Leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej

Podsumowanie

Prezentujemy model tkanki więzadła, w którym trójwymiarowe konstrukty są traktowane ludzką surowicą kondycjonowaną wysilaniem i analizowane pod kątem zawartości kolagenu, funkcji i biochemii komórkowej.

Streszczenie

Eksperymenty in vitro są niezbędne do zrozumienia mechanizmów biologicznych; jednak różnica między jednowarstwową hodowlą tkanek a fizjologią człowieka jest duża, a tłumaczenie wyników jest często słabe. W związku z tym istnieje wiele możliwości dla alternatywnych podejść eksperymentalnych. Tutaj przedstawiamy podejście, w którym ludzkie komórki są izolowane z resztek tkanki ludzkiego więzadła krzyżowego przedniego, namnażane w hodowli i wykorzystywane do tworzenia zmodyfikowanych więzadeł. Ćwiczenia zmieniają środowisko biochemiczne we krwi w taki sposób, że poprawia się funkcjonowanie wielu tkanek, narządów i procesów zachodzących w organizmie. W tym eksperymencie pożywki hodowlane konstruujące więzadła zostały uzupełnione eksperymentalną ludzką surowicą, która została "uwarunkowana" przez ćwiczenia. W związku z tym interwencja jest bardziej istotna z biologicznego punktu widzenia, ponieważ tkanka doświadczalna jest wystawiona na działanie pełnego endogennego środowiska biochemicznego, w tym białek wiążących i związków pomocniczych, które mogą być zmieniane w tandemie z aktywnością nieznanego czynnika będącego przedmiotem zainteresowania. Po leczeniu zmodyfikowane więzadła można przeanalizować pod kątem funkcji mechanicznych, zawartości kolagenu, morfologii i biochemii komórkowej. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją cztery główne zalety przedstawionego tutaj modelu fizjologicznego tkanki więzadłowej w porównaniu z tradycyjną hodowlą jednowarstwową i modelami zwierzęcymi. Po pierwsze, konstrukcje więzadłowe są trójwymiarowe, co pozwala na ilościowe określenie właściwości mechanicznych (tj. funkcji), takich jak końcowe naprężenie rozciągające, maksymalne obciążenie rozciągające i moduł. Po drugie, przyczep ścięgnisty, czyli interfejs między elementami kostnymi i ścięgnistami, może być badany szczegółowo i w kontekście funkcjonalnym. Po trzecie, przygotowanie pożywki z surowicą powysiłkową pozwala na bezstronne zbadanie wpływu środowiska biochemicznego wywołanego wysiłkiem fizycznym, które jest odpowiedzialne za szeroki zakres korzyści zdrowotnych płynących z ćwiczeń. Wreszcie, ten eksperymentalny model naprzód badania naukowe w sposób humanitarny i etyczny, zastępując wykorzystywanie zwierząt, co jest podstawowym mandatem National Institutes of Health, Center for Disease Control oraz Food and Drug Administration.

Wprowadzenie

Urazy ścięgien i więzadeł są powszechne i mogą mieć destrukcyjne konsekwencje dla normalnej mobilności i jakości życia. Interwencja chirurgiczna jest często konieczna, ale może mieć ograniczony i zróżnicowany sukces^4,5. Obecna wiedza na temat tego, jak ścięgna i więzadła rozwijają się, dojrzewają i reagują na urazy, jest niekompletna, dlatego potrzebne są skuteczne modele badawcze, które zapewnią wgląd w rozwój skuteczniejszych metod leczenia⁵. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, można wykorzystać modele zwierzęce, ale badania in vivo są z natury skomplikowane i mają trudności z kontrolowaniem środowiska i bezpośrednim ukierunkowaniem interwencji na zamierzoną tkankę. W przeciwieństwie do tego, środowisko eksperymentalne może być łatwo kontrolowane i monitorowane in vitro za pomocą tradycyjnej jednowarstwowej hodowli komórkowej. Jednak technika ta może nadmiernie uprościć środowisko chemiczne i mechaniczne, a tym samym może nie odzwierciedlać zachowania komórek in vivo. Inżynieria tkankowa jest w stanie połączyć zalety złożonego środowiska in vivo w modelach zwierzęcych z kontrolą środowiska in vitro i zapewnia dodatkowe narzędzie do badania fizjologii. Ponadto, dzięki lepszemu zrozumieniu rozwoju więzadeł, inżynieria tkankowa może również stanowić źródło przeszczepu tkanki, gdy wymagana jest rekonstrukcja chirurgiczna⁶. W ten sposób opisana tutaj metoda weryfikuje tkankę inżynieryjną 3D in vitro, którą można wykorzystać do badania funkcji więzadeł i morfologii.

Konstrukty ścięgien lub więzadeł oparte na fibrynie zostały użyte jako model in vitro do badania procesów fizjologicznych, w tym fibrylogenezy kolagenu⁷ i rozwoju ścięgien⁸, a także aplikacji translacyjnych, w których ich użyteczność jako tkanki do przeszczepu została oceniona w owczym modelu rekonstrukcji więzadła krzyżowego przedniego (ACL) u owiec⁹. Nasze laboratorium wcześniej stworzyło model więzadłowy 3D obejmujący dwa szczotkyty, materiał zastępujący kości fosforan wapnia, kotwy cementowe. Model ten można z łatwością poddać różnym warunkom eksperymentalnym, po prostu uzupełniając pożywkę biologiczną czynnikami biologicznymi¹⁰ lub stosując stymulację mechaniczną¹¹. Co ważne, ten model więzadła kostno-kostnego pozwala na dogłębną analizę przyczepu ścięgnistego, czyli granicy faz między elementami kostnymi i ścięgnistymi, która jest podatna na urazy.

W badaniu wyróżnionym¹ tutaj, aby przedstawić tę metodologię, byliśmy zainteresowani wpływem wywołanych ćwiczeniami zmian w środowisku biochemicznym na funkcję więzadeł. Ćwiczenia poprawiają funkcjonowanie komórek i narządów w różnych tkankach w całym ciele^2,3,12, efekt, który można przypisać uwolnieniu różnych znanych (np. IL-6¹³, IL-15¹⁴, Meteorin-like¹⁵, exosomes^16,17) i inne nieznane, biochemiczne czynniki uwalniane do krążenia ogólnoustrojowego. Ponadto środowisko biochemiczne po wysiłku jest wzbogacone o hormony reagujące na wysiłek fizyczny, których uwalnianie jest stymulowane przez stymulację współczulnego układu nerwowego gruczołów wydzielniczych (np. kortyzol i katecholaminy z nadnerczy¹⁸, oraz hormon wzrostu z przedniego płata przysadki mózgowej¹⁹). Jednakin vivo niemożliwe jest odróżnienie skutków bodźca mechanicznego związanego z wysiłkiem fizycznym od zmian biochemicznych wywołanych wysiłkiem fizycznym. Podczas gdy niektóre badania charakteryzowały oczekiwany wzrost niektórych krążących hormonów i cytokin w odpowiedzi na ćwiczenia, jak wspomniano powyżej, istnieje zbyt wiele czynników, zarówno znanych, jak i nieznanych, aby wiernie podsumować in vitro. Oznacza to, że wyizolowanie kilku czynników w badaniu in vitro w niewystarczający sposób rozwiązuje problem złożoności odpowiedzi biochemicznej. W tym badaniu zbadaliśmy, w jaki sposób zmiany w środowisku biochemicznym surowicy, wywołane ćwiczeniami, wpływają na zmodyfikowaną funkcję więzadeł. Aby wyizolować skutki zmian biochemicznych, uzyskaliśmy surowicę od uczestników przed i po treningu oporowym i zastosowaliśmy ją do leczenia więzadeł 3D utworzonych przy użyciu ludzkich fibroblastów więzadła krzyżowego przedniego (ACL). Korzystając z tego modelu, możemy uzyskać dane funkcjonalne, w tym wpływ na właściwości mechaniczne i zawartość kolagenu, a także określić ilościowo wpływ na sygnalizację molekularną.

Protokół

Następujące procedury są zgodne z protokołem, który został zatwierdzony przez Institutional Review Board of University of California, Davis; skonsultuj się z lokalną komisją etyki przed rozpoczęciem badań.

1. Izoluj pierwotne fibroblasty od ludzkich pozostałości ACL

UWAGA: Zachowaj sterylność i wykonaj wszystkie kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC).

