Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55335

⸱

24 lutego 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Streszczenie

Endogenny program regeneracji jest inicjowany przez glej Müllera w siatkówce dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) po uszkodzeniu neuronów i śmierci. Komórki glejowe Müllera ponownie wchodzą w cykl komórkowy i wytwarzają neuronalne komórki progenitorowe, które przechodzą kolejne rundy podziałów komórkowych i różnicują się w utracone typy komórek neuronalnych. Zarówno komórki glejowe Müllera, jak i jądra neuronalnych komórek progenitorowych replikują swoje DNA i przechodzą mitozę w różnych miejscach siatkówki, tj. migrują odpowiednio między podstawową wewnętrzną warstwą jądrową (INL) i zewnętrzną warstwą jądrową (ONL) w procesie opisanym jako interkinetyczna migracja jądrowa (INM). INM badano głównie w rozwijającej się siatkówce. Aby szczegółowo zbadać dynamikę INM w dorosłej regenerującej się siatkówce danio pręgowanego, konieczne jest obrazowanie żywych komórek znakowanych fluorescencyjnie, komórek glejowych/neuronalnych komórek progenitorowych Müllera. W tym miejscu zapewniamy warunki do izolacji i hodowli siatkówki grzbietowej od zebry Tg[gfap:nGFP]mi2004, które były wystawione na działanie stałego, intensywnego światła przez 35 godzin. Pokazujemy również, że te hodowle siatkówki są zdolne do przeprowadzania eksperymentów obrazowania żywych komórek, stale uzyskując obrazy stosu z na całej grubości eksplantatu siatkówki przez okres do 8 godzin przy użyciu mikroskopii wielofotonowej w celu monitorowania zachowania migracyjnego komórek gfap: nGFP-dodatnich. Ponadto opisujemy szczegóły do przeprowadzenia analizy po obrazowaniu w celu określenia prędkości wierzchołkowego i podstawowego INM. Podsumowując, stworzyliśmy warunki do badania dynamiki INM w dorosłym modelu regeneracji neuronów. Pozwoli to lepiej zrozumieć ten kluczowy proces komórkowy i pozwoli nam określić mechanizmy kontrolujące INM.

Wprowadzenie

W przeciwieństwie do ludzi, danio pręgowany (Danio rerio) wykazuje silną reakcję regeneracyjną po śmierci komórki neuronów siatkówki1,2,3,4. Czynnik martwicy nowotworu α, cząsteczka sygnałowa, która jest uwalniana z umierających neuronów siatkówki, indukuje glej Müllera znajdujący się w podstawowej wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) siatkówki, do proliferacji5 i wytwarzania neuronalnych komórek progenitorowych, które nadal się namnażają, zanim różnicują się w typy komórek neuronalnych, które umarły2,3,4. Podczas fazy proliferacyjnej odpowiedzi regeneracyjnej jądra gleju Müllera i pochodne z nich neuronalne komórki progenitorowe przechodzą powtarzający się wzorzec migracji w fazie cyklu komórkowego (Interkinetyczna migracja jądrowa, INM)6,7. Jądra umieszczone w podstawowym INL replikują swoje DNA przed migracją do zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL), gdzie dzielą się, zanim powstające jądra powrócą zasadniczo do INL. Proces ten został po raz pierwszy opisany podczas rozwoju neuroepitelializmu przy użyciu metod histologicznych, podczas gdy metody obrazowania żywych komórek później potwierdziły interpretację przez Sauer8,9,10,11,12. Zarówno podejścia histochemiczne, jak i obrazowanie żywych komórek zostały wykorzystane do określenia mechanizmów leżących u podstaw INM i jego funkcji w rozwoju neuroepitelii, w tym retina9,11,12,13. Jednak mechanizmy rządzące INM w dorosłej regenerującej się siatkówce nie zostały zbadane zbyt szczegółowo6,7. Obrazowanie żywych komórek będzie nieocenionym podejściem do pogłębienia naszej wiedzy na temat szlaków sygnałowych, które kontrolują INM w regenerującej się siatkówce dorosłego.

