie przez noc, jak opisano wcześniej6.
- Próbki należy zamrozić na zatrzask. Przeciąć tkankę o grubości 6 μm za pomocą mikrotomu. Wykonaj obrazowanie pod mikroskopem z obrazowaniem fluorescencyjnym, jak opisano wcześniej7.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dzięki praktyce i starannej technice chirurgicznej przeżywalność tych myszy powinna wynosić ponad 95%. Po tygodniu od infuzji pożądany efekt powinien być widoczny w trzustce. Do infuzji do przewodu trzustkowego wykorzystano myszy w wieku od 10 do 12 tygodni. W tym przypadku zastosowano wirusa towarzyszącego adenowirusom serotypu 8 (AAV8) z promotorem CMV do ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), w porównaniu do operacji pozorowanej. Trzustki myszy pobrano 7 dni po infuzjach. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Praca ta szczegółowo opisuje metodologię stojącą za infuzją przewodu trzustkowego, skutecznym mysim modelem dostarczania genów i innych cząsteczek specyficznie i skutecznie do trzustki. Niejasności w specyfice procedury między różnymi grupami uwypukliły potrzebę ustandaryzowanego protokołu 8,9,10.
Procedura składa się z kilku krytycznych etapów, począwszy od selekcji młodych, zdrowych myszy. Perforacj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań. Dofinansowanie uzyskano od Fundacji Zdrowia i Komisji Planowania Rodziny prowincji Zhejiang (Grant 20146242) oraz Fundacji Biura Nauki i Technologii Wenzhou (Grant Y20140248).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myszy (25 - 30g, 8-12 tygodni) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Etanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterylny roztwór soli | fizjologicznej Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Sprzęt | |||
| Produkt | Nair lub trymer | ||
| Podkładki z gazy 2 cale x 2 cale | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Igły (30,5 G i 25 G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 i 305122 | |
| Strzykawka dla Ketofen i Saline | Becton Dicksinson and Co. | ||
| Strzykawka do pompy | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Pompy infuzyjne | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Cewnik infuzyjny | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Zakrzywione zaciski Bulldog (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Kleszcze Arruga | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Kleszcz | Roboz | RS-5234 | |
| Uchwyt igły | Roboz | RS-7882 | |
| Nożyczki | Roboz | RS-5982 | |
| Aplikatory z bawełnianą końcówką | Sprzedaż i usługi dla lekarzy | 22-9988 | |
| preparacyjny | |||
| szew | Owensa i drobnych | SXMD1B402 |
Bibliografia
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