1. Uzyskanie zgody odpowiedniej komisji ds. etyki na pobieranie i wykorzystywanie tkanek ludzkich w sposób opisany poniżej.
2. Przygotuj 5x roztwór antybiotyku/antybiotyku (ABAM), rozcieńczając 100x roztwór antybiotyku/antybiotyku w 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)
3. Zebrać fragmenty tkanek ACL w 5X roztworze ABAM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, przechowywać w temperaturze 4 °C do etapu trawienia. W razie potrzeby pokrój tkankę na mniejsze fragmenty żyletką do maksymalnego rozmiaru 1 x 1 x 1 cm³,
   UWAGA: Przestrzegaj lokalnych przepisów dotyczących zagrożeń biologicznych dotyczących prawidłowego stosowania materiałów stanowiących zagrożenie biologiczne oraz odkażania i usuwania odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.
4. Przygotuj wystarczającą objętość roztworu kolagenazy, aby zanurzyć fragmenty tkanki. Rozpuść kolagenazę typu II (1 mg / ml) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy Dulbecco zawierającym 1x penicylinę/streptomycynę i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i przefiltruj przy 0,22 μm.
5. Wypłucz tkankę ACL 3 razy w PBS.
6. Trawić tkankę. Przenieś tkankę ACL do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 ml i dodaj wystarczającą objętość roztworu kolagenazy, aby zanurzyć tkankę. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (~17 h).
7. Przed zakończeniem czasu trawienia przygotuj pożywkę wzrostową (GM), uzupełniając pożywkę DMEM o wysokiej zawartości glukozy 10% FBS i 100 U/ml penicyliny.
8. Na 15 minut przed zakończeniem czasu trawienia należy krótko wymieszać rurkę zawierającą 50 ml z tkanką 3 razy co 5 minut.
9. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml energicznie rozdrobnić strawioną tkankę, aby dalej rozbić tkankę i usunąć komórki.
10. Wirować przy 1 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml GM.
11. Powtórz kroki 1.8-1.9 jeszcze trzy razy.
12. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 5-10 ml GM. Użyj małej próbki zawiesiny komórek, aby wykonać zliczanie komórek za pomocą hemocytometru i ocenić żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego.
13. Zawiesinę komórkową należy umieścić na 15 cm płytkach do hodowli tkankowych o gęstości 3-4 x 10⁵ komórek na płytkę.
14. Hodowla do 70% konfluencji w sterylnym inkubatorze utrzymywana w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} zmieniając GM co trzy dni. Używaj lub przechowuj (patrz poniżej) komórki w 5 przejściach.
15. Zamroź komórki do wykorzystania w przyszłości.
    1. Trypsynizuj komórki przy 70% zbieganiu w następujący sposób. Odessać pożywkę i przepłukać komórki PBS. Dodaj tyle wstępnie podgrzanej (37 °C) 0,05% trypsyny, aby pokryć spód płytek do hodowli tkankowych. Umieść płytki w inkubatorze hodowlanym na ~5 minut, aż komórki zostaną odłączone (sprawdź, czy komórki unoszą się na wodzie, używając mikroskopu świetlnego). Użyj pipety, aby zebrać komórki i dozować do probówki Falcon.
    2. Wirować do komórek osadzających i ponownie zawiesić komórki w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 20% FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Podwielokrotną zawiesinę komórek umieścić w kriowiach i schłodzić w temperaturze -1 °C/min przez co najmniej 24 godziny. Przechowuj zamrożone kriowiale w ciekłym azocie.

2. Przygotuj talerze pokryte silikonem

1. Przygotuj płytki do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm: Zdejmij pokrywki i rozłóż otwarte płytki na płaskiej powierzchni.
2. Wymieszaj zestaw elastomerów silikonowych zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml należy dozować około 2 ml na płytkę o średnicy 35 mm.
4. Pozostaw silikon do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni.

3. Przygotuj kotwy cementowe Brushite

1. Wcześniej przygotuj silikonowe formy odwrotne zawierające cylindryczne studnie do formowania kotwy. Formy odwrócone mogą być wykonane zgodnie ze specyfikacjami pożądanego kształtu i rozmiaru kotwy.
   1. Określ żądaną wysokość i średnicę końcowej kotwy. Protokół ten wykorzystuje wykonaną na zamówienie formę uformowaną z silikonu rzemieślniczego w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm, w którym umieszczono plastikowe cylindry o średnicy około 3,25 mm, co pozwala na uzyskanie ostatecznej wysokości formy około 6,5 mm. Ostateczne wymiary kotwy to około 3-3,5 mm wysokości i około 3,4 mm średnicy z kołkiem 1,5 mm wystającym z dolnej części kotwy.
   2. Dodaj nieutwardzony silikon do naczynia o średnicy 35 mm, w którym będzie wykonywana forma. Umieść odpowiednio plastikowe cylindry.
      UWAGA: Rozmiar plastikowych cylindrów określi średnicę końcowych kotew. Rozmieszczenie plastikowych cylindrów i ilość użytego silikonu można modyfikować w celu uzyskania kotew o różnych wysokościach. Grubość między dnem studzienek w formie a dnem samej formy określi, ile kołka może wystawać z dna kotwy, umożliwiając późniejsze bezpieczne przypięcie kotwy w naczyniu pokrytym silikonem.
   3. Po pozostawieniu silikonu do utwardzenia wyjmij plastikowe cylindry i wyjmij formę z naczynia 35 mm.
2. Przygotować 3,5 M roztwór ortofosforu/100 mM kwasu cytrynowego. Rozpuść 0,961 g kwasu cytrynowego w 11,5 ml kwasu ortofosforowego. Doprowadzić objętość roztworu do 50 ml wodą MilliQ. Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
3. Przygotuj formy: Umieść jedną minutową szpilkę na środku każdej cylindrycznej studzienki w foremkach.
4. Połączyć β-triwapniowy fosforan i roztwór ortofosforu/kwasu cytrynowego o stężeniu 1 g/ml w plastikowej łódce wagowej na lodzie.
5. Energicznie wymieszaj cement za pomocą plastikowego skrobaka do komórek.
6. Rozetrzeć cement, aby kontynuować mieszanie i pipetować mieszaninę do formy
7. Odwirować napełnioną formę przez 1 minutę przy 2 250 x g.
8. Pozwól, aby kotwy z cementu szczotkitowego zastygły w temperaturze pokojowej przez noc.
9. Wyjmij kotwy z formy i przypnij dwie kotwy w odległości 12 mm od siebie w każdej płytce pokrytej silikonem.
10. Wysterylizuj przypięte płytki, spryskując je 70% etanolem, wypełniając zarówno płytki, jak i pokrywki, a następnie umieszczając w BSC. Po upływie co najmniej 30 minut należy zassać płytki i wymienić pokrywki, przechowując je w BSC do czasu, gdy będą potrzebne.

4. Zdobądź ludzką surowicę

1. Upewnij się, że uzyskano zgodę odpowiedniej komisji ds. oceny etycznej dla tego protokołu.
2. Upewnij się, że uzyskano pisemną świadomą zgodę od ludzi na udział w danej interwencji (np. ćwiczeniach, interwencji żywieniowej lub lekowej), która spowoduje pożądane zmiany w surowicy. Tutaj opisujemy kolekcję w spoczynku i 15 minut po ćwiczeniach oporowych.
3. Korzystając z przeszkolonego flebotomi, pobierz próbkę krwi spoczynkowej od uczestnika przez nakłucie dożylne do odpowiedniego opróżnionego pojemnika.
4. Zbierz próbkę krwi po wysiłku 15 minut po tym, jak uczestnicy zaangażują się w pożądany protokół ćwiczeń. Jak opisano wcześniej¹, użyj protokołu ćwiczeń oporowych w tym eksperymencie, aby stymulować endogenną odpowiedź biochemiczną.
   1. Poproś uczestników, aby wykonali pięć serii wyciskania nóg z minutową odpoczynką między seriami. Następnie poproś uczestników, aby wykonali kolejno serię wyprostów kolan i zestaw uginania ścięgien podkolanowych bez odpoczynku, a następnie powtórzyli ćwiczenia jeden po drugim z 1-minutowym odpoczynkiem między seriami.
5. Pozostawić krew do skrzepnięcia przed odwirowaniem w ilości 1 500 x g przez 10 minut. W sterylnych warunkach przenieść surowicę do sterylnych probówek w celu przyszłej suplementacji pożywką (surowica przechowywana w temperaturze 4 °C) i analizy biochemicznej (mała porcja surowicy przechowywana w temperaturze -20 °C).