Do niedawna obrazowanie żywych komórek INM w siatkówce było ograniczone do żywych zarodków danio pręgowanego lub do embrionalnych eksplantatów siatkówki piskląt lub myszy po urodzeniu9,10,11,12,14,15,16. Podczas gdy eksplantaty siatkówki od dorosłych zwierząt różnych gatunków, w tym myszy, szczurów i danio pręgowanego, były wykorzystywane do różnych podejść biologicznych komórek17,18,19,20, eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek z użyciem eksplantatów siatkówki były ograniczone do krótkich okresów czasu i nie były wykonywane w sposób ciągły przez kilka godzin21,22. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół hodowli uszkodzonych światłem siatkówk dorosłego danio pręgowanego w celu przeprowadzenia eksperymentów obrazowania żywych komórek, monitorując INM za pomocą mikroskopii wielofotonowej6. Metody obrazowania żywych komórek są korzystniejsze w porównaniu z metodami immunohistochemicznymi podczas badania mechanizmów kontrolujących INM, ponieważ może to mieć wpływ na dynamikę INM, np. na prędkości, a nie na lokalizację mitozy, która potencjalnie nie zostałaby wykryta za pomocą immunocytochemii.

W przyszłości ta metoda może być również modyfikowana do badania innych dynamicznych procesów podczas regeneracji siatkówki, takich jak fagocytoza umierających fotoreceptorów przez glej Müllera lub zachowanie mikrogleju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Danio pręgowany był hodowany i utrzymywany w obiekcie Notre Dame Danio pręgowany w Centrum Nauk Przyrodniczych Freimann. Metody opisane w tym manuskrypcie zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Notre Dame i są zgodne z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystywania zwierząt w badaniach nad wzrokiem.

1. Rozwiązania

  1. Przygotuj 70% etanol do sterylizacji kaptura do hodowli tkankowych i wszelkiego sprzętu/odczynników, które są przenoszone do kaptura do hodowli tkankowej.
  2. Dodać 2 ml 2-fenoksyetanolu do 1 l wody systemowej (1:500 2-fenoksyetanolu).
  3. Przygotować 0,1 mM NaHCO3, pH 8,0. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego o porach 0,2 μm, aby wysterylizować roztwór w wysterylizowanym kapturze do hodowli tkankowych.
    UWAGA: NaHCO3 służy do skutecznego rozprowadzania kleju komórkowego i tkankowego na powierzchni szkiełka nakrywkowego fluorodyzaków (patrz krok 3.2).
  4. Przygotować 1,0 M CaCl2 i 1,0 M MgCl2. Sterylizuj za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego o porach 0,2 μm w wysterylizowanym kapturze do hodowli tkankowych.
  5. Aby przygotować zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS), dodaj sterylny CaCl2 i sterylny MgCl2 do 1x HBSS bez Ca2 + / Mg2+, bez czerwieni fenolowej w końcowym stężeniu 1 mM każdy. Praca w sterylnym środowisku.
  6. Aby przygotować pożywkę hodowlaną, zmieszać 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) bez czerwieni fenolowej, 25% HBSS zawierającego CaCl2 i MgCl2 (patrz sekcja 1.4), 25% surowicy końskiej (HS), 10 jednostek/ml penicyliny i 10 μg/ml streptomycyny. Praca w sterylnym środowisku.
    UWAGA: Unikaj podłoża zawierającego czerwień fenolową, ponieważ ulega ona autofluorescencji, wpływając w ten sposób na stosunek sygnału do szumu. 23
  7. Przygotuj 10 ml 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1x MEM bez czerwieni fenolowej. Rozpuść agarozę/1x MEM za pomocą kuchenki mikrofalowej. Przygotuj małe objętości agarozy (np. 10 ml), ponieważ powtarzające się podgrzewanie zmieni stężenie jonów w wyniku parowania płynu.
  8. Przed hodowlą wysterylizuj probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przez autoklawowanie.