5. Forma Więzadeł Inżynieryjnych

UWAGA: Zawczasu rozszerz pierwotne fibroblasty i przygotuj płytki pokryte silikonem z przypiętymi kotwami szczotkowymi.

1. Przygotuj odczynniki:
   1. Przygotować trombinę. Rozpuścić trombinę bydlęcą w stężeniu 200 U/ml w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Filtrować w temperaturze 0,22 μm, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotuj fibrynogen. Rozpuścić fibrynogen bydlęcy w stężeniu 20 mg/ml w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Inkubować przez 3-4 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, mieszając co 30 minut, aby ułatwić rozpuszczenie. Filtrować w temperaturze 0,22 μm (może być potrzebnych wiele filtrów), podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   3. Przygotuj aprotyninę. Rozpuścić aprotyninę w 10 mg/ml w wodzie. Filtrować w temperaturze 0,22 μm, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Przygotuj kwas aminoheksanowy. Rozpuść kwas aminoheksanowy w 0,1 g/ml w wodzie. Filtrować w temperaturze 0,22 μm, podwielokrotności i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   5. Przygotuj kwas askorbinowy. Rozpuścić kwas askorbinowy w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy w stężeniu 50 mM. Filtrować w temperaturze 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   6. Przygotuj L-prolinę. Rozpuścić L-prolinę w PBS w stężeniu 50 mM. Filtrować w temperaturze 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   7. Przygotować transformacyjny czynnik wzrostu-β1 (TGF-β1). Rozpuścić TGF-β1 zgodnie ze wskazówkami producenta w stężeniu 10 μg/ml. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Określ liczbę konstruktów wymaganych do eksperymentu i upewnij się, że przygotowana jest wystarczająca liczba przypiętych płytek. Zalecane są zarówno kontrpróby biologiczne, jak i techniczne. W wyróżnionym tutaj study¹ użyj zduplikowanych powtórzeń technicznych i 12 powtórzeń biologicznych (surowica od 12 osób w spoczynku i po wysiłku).
   UWAGA: Wykonaj następujące czynności w sterylnych warunkach w BSC.
3. Rozszerz komórki, hodując je na 15-centymetrowych płytkach do 70% konfluencji. 2,5 x 10 Na konstrukt potrzeba⁵ komórek.
4. Trypsynizuj komórki i ponownie zamieszaj w GMO w stężeniu 3,67 x 10⁵ komórek/ml.
5. Wygeneruj mieszankę wzorcową dla wymaganej liczby konstruktów: Dla 1 konstruktu mieszanka główna zawiera 681 μl zawiesiny komórek (zawierającej 2,5 x 10⁵ komórek), 29 μl trombiny, 2 μl aprotyniny i 2 μl kwasu aminoheksanowego.
6. Po dokładnym wymieszaniu mieszanki wzorcowej dodać 714 μl do każdej płytki przypiętej w kształcie "cyfry 8" wokół kotew cementowych brushite. Upewnij się, że mieszanka wzorcowa styka się bezpośrednio z bokami kotew.
7. Delikatnie postukaj w każdą płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę wzorcową na płycie.
8. Dla jednej płytki na raz szybko dodaj 286 μl fibrynogenu równomiernie kroplami na jednej płytce i natychmiast przesuwaj płytkę w przód iw tył oraz z boku na bok po powierzchni BSC, aby rozprowadzić fibrynogen w celu utworzenia żeli fibrynowych osadzonych w komórkach. Przejdź do następnej płyty.
9. Umieścić konstrukty w sterylnym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i inkubować przez co najmniej 15 minut, aby umożliwić polimeryzację fibrynogenu.
10. Przygotuj wystarczającą ilość pożywki (FM) na 2 ml na konstrukcję. Uzupełnij GM 200 μM kwasu askorbinowego, 50 μM proliny i 5 ng/ml TGF-β1.
11. Dodaj 2 ml FM, aby pokryć każdy konstrukt. Hodować konstrukty w sterylnym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez łącznie 14 dni lub do pożądanego punktu końcowego, odświeżając pożywkę co drugi dzień za pomocą 2 ml FM

6. Testy rozciągania Więzadła inżynieryjne

UWAGA: Próba rozciągania została przeprowadzona przy użyciu specjalnie skonstruowanego testera rozciągania w kąpieli PBS; odwrócono formowane uchwyty, które są połączone z przetwornikiem siły, utrzymują kotwy z cementu szczotkowego na miejscu podczas testu.

1. Określ długość i szerokość konstrukcji więzadeł za pomocą suwmiarki cyfrowej; oblicz pole przekroju poprzecznego tkanki.
2. Odpiąć konstrukcję więzadła od płyty i umieścić kotwy w odwróconych formowanych uchwytach, upewniając się, że konstrukcja jest zanurzona w PBS.
3. Dostosuj odległość między uchwytami, ustawiając długość konstrukcji na jej początkową długość.
4. Rozpocznij test: odkształc konstrukcję do uszkodzenia z prędkością odkształcenia 0,4 mm/s (lub ~3%/s).
5. Po zakończeniu badania należy przetworzyć resztki tkanek pod kątem zawartości kolagenu (patrz punkt 7).
6. Na podstawie wynikowych danych obciążenia-odkształcenia obliczyć dane naprężenie-odkształcenie i określić ilościowo interesujące właściwości mechaniczne, na przykład maksymalne obciążenie rozciągające, ostateczną wytrzymałość na rozciąganie i moduł (tj. właściwość sprężystości w liniowym obszarze krzywej naprężenie-odkształcenie).