2. Paradygmat obrażeń od światła

  1. Adaptacja do ciemności
    1. Miejsce 2 - 3 Tg[gfap:nGFP]mi2004 danio pręgowanego (lub innego transgenicznego danio pręgowanego) w wieku 6 - 14 miesięcy w środowisku pozbawionym światła przez 14 dni. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz reference2, 6, 24, 25.
  2. Umieść zbiornik zawierający 2 - 3 transgeniczne transgeniczne rybki pręgowane przystosowane do ciemności w wodzie systemowej między dwiema lampami fluorescencyjnymi, które emitują światło o natężeniu 2,800 luksów2, 6, 24, 25.
  3. Wystawiaj danio pręgowanego na działanie stałego, intensywnego światła przez 35 godzin. Podczas ekspozycji na światło należy upewnić się, że temperatura wody jest utrzymywana w zakresie 31 - 33 °C.

3. Przygotowanie do hodowli (w dniu izolacji siatkówki)

  1. Używając 70% etanolu, wysterylizuj kaptur do hodowli tkankowych i komponenty/narzędzia, które są przenoszone do kaptura do hodowli tkankowych (np. kolby zawierające MEM i HBSS, pipety, sterylne końcówki do pipet itp.).
  2. Przygotowanie fluorodiaków
    1. Pokryj jedną fluorodywkę na każdą siatkówkę klejem komórkowym i tkankowym (patrz tabela materiałów).
    2. Rozcieńczyć klej komórkowy i tkankowy w 0,1 mM NaHCO3 do końcowego stężenia 70 μg/ml, dodać 50 μl do każdego fluorodywu i rozprowadzić roztwór na środku fluorodywu za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl (o średnicy około 1 - 1,2 cm).
    3. Inkubować powlekane fluorodyzy przez 1-3 godziny w temperaturze pokojowej (alternatywnie, inkubować O/N w temperaturze 4 °C).
    4. Usuń roztwór i spłucz 3x 500 μl 1x MEM na każde przemycie. Aby uniknąć wysychania powlekanych fluorodishów, należy je przechowywać w MEM do momentu zamontowania eksplantatów siatkówki.
  3. Przygotować pożywkę hodowlaną zgodnie z opisem w kroku 1.6. Pożywka hodowlana może być przechowywana przez okres do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.

4. Izolacja i hodowla eksplantatów siatkówki

UWAGA: Protokół opisany poniżej służy do izolacji siatkówki grzbietowej, która jest obszarem siatkówki, który jest głównie uszkodzony przez opisany paradygmat uszkodzenia światła. W związku z tym w siatkówce grzbietowej dochodzi do proliferacji wywołanej uszkodzeniem i związanego z nią zdarzenia interkinetycznej migracji jądrowej. Jednak procedura izolacji może być dostosowana do uzyskania regionów siatkówki zgodnie ze specyficznymi wymaganiami badacza/pytania badawczego.