7. Kwantyfikacja zawartości kolagenu w zmodyfikowanych więzadłach

1. Usunąć więzadła inżynieryjne z kotew szczotkowo-cementowych i suszyć w temperaturze 120 °C przez 25 minut.
2. Określić suchą masę konstruktów i umieścić w pojedynczych probówkach o pojemności 1,5 ml. Suche konstrukcje mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej do czasu dalszej obróbki.
3. Do każdego konstruktoru dodać 200 μl 6 M HCl. Gotować w temperaturze 120 °C w bloku grzewczym przez 2 godziny w dygestorium.
   UWAGA: HCl jest silnie i kwaśny, zaleca się stosowanie rurek odpornych na gotowanie/safe-lock lub innej metody zabezpieczania rur.
4. Odwirować rurki na krótko, aby zebrać płyn, i pozostawić je bez pokrywy do odparowania w temperaturze 120 °C w bloku grzewczym przez 1,5 godziny w dygestorium.
5. Zawiesić otrzymany osad w 200 μl buforu hydroksyproliny. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.
   1. Przygotować bufor hydroksyproliny. W 300 ml wody dodaj 16,6 g kwasu cytrynowego, 4 ml kwasu octowego, 11,4 g NaOH i mieszaj aż do rozpuszczenia. pH do 6-6,5 i zwiększyć objętość do 500 ml. Dodać 250 μl toluenu jako środek konserwujący i przechowywać w temperaturze 4 °C w sposób chroniony przed światłem.
6. Przygotuj odczynniki.
   1. Przygotuj trans-4-hydroksy-L-prolinę. Rozpuścić w wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu 4 mg/ml.
   2. Przygotować chloraminę-T. Rozpuścić w wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu 14,1 mg/ml.
   3. Przygotować nadchloran aldehydu. Rozpuść 1,5 g 4-dimetyloaminobenzaldehydu w 6 ml 1-propanolu, 2,6 ml kwasu nadchlorowego (UWAGA:, silny utleniacz, należy zachować odpowiednie środki ostrożności) i 0,5 ml wody.
7. W zestawie nowych probówek o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć próbkę każdego zawieszonego osadu w buforze hydroksyproliny do objętości 200 μl.
   UWAGA: Rozcieńczenia mogą wynosić od 1:4 do 1:50 próbki:bufor w zależności od oczekiwanej zawartości kolagenu w próbce; W związku z tym może być konieczne przeprowadzenie testów metodą prób i błędów w celu określenia współczynnika rozcieńczenia, który jest odpowiedni dla danego zestawu próbek (tj. Umieszczenie próbek w kierunku środka krzywej wzorcowej).
8. Przygotuj wzorce hydroksyproliny. Rozcieńczyć hydroksyprolinę w buforze hydroksyproliny (patrz sekcja 7.5.1) do 80 μg/ml. Wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby uzyskać 6-8 200 μL wzorców w zakresie 0-20 μg/ml.
9. Dodać 150 μl 14,1 mg/ml roztworu chloraminy T do każdej wzorcowej i rozcieńczonej próbki. Wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
10. Dodać 150 μl roztworu nadchloranu aldehydu do każdej próbki i rozcieńczonej próbki. Wirować i inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 60 °C przez 15 minut. Nadmiar roztworu nadchloranu aldehydu należy usunąć jako odpad niebezpieczny zgodnie z lokalnymi przepisami (zawiera kwas nadchlorowy).
11. Pozostawić wzorce i próbki do ostygnięcia, a następnie podzielić 200 μl każdej z nich, w dwóch częściach, na płytki 96-dołkowe.
12. Odczytać płytkę przy długości fali 550 nm w spektrofotometrze. Płytkę i pozostałą objętość należy wyrzucić do probówek o pojemności 1.5 ml jako odpad niebezpieczny zgodnie z lokalnymi przepisami (zawiera kwas nadchlorowy).
13. Obliczanie całkowitego kolagenu i frakcji kolagenu.
    1. Przeliczyć wartość absorbancji dla każdej próbki na mikrogramy hydroksyproliny, stosując krzywą wzorcową hydroksyproliny.
    2. Pomnóż każdy studzienek przez 2,5, aby obliczyć ilość hydroksyproliny w rozcieńczonej próbce. Przypomnijmy, że do każdej próbki dodaje się tylko 200 z 500 μl całkowitej mieszaniny (200 μl rozcieńczonej próbki + 150 μl chloraminy T + 150 μl roztworu AP).
    3. Pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia (sekcja 7.7), aby obliczyć ilość hydroksyproliny w oryginalnej próbce.
    4. Podziel przez 0,137, aby obliczyć ilość kolagenu (zakładamy, że kolagen zawiera 13,7% hydroksyproliny²⁰).
       UWAGA: Obfitość hydroksyproliny u ssaków w kolagenie różni się nieznacznie w zależności od tkanek i gatunków ssaków; na przykład ścięgno Achillesa świni i owcy zawiera odpowiednio 13,5 i 13,7% (masa hydroksyproliny/masa suchej tkanki)²¹. Tutaj użyj 13,7%, aby oszacować procentową zawartość hydroksyproliny w kolagenie, która służy do obliczania zawartości kolagenu w próbce tkanki przy użyciu następującego równania:
       
    5. Podziel przez suchą masę, aby obliczyć frakcję kolagenu i przelicz na procent.
       

8. Kwantyfikacja molekularnych punktów końcowych

UWAGA: Oprócz podstawowych wyników testów rozciągania i zawartości kolagenu, molekularne punkty końcowe mogą być mierzone na tkance 2D lub 3D, aby dodać mechanistycznego wglądu. Testy biologiczne mogą być stosowane do określania molekularnych punktów końcowych (patrz następna sekcja poniżej, aby zapoznać się z kontekstem: Wpływ środowiska surowicy po wysiłku fizycznym na funkcję więzadeł in vitro).

1. Dla tkanki 3D:
   1. Przygotuj konstrukcje zgodnie z krokiem 5 powyżej.
   2. Po zabiegu/interwencji konstrukcyjnej, konstrukty z zatrzaskowym zamrożeniem w ciekłym azocie.
   3. Za pomocą moździerza i tłuczka schłodzonego na suchym lodzie zmiel konstrukcje na proszek. Kontynuuj w kroku 8.4/5).
2. Dla tkanki 2D:
   1. Hodowla ludzkich fibroblastów ACL do konfluencji w monowarstwie na sześciodołkowych płytkach zawierających DMEM.
   2. Odessać DMEM i zastosować pożywkę leczniczą zgodnie ze strategią eksperymentów (np. eksperymenty z przebiegiem w czasie lub dawką i reakcją).
   3. Odessać pożywkę zabiegową i przepłukać komórki PBS.
   4. Zeskrobać komórki w celu zebrania za pomocą odpowiedniego bufora/odczynnika ekstrakcyjnego (patrz dalej).
3. Analiza ekspresji białek: Użyj cytozolowego buforu ekstrakcyjnego (np. 250 mM sacharozy, 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM MgCl2 i koktajlu inhibitorów proteazy/fosfatazy) w celu uzyskania lizatów białkowych. Wykonaj test stężenia białka i kontynuuj analizę zgodnie ze standardowymi procedurami western blot.
4. Analiza ekspresji genów: Wyizoluj całkowite RNA za pomocą 500 μl odczynnika do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać wysokiej jakości RNA. Wykonuj odwrotną transkrypcję i ilościową analizę PCR w czasie rzeczywistym zgodnie ze standardowymi procedurami.
5. Izolacja DNA: Wyizoluj i określ ilościowo genomowe DNA za pomocą odczynnika do izolacji DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrofotometru do pomiaru absorbancji próbki przy długości fali 260 nm.

Wyniki

Przegląd inżynieryjnego tworzenia więzadeł i eksperymentalnej interwencji

Rysunek 1 pokazuje przegląd powstawania więzadeł inżynieryjnych. Cement szczotkitowy, materiał substytut kości²² jest wytwarzany przez połączenie roztworu kwasu ortofosforowego/kwasu cytrynowego z fosforanem β-trójwapniowym w cylindrycznych studzienkach. Alternatywnie, jeśli nie mierzy się bezpośrednio funkcji mechanicznej tkanek, szwy jedwabne 3-0 mogą być stosowane jako kotwice w tworzeniu tkanki. Są one przypinane w odległości 12 mm od siebie w pokrytych silikonem naczyniach o średnicy 35 mm i sterylizowane przez namoczenie w 70% etanolu. Fibroblasty są izolowane z resztek więzadła krzyżowego przedniego uzyskanych podczas operacji rekonstrukcji ACL. Po rozprężeniu 2,5 x 10⁵ komórek zamyka się w żelu fibrynowym utworzonym w naczyniu z cementu szczotkitowego. Po utworzeniu konstrukty więzadeł można badać pod kątem zmian właściwości mechanicznych, zawartości kolagenu, proliferacji komórek, ekspresji genów, poziomów białek i morfologii tkanek.

Podczas hodowli, komórki kurczą żel fibrynowy i tworzą liniową tkankę pomiędzy dwoma kotwicami (Rysunek 2A). Po 1-2 dniach w hodowli komórki przyczepiły się do żelu fibrynowego, rozszerzyły procesy komórkowe i zaczęły wywierać siły trakcyjne (Rysunek 2B). Gdy żel fibrynowy jest kurczony przez siły trakcyjne i rozkładany przez enzymy komórkowe, między dwoma punktami zaczepienia generowane jest napięcie, a nasze komórki ustawiają się równolegle do tej osi (Rysunek 2B) i zaczynają odkładać kolagen. Po 4-5 dniach konstrukty kurczą się wokół kotwic, tworząc liniową cylindryczną tkankę (Rysunek 2A; w tym momencie do systemu mogą zostać zastosowane bodźce zewnętrzne (interwencja w tym czasie pozwala uniknąć zakłócenia procesu tworzenia liniowej tkanki). Interwencje mogą polegać na uzupełnieniu pożywki hodowlanej surowicą ludzką lub zwierzęcą po danej interwencji, egzogennymi cytokinami i czynnikami wzrostu, zastosowaniu stymulacji mechanicznej lub zmianie innych czynników środowiskowych, takich jak napięcie tlenu. Używając pożywek wzrostowych (DMEM z 10% FBS i 100 U / ml penicyliny) uzupełnionych 200 μM kwasem askorbinowym, 50 μM L-proliną i 5 ng / ml TGF-β1, ustaliliśmy, że proliferacja komórek trwa przez cały 2-tygodniowy okres hodowli (Figura 2C) i rzeczywiście, mikroskopia świetlna ujawnia gęstą tkankę zawierającą wysoce wyrównane komórki po 14 dniach hodowli (Figura 2B).

Ocena zaawansowanych więzadeł

Pod koniec okresu hodowli, zmodyfikowane więzadła mogą być oceniane na różne sposoby. Główną zaletą tego systemu jest możliwość określenia zmian funkcjonalnych w tkance za pomocą testów mechanicznych, co jest istotną oceną, biorąc pod uwagę mechaniczną rolę więzadła natywnego. Jednoosiowe próby rozciągania mogą być wykorzystywane do pomiaru właściwości mechanicznych, w tym obciążenia do uszkodzenia, wytrzymałości na rozciąganie i modułu Younga. Właściwości lepkosprężyste można również mierzyć za pomocą prób relaksacji naprężeń i pełzania. Rysunek 3A przedstawia zaprojektowane więzadło trzymane w odwróconych formowanych uchwytach w specjalnie zbudowanym jednoosiowym testerze rozciągania. Prawy uchwyt jest przymocowany do przetwornika siły w celu pomiaru obciążenia w poprzek więzadła, gdy tkanka jest napięta do uszkodzenia. Rysunek 3B pokazuje reprezentatywny wykres naprężenie-odkształcenie dla testu na niepowodzenie. Po poddaniu się testom mechanicznym, te same konstrukty mogą być suszone i przetwarzane do testu hydroksyproliny²³ w celu oceny całkowitej zawartości kolagenu, a także innych testów biochemicznych. Przy wystarczającej liczbie dodatkowych próbek na warunek można przeprowadzić dokładne badanie interwencji eksperymentalnej, w tym jej wpływu na proliferację komórek, ekspresję genów i białek oraz morfologię histologiczną. Podczas gdy 14 dni jest typowym punktem końcowym dla naszych badań, zmodyfikowane więzadła nadal poprawiają swoje właściwości mechaniczne i zawartość kolagenu przez 28 dni hodowli, jak pokazano w Rysunek 3C i mogą przetrwać co najmniej 3 miesiące w hodowli²⁴.

Zmienność dawcy jest ważnym czynnikiem wpływającym na powtarzalność eksperymentu. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywny eksperyment opisany przez Lee et al.²⁵ porównując 7 różnych dawców ACL (n = 3 mężczyzn i n = 4 kobiety) wykazujących typowe właściwości rozciągania i zawartość kolagenu po 2-tygodniowej hodowli w wcześniej opisanej pożywce z suplementem wzrostowym. Wykorzystując komórki z podobnych kolekcji ACL, wiek dawcy, czas po urazie, płeć itp., zmodyfikowane więzadła wykazują niską zmienność między dawcami i podobne cechy między dawcami płci męskiej i żeńskiej, z wyjątkiem różnicy we frakcji kolagenu. We wspomnianym badaniu zmodyfikowane więzadła zostały wykorzystane jako model in vitro w celu zbadania, dlaczego kobiety mają znacznie większe ryzyko uszkodzenia ACL niż mężczyźni, i wykazano, że fibroblasty ACL wyizolowane od dawczyń żeńskich nie tworzą z natury słabszych i mniej kolagenowych więzadeł inżynieryjnych²⁵.

Wpływ środowiska surowicy po wysiłku na funkcję więzadeł in vitro

Wcześniej zademonstrowaliśmy zdolność zmodyfikowanych więzadeł do badania procesów fizjologicznych^1,25. W poniższym reprezentatywnym eksperymencie, jak donosi West et al.¹, określiliśmy biochemiczne skutki ćwiczeń na funkcję więzadeł i podkreśliliśmy tutaj metodologię i wyniki. Utworzyliśmy zmodyfikowane więzadła przy użyciu ludzkich komórek ACL i zastosowaliśmy interwencję w 7 dniu hodowli, składającą się z pożywek hodowlanych kondycjonowanych ludzką surowicą pobraną przed lub po wysiłku. Krótko mówiąc, zrekrutowaliśmy zdrowych młodych uczestników płci męskiej i pobraliśmy próbki krwi przed i po ostrym ataku ćwiczeń oporowych, które zwiększają poziom krążących hormonów i cytokin, w tym ludzkiego hormonu wzrostu (GH). Surowicę ludzką wyizolowano z próbek krwi pobranych przed i po wysiłku fizycznym i użyto zamiast płodowej surowicy bydlęcej w pożywce hodowlanej w drugim tygodniu zmodyfikowanej hodowli więzadeł (Ryc. 5A). Próbki surowicy przed i po wysiłku analizowano za pomocą testu ELISA pod kątem zmian GH i insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1), których stężenie można zmienić przez ćwiczenia (Figura 5B). Informacje te wykorzystano do skorelowania wpływu surowicy na zmodyfikowane więzadła ze zmianami w surowicy w odpowiedzi na ćwiczenia. Po 14-dniowym okresie hodowli konstrukcje więzadeł oceniono za pomocą testów mechanicznych i oznaczenia zawartości kolagenu hydroksyproliną i wykazano znaczny wzrost zarówno maksymalnego obciążenia rozciągającego, jak i zawartości kolagenu w odpowiedzi na surowicę powysiłkową. W celu oceny, czy efekt ten był związany z wywołanym wysiłkiem uwalnianie GH lub IGF-1, zmodyfikowane więzadła utworzono w oddzielnym eksperymencie i potraktowano reakcją na dawkę ludzkiego rekombinowanego GH lub IGF-1. Co ciekawe, podczas gdy stężenie GH w surowicy wzrosło we krwi (Ryc. 5B-i), stopniowe zwiększanie stężenia rekombinowanego GH w pożywkach hodowlanych nie zwiększyło zawartości kolagenu (Rycina 5D-i) ani właściwości mechanicznych (dane nie pokazane) w zmodyfikowanych więzadłach. W przeciwieństwie do tego, poziomy IGF-1 w surowicy nie wzrosły po wysiłku, ale eksperyment dawka-odpowiedź wykazał, że wzrost poziomu w pożywce hodowlanej poprawił zawartość kolagenu w konstruktach więzadeł (Ryc. 4D-ii). Tak więc, podczas gdy ćwiczenia spowodowały znaczny wzrost GH po wysiłku, eksperyment dawka-odpowiedź z użyciem rhGH budzi wątpliwości co do tego, czy GH jest bezpośrednio odpowiedzialny za fenotypowe wzmocnienie zmodyfikowanych więzadeł (przynajmniej sama izoforma 22 kDa nie wydaje się być odpowiedzialna). I odwrotnie, podczas gdy IGF-1 w surowicy nie został zmieniony po 15 minutach po wysiłku, testowanie rhIGF-1 w szerokim zakresie stężeń wykazało, że IGF-1 jest w stanie poprawić zawartość kolagenu; Należy jednak zauważyć, że zwiększenie stężenia rhIGF-1 w zakresie, który szacował poziomy fizjologiczne, nie zwiększyło znacząco zawartości kolagenu. W związku z tym unikalne środowisko surowicy po wysiłku było ważne dla poprawy mechaniki i kolagenu zmodyfikowanych więzadeł.

W badaniu wyróżnionym tutaj¹, objętość eksperymentalnej surowicy była ograniczona ze względów etycznych; tak więc, krótkoterminowe testy biologiczne 2D, które miały niższe wymagania dotyczące surowicy, zostały wykorzystane do dalszego zbadania mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za obserwowany wzrost kolagenu. Fibroblasty ACL hodowano do konfluencji na płytkach 6-dołkowych i traktowano przez 1 godzinę surowicą spoczynkową lub powysiłkową, a następnie porównano z odpowiedziami na dawkę rekombinowanego GH, IGF-1, TGF-β1 i określono aktywację celów w szlakach sygnałowych PI3K / mTORC1, ERK1 / 2 i Smad. W obecności surowicy powysiłkowej szlak PI3K/mTORC1 i ERK1/2 wykazywał większą aktywację, co oceniano na podstawie fosforylacji odpowiednio S6K (Rysunek 5D-i) i ERK1/2 ( Figura 5D-ii). W porównaniu z odpowiedziami na dawkę hormonu i cytokin, podczas gdy GH miał niewielki pozytywny wpływ na sygnalizację mTOR (Figura 5D-i), a IGF-1 wykazał pozytywny wpływ przy najniższej dawce, trzy zabiegi GH, IGF-1 i TGF-a1 nie uwzględniały wzrostu sygnalizacji PI3K / mTORC1 i ERK1 / 2. Podsumowując, nasz model więzadeł 3D i dane z testów biologicznych 2D sugerują, że środowisko surowicy po wysiłku jest w stanie poprawić zmodyfikowaną funkcję więzadeł i zawartość kolagenu poprzez aktywację szlaków PI3K/mTORC1 i ERK1/2.