  1. Poddaj eutanazji jednego uszkodzonego światłem transgenicznego danio pręgowanego na raz w 1:500 2-fenoksyetanolu.
  2. Usuń MEM z jednego fluorodywu za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, tak aby pozostał tylko cienki film płynu.
  3. Przenieś danio pręgowanego na suchy ręcznik papierowy, usuń oko zakrzywioną parą kleszczy Dumonta (kleszcze #5, kąt 45°) i przenieś na fluorodish.
  4. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego skieruj oko źrenicą na szkiełko nakrywkowe fluorodywu tak, aby widoczna była tylna część oka z nerwem wzrokowym (ryc. 1D).
  5. Za pomocą nożyczek McPherson-Vannas usuń nerw wzrokowy, przecinając blisko tylnej części oka. Ponadto należy usunąć tkankę łączną wyściełającą zewnętrzną część oka.
  6. Przytrzymaj oko między jego nosową a skroniową stroną za pomocą pary kleszczy #5, wykonując nacięcie na łodydze wzrokowej, przekłuwając jednym ostrzem nożyczek blaszkę grzebienia i przecinając wzdłuż zarówno nosowej, jak i skroniowej strony oka (patrz rysunek 1E, linia segmentowa).
  7. Używając dwóch par kleszczy #5, jednej do przytrzymania grzbietowej strony siatkówki, a drugiej pary do oddzielenia siatkówki brzusznej od grzbietowej, pociągnij tkankę.
    UWAGA: Wskazane jest ustawienie siatkówki grzbietowej tak, aby soczewka i warstwa komórek zwojowych były skierowane w stronę szkiełka nakrywkowego, podczas gdy twardówka była skierowana do góry.
  8. Usuń twardówkę z siatkówki grzbietowej za pomocą jednej pary kleszczy #5, trzymając soczewkę połączoną z siatkówką za pomocą drugiej pary kleszczyków #5 (ryc. 1H, I).
  9. Aby usunąć soczewkę, użyj nożyczek McPhersona-Vannasa i przetnij za soczewką, nie uszkadzając siatkówki (Rysunek 1I, J). Czasami obiektyw rozdziela się w kroku 4.7. W takim przypadku ostrożnie usuń twardówkę za pomocą kleszczy, przytrzymując siatkówkę na krawędzi cięcia drugą parą kleszczyków #5.
  10. Usuń ciało szkliste, jednocześnie wyjmując soczewkę, nie uszkadzając siatkówki. Spłaszcz siatkówkę z warstwą komórek zwojowych skierowaną w stronę szkiełka nakrywkowego fluorodowego (ryc. 1L, M).
  11. Otocz siatkówkę 10 μl 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia i pozwól agarozie zastygnąć.
  12. Uważaj, aby płynna agaroza nie unosiła siatkówki, ponieważ nawet niewielkie uniesienie może wpłynąć na zdolność skupienia się głęboko w tkance. Jeśli zaobserwuje się podnoszenie, użyj pipety, aby usunąć agarozę. Pozwól, aby resztki agarozy zastygły, zanim spróbujesz dodać więcej.
  13. Powtórz krok 4.12 kilka razy przed dodaniem 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby pokryć cały fluorod. Gdy agaroza zestala się, dodaj 1,5 ml pożywki hodowlanej.
  14. Utrzymuj hodowlę eksplantatów siatkówki w środowisku o stężeniu 5%CO2/powietrze w temperaturze 32 °C przez około 12 godzin, aby siatkówka mogła się zregenerować po naprężeniach spowodowanych procedurą izolacji. Ustawić temperaturę na 32 °C, aby utrzymać siatkówkę w tej samej temperaturze, co danio pręgowany poddany działaniu światła (patrz krok 2.3).

5. Mikroskopia wielofotonowa

UWAGA: Eksperymenty przeprowadzone w tym manuskrypcie zostały zoptymalizowane pod kątem mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień (patrz Tabela materiałów), obiektywu do zanurzenia w wodzie na duże odległości 40X Apo (N.A. 1.15), skanera galwanometrycznego i komory środowiskowej, która zawiera wkładkę na cztery szalki Petriego 35 mm. Obrazy zostały pozyskane za pomocą detektora non-descanned (R-NDD).