Podsumowując, korzystając z zmodyfikowanego modelu więzadeł w połączeniu z serum kondycjonowanym ćwiczeniami, byliśmy w stanie i) zbadać wpływ środowiska surowicy po wysiłku na zmodyfikowaną funkcję więzadeł i kolagen, ii) skorelować zmiany w fenotypie więzadeł ze zmianami stężenia hormonów w surowicy, w celu określenia, które zmiany w surowicy doprowadziły do zmian w zmodyfikowanych więzadłach, oraz iii) rozszerzenie zakresu prac poprzez wykorzystanie testów biologicznych 2D do badania celów molekularnych środowiska biochemicznego surowicy w celu określenia mechanizmów molekularnych, które są aktywowane przez surowicę po wysiłku, co prowadzi do poprawy funkcji więzadeł.

Rysunek 1: Przegląd tworzenia i stosowania zmodyfikowanych więzadeł. Kotwy cementowe Brushite są produkowane i kołkowane w płytach pokrytych silikonem. Pierwotne fibroblasty są izolowane i rozwijane z resztek ACL. Zmodyfikowane więzadła są tworzone przez zamknięcie fibroblastów w żelu fibrynowym wokół dwóch kotew z cementu szczotkowego. Zmodyfikowane więzadła są hodowane i traktowane dowolnymi określonymi bodźcami chemicznymi lub mechanicznymi (np. za pomocą bioreaktora). W pożądanym punkcie końcowym można pobrać zmodyfikowane więzadła i ocenić je pod kątem właściwości mechanicznych, ekspresji genów, zawartości kolagenu, ekspresji białek i histologii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Pierwotne fibroblasty więzadeł tworzą oparte na fibrynie więzadło typu kość-kość, obejmujące dwie kotwy z cementu szczotkitowego. (A) Z biegiem czasu fibroblasty kurczą żel fibrynowy wokół kotwic cementu szczotkowego, tworząc liniową tkankę. (B) W ciągu pierwszych trzech dni komórki przyczepiają się do żelu fibrynowego i wywierają siły trakcyjne, wyrównując komórki z długą osią konstruktu. W ciągu 14 dni komórki tworzą wysoce wyrównaną tkankę. Pasek skali = 160 μm. (C) Zawartość DNA w zmodyfikowanych więzadłach wzrasta w ciągu 14 dni w hodowli w miarę namnażania się komórek. Dane są prezentowane jako średnia ± SD przy n = 3-4 konstruktach na grupę. Grupy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Właściwości mechaniczne więzadeł inżynieryjnych i zawartość kolagenu poprawiają się z czasem. (A) Konstrukcje więzadeł są poddawane testom rozciągania jednoosiowego w celu określenia wpływu danej interwencji na funkcję więzadła. Jak pokazano, dwa odwrócone, drukowane w 3D uchwyty utrzymują kotwy o wzajemnym kształcie, które są mostkowane przez zaprojektowane ścięgna. Kotwy są sprzężone z silnikiem krokowym i przetwornikiem siły w celu wygenerowania krzywych naprężeń/odkształceń badanej tkanki, co pozwala na określenie właściwości mechanicznych. (B) Reprezentatywna krzywa naprężenie-odkształcenie od zaprojektowanego więzadła napiętego do uszkodzenia. W ciągu 28 dni (C) ostateczna wytrzymałość na rozciąganie (UTS), (D) maksymalne obciążenie rozciągające (MTL), (E) moduł Younga i (F) frakcja kolagenu nadal się poprawiają. Dane są prezentowane jako średnia ±SD z n = 5 konstruktów na grupę. * wskazuje na istotną różnicę w stosunku do wszystkich innych grup. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Zmodyfikowane więzadła można ocenić pod kątem funkcjonalności i zawartości biochemicznej, wykazując niską zmienność dawcy. Zmodyfikowane więzadła utworzono u 7 różnych dawców (n = 3 męskie, n = 4 żeńskie). Po 2 tygodniach hodowli oceniano je pod kątem różnic w (A) maksymalnym obciążeniu rozciągającym, (B) ostatecznej wytrzymałości na rozciąganie (UTS), (C) module Younga, (D) polu przekroju poprzecznego (CSA), (E) całkowitej zawartości kolagenu na konstrukt oraz (F) kolagenu jako frakcji suchej masy. Dane przedstawiono jako średnią ± SD, a istotność statystyczną stwierdzono w teście t-Studenta. * wskazuje na istotną różnicę w stosunku do innych grup (p <0,05). Rysunek zaczerpnięty z Lee et al.²⁵ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Zmodyfikowane więzadła wykazują zmiany mechaniczne i biochemiczne w odpowiedzi na interwencje biologiczne. (A) Surowicę wyizolowano z krwi pobranej od osób przed (RestTx) i po wysiłku (ExTx) i zastosowano w leczeniu zmodyfikowanych więzadeł w drugim tygodniu hodowli. (B) (i) Poziomy ludzkiego hormonu wzrostu (GH) i (ii) insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF)-1 w surowicy reszty i wysiłku oznaczono ilościowo za pomocą testu ELISA. (C) Zmodyfikowane więzadła poddane działaniu ExTx wykazały poprawę (i) zawartości kolagenu i (ii) maksymalnego obciążenia rozciągającego. Istotność statystyczną sparowanych porównań (RestTx i ExTx) analizowano za pomocą testu t z poziomem istotności ustalonym na p <0,05. (D) Dawka-odpowiedź (i) GH i (ii) IGF-1 została wykorzystana do określenia możliwego udziału tych czynników w zmianach zawartości kolagenu spowodowanych ExTx. E) Testy biologiczne 2D wykorzystano do porównania wpływu zwiększania dawek GH, RestTx i ExTx na molekularne cele sygnalizacyjne, takie jak fosforylacja (i) S6K^Thr389 i (ii) ERK1/2^{Thr202/Tyr204}. Porównanie statystyczne więcej niż dwóch grup eksperymentalnych przeprowadzono przy użyciu ANOVA i HSD Tukeya. Dane przedstawiono w postaci średniej ± SD. * wskazuje na istotną różnicę w stosunku do kontroli (p <0,05), a § wskazuje na istotną różnicę między 150 ng/ml a 300 ng/ml IGF-1. Rysunek zaczerpnięty z West et al.¹ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niniejszy manuskrypt opisuje model tkanki więzadła, który jest użyteczną platformą eksperymentalną dla badaczy o szerokim spektrum tematów badawczych, od rozwoju tkanek po pytania translacyjne/kliniczne. Opisany tutaj model więzadłowy oparty jest na wszechstronnym protokole, który można dostosować w różnych momentach całego przepływu pracy (rysunek 1 i sekcja dyskusji). Co więcej, z natury redukcjonistyczny charakter środowiska in vitro może być przybliżony do sfery fizjologicznej poprzez uzupełnienie pożywek paszowych kondycjonowaną surowicą ludzką lub zwierzęcą.

Konstrukty mogą być tworzone przy użyciu fibroblastów z różnych źródeł
Podczas gdy przedstawiona tutaj metodologia i reprezentatywne wyniki opierają się na użyciu pierwotnych fibroblastów ACL, protokół izolacji komórek można dostosować do zbierania innych typów pierwotnych fibroblastów. Jak opisano na rycinie 4, zmodyfikowane więzadła utworzone z komórek pierwotnych wyizolowanych od młodych ludzkich dawców wykazują niską zmienność dawcy. Komórki pierwotne są ograniczone przez początkową izolację i ograniczenie przejścia; Wykorzystanie linii komórkowych może poprawić odtwarzalność eksperymentów. Stosowanie innych typów komórek może wymagać modyfikacji pożywek do hodowli komórkowych i preparatu żelu fibrynowego. Na przykład zaobserwowaliśmy, że ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) nie są w stanie tworzyć liniowych tkanek między kotwicami cementu szczotkitowego w ciągu 2 tygodni, podczas gdy fibroblasty ścięgien zginaczy palców koni górnych, komórki zrębu szpiku kostnego koni, fibroblasty ścięgien zarodkowych piskląt i mysie C3H10T1/2 MSC szybko kurczą się i trawią żel fibrynowy, tworząc tkankę liniową (niepublikowane obserwacje). Kontrast ten może być konsekwencją różnic w kurczliwości komórek, proliferacji i produkcji enzymów fibrynolitycznych.

Zastosowanie stymulacji chemicznej i mechanicznej
W opisanej tu metodzie tkanka na bazie fibryny tworzy się wokół kotew z cementu szczotkowego, co pozwala na zastosowanie stymulacji mechanicznej za pomocą bioreaktora rozciągającego¹¹, a także na próbę rozciągania w punkcie końcowym. Obecność granicy między cementem szczotkowym a tkanką miękką (przyczepy ścięgniste) również stanowi okazję do dalszych badań i ulepszeń^22,26 (patrz sekcja Zastosowania kliniczne poniżej). W tym środowisku in vitro można łatwiej zidentyfikować wpływ czynników chemicznych i mechanicznych; Przykład tego pokazano na rycinie 5, gdzie wpływ środowiska surowicy po wysiłku został oddzielony od bodźców mechanicznych związanych z wysiłkiem. Badania pilotażowe mogą być konieczne w celu określenia ram czasowych interwencji eksperymentalnych, składu leczenia i odpowiednich punktów końcowych, aby oczekiwać obserwowalnej zmiany. Na przykład w badaniu¹ surowicy po wysiłku długość eksperymentalnego leczenia była ograniczona przez dostarczanie surowicy używanej do uzupełniania pożywki, z której konstrukty podawano co drugi dzień. Ponadto, w drugim tygodniu hodowli, pożywki hodowlane uzupełniono surowicą spoczynkową lub powysiłkową z kwasem askorbinowym i L-proliną, utrzymując się, podczas gdy TGF-β1 został usunięty. TGF-β1 jest znanym pro-zwłóknieniowym czynnikiem wzrostu, który zwiększa się w surowicy po wysiłku²⁷. Dlatego, aby uniknąć zaciemnienia związanych z TGF-β1 efektów surowicy powysiłkowej, cytokina ta nie była utrzymywana w pożywkach hodowlanych.

Ten zmodyfikowany model więzadła może być również używany do testowania wpływu rozciągania mechanicznego. Poprzez inżynierię odwróconych modelowanych uchwytów do przytrzymywania końców kotew z cementu szczotkowego (podobnie jak jednoosiowy tester rozciągania przedstawiony na rysunku 1), bioreaktory rozciągane można zaprojektować tak, aby pomieścić więzadła inżynieryjne. Nasze laboratorium wcześniej wykorzystywało ten model do badania odpowiedzi sygnalizacji molekularnej zmodyfikowanych więzadeł na jednoosiowe rozciąganie w specjalnie wykonanym bioreaktorze¹¹ , co zapewni lepsze zrozumienie racjonalnego projektowania paradygmatu rozciągania in vitro , a nawet, potencjalnie, zastosowań rozciągliwych/aktywności/terapeutycznych in vivo.

Ocena więzadeł inżynieryjnych
Podobnie jak w przypadku tradycyjnej hodowli jednowarstwowej, konstrukty 3D mogą być testowane pod kątem ekspresji genów/białek; ponadto ich morfologia 3D daje również możliwość oceny zmian funkcjonalnych i morfologicznych, a konstrukty mogą być utrzymywane w kulturze do długoterminowych badań (ryc. 3). Chociaż zmodyfikowane więzadła nie są równoważne z natywnymi, dojrzałymi więzadłami, są podobne do rozwijających się ścięgien / więzadeł i zachowują się podobnie do tkanki natywnej w odpowiedzi na składniki odżywcze²⁶, czynniki wzrostu¹⁰, hormony²⁵ i ćwiczenia^11,28. Tak więc, chociaż należy zachować ostrożność przed dokonaniem szerokich uogólnień na podstawie jakiegokolwiek modelu in vitro, wyniki testów konstrukcji więzadeł mogą ujawnić lub poinformować o określonym mechanizmie fizjologicznym, który w przeciwnym razie mógłby być niemożliwy do zbadania in vivo.

Uzupełniające podłoże paszowe z kondycjonowaną surowicą dla elastycznego i dynamicznego modelu o szerokim zastosowaniu
Metabolom ludzkiej surowicy to środowisko ~ 4,500 związków, w tym między innymi glikoprotein, lipoproteiny, pochodne lipidów, substraty energetyczne, metabolity, witaminy, enzymy, hormony, neuroprzekaźniki i mnóstwo bloków budulcowych / półproduktów. ²⁹ Dalsza kontrola metabolomu surowicy ludzkiej według klas związków²⁹ ujawnia dodatkowe korzyści płynące z włączenia surowicy doświadczalnej do doświadczeń in vitro. Oznacza to, że większość z ~4500 związków w surowicy jest hydrofobowa lub pochodząca z lipidów, co podkreśla znaczenie białek wiążących do transportu/rozpuszczania. Wynika z tego, że eksperymentalne podsumowanie endogennej dynamiki transportu związków, a co za tym idzie biodostępności i interakcji związek-cel, byłoby prawie niemożliwe. Tak więc surowica eksperymentalna jest szczególnie skuteczna w badaniu związków, o których wiadomo, że zależą od cząsteczek pomocniczych do rozpuszczania, transportu, wiązania celu i mechanizmu działania.

Nasze laboratorium od dawna interesuje się korzyściami zdrowotnymi płynącymi z ćwiczeń. Ćwiczenia poprawiają funkcjonowanie komórek i narządów w różnych tkankach w całym ciele¹², efekt, który można przypisać różnym czynnikom (np. IL-6¹³, IL-15¹⁴, Meteoryny¹⁵, egzosomy^16,17), które są uwalniane do krążenia ogólnoustrojowego. Środowisko biochemiczne po wysiłku fizycznym odzwierciedla czynniki uwalniane zarówno w wyniku skurczu hormonów reagujących na wysiłek mięśni szkieletowych, jak i czynników, które są uwalniane w wyniku stymulacji gruczołów wydzielniczych przez współczulny układ nerwowy (np. kortyzol i katecholaminy z nadnerczy¹⁸ oraz hormon wzrostu z przedniej części przysadki mózgowej¹⁹). Niedawno użyliśmy modelu surowicy przed i po wysiłku, aby zbadać wpływ środowiska biochemicznego wywołanego wysiłkiem fizycznym na zmodyfikowane tkanki. ¹ Chociaż pozostaje wiele ważnych pytań badawczych związanych z ćwiczeniami, model nie jest w żaden sposób ograniczony. Na przykład surowicę można uzyskać ze źródeł zwierzęcych lub ludzkich, po interwencjach dietetycznych lub farmakologicznych, lub z różnych grup wiekowych lub populacji klinicznych³⁰. W ten sposób egzogenne lub endogenne związki będące przedmiotem zainteresowania będą obecne w surowicy i pożywkach zabiegowych, w ilościach biodostępnych i będą wchodzić w interakcje z tkanką docelową w porozumieniu ze środowiskiem endogennym (tj. w bardziej fizjologicznym kontekście). Podejście to jest dynamiczne, ponieważ istnieje duże prawdopodobieństwo, że dana interwencja wywrze efekt wielonarządowy (i wieloskładnikowy), a tym samym środowisko fizjologiczne będzie współmodyfikowane. Chociaż podejście to wiąże się z pewnymi wyzwaniami, ponieważ wiele systemowych zmiennych biochemicznych jest zmienianych jednocześnie, jest to podejście, które może pomóc przezwyciężyć wady czysto redukcjonistycznej metodologii eksperymentalnej^31,32. Podsumowując, wdrożenie kondycjonowanej surowicy wraz z tkanką zmodyfikowaną tkankowo (biomimetycznie in vitro) może być wykorzystane jako narzędzie do badań klinicznych w zakresie fizjologii, odżywiania i badań klinicznych.

Zastosowań klinicznych jest wiele
Przedstawiony tutaj model inżynierii tkankowej może być wykorzystany do zbadania anatomicznych i klinicznych pytań badawczych, których tradycyjne modele in vitro nie są w stanie rozwiązać. Więzadło lub ścięgno in vivo zawiera obszar przejściowy tkanki miękkiej do twardej zwany przyczepem ścięgnistym. Przyczep ścięgnisty, który jest podatny na urazy związane ze stresem mechanicznym³³, można badać w przekroju za pomocą technik mikroskopii histochemicznej i elektronowej ^22,26. Ten unikalny interfejs jest podwójnie ważny dla osób o niskiej lub ograniczonej mobilności, ponieważ brak aktywności fizycznej upośledza zdolność tkanki łącznej do przenoszenia obciążenia do obszarów o niskiej lub wysokiej podatności³⁴, co ostatecznie prowadzi do ogólnego spadku podatności tkanek i zwiększonego ryzyka urazów.