  1. Przed obrazowaniem należy zrównoważyć komorę środowiskową, aby osiągnąć 5% CO2 / atmosferę powietrzną. Upewnij się, że puste szalki Petriego są włożone do uchwytu, aby uniknąć wycieku gazu do pomieszczenia.
  2. Włącz system mikroskopowy.
  3. Po zrównoważeniu komory środowiskowej dodaj ciecz o współczynniku załamania światła na obiektyw 40X Apo do zanurzenia w wodzie na duże odległości (ND 1.15).
    UWAGA: Ciecz o współczynniku załamania światła o właściwościach optycznych podobnych do wody służy do unikania parowania wody podczas długotrwałego obrazowania.
  4. Umieść fluorodiaki z eksplantatami siatkówki w komorze. Używając światła jasnego pola, ustaw próbkę na ścieżce światła i przenieś środkowy obszar siatkówki grzbietowej do płaszczyzny ostrości.
  5. Użyj światła epifluorescencyjnego GFP, aby skupić się na jądrach gleju Müllera gfap:nGFP-dodatnich (Figura 2A, C).
    UWAGA: Jeśli eksplantaty nie są zamontowane płasko lub agaroza nagromadziła się pod eksplantatem, trudno będzie skupić się na jądrach gfap:nGFP-dodatnich lub będą one słabo fluoryzować.
    1. Sprawdź, czy przeniesienie się do innego regionu w obrębie tego samego eksplantatu siatkówki rozwiąże problem z ostrością. W przeciwnym razie przenieś się do innego eksplantatu siatkówki.
  6. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu otwórz okna "A1 MP GUI", "TiPad", "A1 Compact GUI" i "Akwizycja ND". W przypadku obrazowania wielofotonowego upewnij się, że opcja "IR NDD" jest wybrana w "Kompaktowym graficznym interfejsie użytkownika A1".
  7. W polu "ustawienia" wybierz IR-DM dla 1. lustra dichroicznego i wybierz filtr pasmowo-przepustowy 525/50, aby uzyskać fluorescencję GFP.
  8. Włącz laser IR w oknie oznaczonym "A1MP GUI". Zajmie to kilka minut, zanim laser będzie gotowy. Ustaw długość fali na 910 nm, aby wzbudzić fluorescencję GFP i wyrównaj laser, klikając przycisk "Automatyczne wyrównanie" w oknie "A1 MP GUI".
  9. Upewnij się, że światła w pomieszczeniu i sprzęcie są wyłączone lub zasłonięte przed otwarciem migawki w "graficznym interfejsie użytkownika A1 MP", aby uniknąć prześwietlenia lampy fotopowielacza. Aby zmniejszyć poziom hałasu, mikroskop należy umieścić w zaciemnionym otoczeniu.
  10. Uzyskuj obrazy o polu widzenia 300 x 300 pikseli, przy dwukrotnym powiększeniu i czasie przebywania pikseli 4,8 μs/piksel. Z grubsza ustaw moc lasera, zmieniając "obszar akwizycji" w "graficznym interfejsie użytkownika A1MP" i wzmocnienie w oknie "A1 Compact GUI".
  11. Ustawianie stosu Z
    1. Skoncentruj się na warstwie komórek zwojowych, aby ustawić górną płaszczyznę ogniskową stosu z w oknie podrzędnym "z" w oknie "akwizycja ND". Niektóre komórki gfap:nGFP-dodatnie są zwykle zlokalizowane w warstwie komórek zwojowych, co pomaga zidentyfikować podstawową granicę siatkówki (ryc. 2A, D).
    2. Przesuń płaszczyznę ogniskowej przez poziom ONL (rysunek 2A, B), który charakteryzuje się obecnością słabo oznaczonych komórek gfap:nGFP-dodatnich, które są okrągłe i powiększone w stosunku do ich odpowiedników w INL (rysunek 2A, C).