Nasze laboratorium wykorzystało ostatnio ten model inżynierii tkankowej²⁵ do modelowania innej populacji, sportsmenek, które są narażone na urazy tkanki łącznej: częstość występowania uszkodzeń ACL jest około pięciokrotnie większa niż u mężczyzn³⁵. Potencjalne mechanizmy leżące u podstaw tej rozbieżności w urazach związanych z płcią zbadano poprzez leczenie konstruktów więzadeł fizjologicznymi stężeniami żeńskiego hormonu płciowego, estrogenu, w stężeniach naśladujących etapy cyklu miesiączkowego. Co ciekawe, wysokie stężenia estrogenu hamowały ekspresję genów i aktywność oksydazy lizylowej, głównego enzymu odpowiedzialnego za tworzenie wiązań krzyżowych lizyna-lizyna w macierzy kolagenowej więzadeł i ścięgien. Co ważne, 48 godzin wysokiego estrogenu (w celu symulacji fazy folikularnej) zmniejszyło sztywność konstrukcji więzadeł bez zmiany gęstości kolagenu w konstruktach. Z fizjologicznego punktu widzenia sugeruje to, że wzrost wiotkości więzadeł u kobiet może być spowodowany, przynajmniej częściowo, zmniejszonym tworzeniem usieciowania. Z perspektywy eksperymentalnej odkrycia te²⁵ podkreślają użyteczność modelu konstrukcji 3D, który pozwolił na zbadanie funkcjonalnej aktywności sieciowania. Z klinicznego punktu widzenia model ten może być teraz wykorzystany do szybkiego badania przesiewowego pod kątem interwencji, które mogą zapobiec negatywnym skutkom estrogenu na funkcję więzadeł.

Uwagi końcowe
W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółową metodykę tworzenia więzadeł inżynieryjnych i ich użyteczność jako model tkankowy 3D in vitro . Model można w dużym stopniu dostosować do szerokiego zakresu celów, zapewniając elastyczność w zakresie typu komórki, interwencji i miar wyników. Uzupełnienie pożywek paszowych kondycjonowaną surowicą dodaje kontekst fizjologiczny, którego nie można osiągnąć w tradycyjnym środowisku in vitro , poprawiając modelowanie fizjologii in vivo . Krótko mówiąc, uważamy, że jest to model o szerokim zastosowaniu, który może mieć ekscytujące implikacje dla rozwoju zarówno dziedzin fizjologii, jak i inżynierii tkankowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Austerlitz Szpilki do owadów, stal nierdzewna minutien, rozmiar 0,20	Entomoravia	N/A	Do kotew cementowych brushite
i beta-fosforanu trójwapniowego	Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, Wielka Brytania)	Nie dotyczy	Do kotew cementowych szczotkitowych
Kwas o-fosforowy, 85% (w/w)	EMD Millipore	PX0995	Do kotew cementowych
brushite Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	251275-500g	Do kotew cementowych
szczotkowych Falcon 35 mm Naczynia do hodowli tkankowych	Fisher Scientific	08-772A	Do płyt pokrytych silikonem
Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184	Ellsworth Adhesives	4019862	Do płyt pokrytych silikonem
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Fisher Scientific	SH3002802	Do izolacji i ekspansji komórek
100x antybiotyk/ roztwór przeciwgrzybiczy	VWR	45000-616	Do izolacji komórek
Kolagenaza typu II	Thermo Fisher Scientific	17101015	Do izolacji komórek
100x roztwór penicyliny/streptomycyny	Thermo Fisher Scientific	15140122	Do izolacji komórek
Steriflip-GP, 0,22  &mikro; m pore, polieterosulfon, napromieniowany	promieniami gamma EMD Millipore	SCGP00525	Do sterylizacji odczynnikami
DMEM wysoka glukoza z pirogronianem sodu i L-glutaminą	VWR	10-013-CV	Do hodowli komórkowych i tkankowych
Płodowa surowica bydlęca	Biosurowica	FBS2000	Składnik pożywki do trawienia tkanek i pożywki wzrostowej
Penicylina G Sól potasowa	MP Biomedicals	0219453680 - 100 MU	Składnik pożywki wzrostowej. Rozpuścić w wodzie do 100 000 U/ml, wysterylizować filtrem, porcjować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Polistyrenowe szalki do hodowli tkankowych CELLSTAR (145 mm x 20 mm)	VWR	82050-598	Do hodowli komórkowych
Błękit trypanowy	Thermo Fisher Scientific	T10282	Do izolacji komórek
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056	Do hodowli komórkowych. Rozcieńczyć do 0,05% w PBS
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	472301	Do pożywek do zamrażania komórek
Nalgene Mr. Frosty Kriogeniczny pojemnik do zamrażania	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Do zamrażania komórek
BD Vacutainer Czerwony plastik 10 ml	Fisher Scientific	367820	Do zbierania surowicy
ludzkiej Cewniki Bound Tree Insyte Autoguard IV, igła	22 G x 1 calFisher Scientific	354221	Do pobierania surowicy ludzkiej
Trombina, pochodzenia bydlęcego	Sigma-Aldrich	T4648-1KU	Do inżynieryjnego tworzenia więzadeł. Rozpuścić w stężeniu 200 j./ml w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Filtruj przy 0,22 μ m, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Fibrynogen pochodzenia bydlęcego	Sigma-Aldrich	F8630-5G	Do inżynieryjnego tworzenia więzadeł. Rozpuścić w stężeniu 20 mg/ml w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Filtruj przy 0,22 μ m, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Aprotynina z płuc bydlęcych	Sigma-Aldrich	A3428	Do inżynieryjnego tworzenia więzadeł. Rozpuścić w stężeniu 10 mg/ml w wodzie. Filtruj przy 0,22 μ m, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Kwas 6-aminoheksanowy	Sigma-Aldrich	07260-100g	Do tworzenia więzadeł inżynieryjnych. Rozpuścić w 0,1 g/ml w wodzie. Filtruj przy 0,22 μ m, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Kwas L-askorbinowy, 2-fosforan sól seskwimagnezowa, hydrat	Sigma-Aldrich	A8960-5G	Składnik pożywek paszowych. Rozpuścić w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy w stężeniu 50 mM. Filtruj przy 0,22 μ m i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607-25G	Składnik pożywek paszowych. Rozpuścić w PBS w stężeniu 50 mM. Filtruj przy 0,22 μ m i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Transformujący czynnik wzrostu-β 1	Peprotech	100-21	Składnik pożywek paszowych. Rozpuścić zgodnie z instrukcjami producenta w stężeniu 10 μ g/ml. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Stericup-GP, 0,22  &mikro; M, polieterosulfon, 250  mL, sterylizowany radioaktywnie	EMD Millipore	SCGPU02RE	Do sterylizacji odczynnikami
Kwas solny	Fisher Scientific	A144-212	Rozcieńczyć w wodzie do 6 M
4-Dimetyloaminobenzaldehyd	Sigma-Aldrich	39070-50g	Do oznaczania hydroksyproliny
Trójwodny chloramina-T	Sigma-Aldrich	402869-100g	Do oznaczania
hydroksyprolinytrans-4-Hydroxy-L-proline	Sigma-Aldrich	H54409-100g	Do oznaczania hydroksyproliny
1-propanol	Sigma-Aldrich	279544-1L	Do oznaczania hydroksyproliny
Kwas nadchlorowy	Sigma-Aldrich	311421-250ml	Do oznaczania hydroksyproliny
Kwas octowy, lodowaty	EMD Millipore	AX0073-9	Do testu hydroksyproliny
Wodorotlenek	soduFisher Scientific	S318-500	Do oznaczania hydroksyproliny
Toluen, bezwodny	Sigma-Aldrich	244511-1L	Do oznaczania hydroksyproliny
Corning Costar Przezroczyste 96-dołkowe płytki z polistyrenu	Fisher Scientific	07-200-656	Do testu hydroksyproliny