    3. Ustaw tę płaszczyznę jako dolną część stosu z. Upewnij się, że cały ONL zostanie zobrazowany (Rysunek 2A, B).
    4. W przypadku wystąpienia przesunięć płaszczyzny ogniskowej, które wymagają ponownej regulacji w okresie obrazowania, kliknij dwukrotnie środkową pozycję w oknie podrzędnym "z", aby przypisać ją jako pozycję "domową". Zmień na "zdefiniowany tryb symetryczny" i kliknij "względny".
    5. Ustaw rozmiar kroku Z w zakresie od 0,7 do 1 μm.
  12. Korekcja intensywności Z:
    1. Zastosuj korekcje intensywności z, aby skompensować utratę intensywności pikseli spowodowaną rozpraszaniem światła podczas obrazowania w głębokich warstwach tkanki.
    2. Aby ustawić korekcję, otwórz okno "Korekcja intensywności z". Aby ustawić 'zakres z-stack', wybierz 'From ND'.
    3. Kliknij dolną płaszczyznę ogniskowej w oknie "Korekcja intensywności z" (w tym przypadku odpowiada warstwie komórek zwojowych) i ustaw intensywność lasera ("obszar akwizycji" w "A1MP GUI") i wzmocnienie (A1 Compact GUI).
    4. Kliknij strzałkę obok "wartości z" w oknie "korekcja intensywności z", aby potwierdzić ustawienia, które są następnie wyświetlane w sekcji "ustawienia urządzenia" w oknie "korekcja intensywności z" dla wybranej płaszczyzny ogniskowej.
    5. Powtórz proces dla środkowej i górnej płaszczyzny, zwiększając moc i wzmocnienie lasera. W razie potrzeby można dodać dodatkowe płaszczyzny ogniskowych. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z konkretnymi ustawieniami lasera i wzmocnienia dla eksperymentów na rysunkach 2 - 4.
    6. Ustaw "obszar akwizycji" w oknie "A1 MP GUI". Unikaj wybierania obszaru akwizycji większego niż 15 i wzmocnienia wyższego niż 126 na początku obrazowania, aby obejść fotowybielanie i zwiększony poziom szumów.
      UWAGA: Ponieważ lasery i lampy fotopowielacza różnią się między systemami mikroskopowymi, przetestuj ustawienia lasera i wzmocnienia, aby uzyskać optymalne warunki obrazowania dla konfiguracji mikroskopu, unikając przy tym fotowybielania.
    7. Wybierz "korekcja intensywności względnej" w oknie "korekcja intensywności z".
  13. W podoknie "szeregi czasowe" w oknie "Akwizycja ND" ustaw czas trwania na 8 godzin, a interwał na "bez opóźnienia". Następnie upewnij się, że kliknąłeś "Uruchom korektę z" w oknie podrzędnym "z-stack" w przycisku "Akwizycja ND", aby uzyskać szeregi czasowe 3D.
  14. Utrzymuj eksplantaty siatkówki w temperaturze 27 - 29 °C przez cały czas pozyskiwania obrazu.
  15. Przez cały okres akwizycji obrazu, jeśli to konieczne, należy ponownie dostosować poziom mocy i wzmocnienie, aby utrzymać jakość obrazu do analizy po obrazowaniu. W celu regulacji wykonaj kroki 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Jeśli płaszczyzna ogniskowej przesunie się, wstrzymaj lub zatrzymaj bieg i ponownie wykonaj krok 5.11.
    UWAGA: Jeśli w kroku 5.12.7 wybrano opcję "względna korekcja z", a w kroku 5.11.4 wykonano krok, nie powinno być konieczne ponowne dostosowanie poziomów mocy i wzmocnienia, chyba że wystąpiło rozległe fotowybielanie.

6. Analiza prędkości

  1. Wyodrębnij czas, ustawiając "obszar zainteresowania" na obrazie. Użyj narzędzia "pomiar czasu" i wyeksportuj wartości czasu do arkusza kalkulacyjnego.
  2. Przytnij region, który zawiera dzielące się jądro gfap:nGFP-dodatnie.
  3. Wybierz przycięty obszar tak, aby zawierał co najmniej jedno jądro, które nie ulega INM, aby ustawić punkt odniesienia do późniejszego zmierzenia odległości, na jakie dzielące się jądro migrowało w stosunku do podstawowego INL. UWAGA: Aby wybrać jądro, które pozostaje w podstawowym INL, pomocne jest przygotowanie trójwymiarowej rekonstrukcji szeregów czasowych.
  4. Alternatywnie, jeśli komórka gfap:nGFP-dodatnia jest obserwowana w ONL przez cały okres akwizycji, należy użyć pionowej linii o stałej długości rozciągającej się od jądra ONL do podstawowego INL w celu zidentyfikowania punktu odniesienia.
  5. Korzystając z funkcji "pokaż widok plasterków", wygeneruj rzuty ortogonalne. Następnie zmień tryb z "plasterka" na "projekcję maksymalnej intensywności".
  6. Wyłącz widok "xy" ortogonalnego rzutu maksymalnego. W zależności od orientacji, w której migrujące/dzielące się jądro jest najlepiej widoczne, wyłącz również widok 'xz' lub 'yz'.
  7. Kliknij na pozostały obraz prawym przyciskiem myszy i wyodrębnij serię obrazów "xz" lub "yz" za pomocą funkcji "Utwórz nowy dokument z tego widoku". W razie potrzeby obróć obraz.
  8. Korzystając z funkcji "pomiaru ręcznego", narysuj poziomą linię w poprzek obrazu na dolnym poziomie jądra, które pozostaje w podstawowym INL i nie ulega INM (= punkt odniesienia; Rysunek 4A - E, czerwona linia pozioma).
  9. Zmierzyć odległość między linią odniesienia a punktem podstawowym migrującego jądra dla szeregów czasowych za pomocą narzędzia do "pomiaru linii" w oprogramowaniu do analizy (zob. rysunek 4A–E).
  10. Po rozpadzie otoczki jądrowej zmierz podstawowe położenie somy, jeśli można ją zidentyfikować po dyfuzji GFP do całej komórki.
  11. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, wykreśl odległość, jaką przebyło jądro w stosunku do upływającego czasu (Rysunek 4F).
    1. Aby określić wierzchołkową prędkość migracji (va), należy sporządzić wykres odległości przebytych w okresie przed rozpadem otoczki jądrowej (rysunek 4G).
    2. Wybierz serię danych na wykresie, kliknij prawym przyciskiem myszy i wstaw krzywą regresji liniowej wraz z odpowiednią funkcją "y=mx+c". Nachylenie "m" w funkcji reprezentuje prędkość, va (rysunek 4G).
    3. Powtórz kroki 6.11.1 i 6.11.2 dla pierwszej fazy szybkiej migracji podstawowej, aby określić podstawową prędkość migracji, vb (rysunek 4H).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja siatkówki zgodnie z procedurą przedstawioną na schemacie na Rysunku 1 umożliwia hodowlę spłaszczonej grzbietowej siatkówki z uszkodzonej światłem siatkówki dorosłych ryb danio Tg[gfap:nGFP]mi2004 przez okres co najmniej 24 h w środowisku 5% CO2/powietrza. Te spłaszczone eksplanty siatkówki mogą być wykorzystywane do obrazowania płaszczyzn ogniskowych na głębokich poziomach tkanki. Przykładem są jądra komórek glei Müllera/progenitoró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniach nad mechanizmami rządzącymi regeneracją uszkodzonej siatkówki dorosłego danio pręgowanego stosowano głównie metody immunocytochemiczne 5,25,26,27,28,29,30. Stworzenie warunków do hodowli eksplantatów siatkówki i wykonywania obrazowania żywych komórek w zjawiskach takich jak INM d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Doceniamy wsparcie udzielone przez Williama Archera i Zintegrowane Centrum Obrazowania Notre Dame. Szczególne podziękowania kierujemy do techników Freimann Life Sciences za ich nieustanną pomoc oraz opiekę i hodowlę danio pręgowanego. Badanie to było wspierane przez granty z National Eye Institute of NIH dla DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) oraz Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kleszcze Dumonta #5Światowe instrumenty precyzyjne14098
Kleszcze Dumont #5, 45&kątŚwiatowe instrumenty precyzyjne14101
Nożyczki McPherson-VannasŚwiatowe instrumenty precyzyjne501233
FluordishŚwiatowe instrumenty precyzyjneFD35-100
Mikroskop stereoskopowyNikon SMZ-1Bpodobny typ stereomikroskopu preparacyjnego będzie działał
Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego klasa typu A2Równoważny typ Labconcobędzie działał
inkubator kultur tkankowychThermoscientificHEPA-klasa 100równoważny typ będzie działał
Lampy fluorescencyjne Sylvania OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0,2 i mikro; m Filtr strzykawkowy Acrodisc o dużych porachVWR4192
Strzykawka Luer-lok 10 mlVWRBD309604
60 ml Strzykawka Luer-lokVWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS bez Ca2+/Mg2+, bez czerwieni fenolowej, GibcoThermoScientific14175-095
MEM bez czerwieni fenolowej, GibcoThermoScientific5100-038
Surowica końska, inaktywowana termicznieThermoScientific26050-070
penicylina/streptomycynaVWR16777-164
Ultraczysta agaroza o niskiej temperaturze topnieniaThermoScientific16520-100
etanol, absolutnyThermoScientificBP2818-4
2-fenoksyetanolSigma77699
Corning Cell-Tak klej do komórek i tkanek VWR354240
indeksie załamania światła Cargille Lab1803Y
Nikon A1 wyposażony w laser na podczerwień MaiTaiOdpowiednik systemu Nikonbędzie działał
40-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzie Apo na duże odległości (ND 1.15)
komora środowiskowa wyposażona we wkładkę do granulek 35 mmsystemu Okolabbędzie działać
Oprogramowaniedo analizy NISNikon
płyn o Mikroskop wielofotonowy Odpowiednik

Bibliografia

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24(2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Interkinetyczna migracja jąderhodowla eksplantów siatkówkisiatkówka rybki zebrafishznakowanie GFAP:nGFPakwizycja stosów Z (Z-stack)montaż w FluoroDishzatapianie w agaroziepomiar prędkości
Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.