Artykuł metodologiczny

Izolowanie i analiza komórek mezenchymy trzustki za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/55344

⸱

28 stycznia 2017

 ,  , 
1Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę izolacji komórek w mikrośrodowisku trzustki z tkanek embrionalnych, noworodkowych i dorosłych myszy, koncentrując się na izolacji komórek mezenchymalnych. Metoda ta umożliwia profilowanie ekspresji genów komórkowych i wydzielania białek w celu wyjaśnienia sygnałów zewnętrznych, które regulują rozwój, funkcję i nowotworzenie trzustki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzustka składa się z komórek nabłonkowych, które są niezbędne do trawienia pokarmu i regulacji poziomu glukozy we krwi. Wykazano, że komórki mikrośrodowiska trzustki, w tym komórki śródbłonka, neuronów i mezenchymów, regulują różnicowanie i proliferację komórek w trzustce embrionalnej. U osoby dorosłej wykazano, że funkcja i masa komórek produkujących insulinę zależy od komórek w ich mikrośrodowisku, w tym komórek perycytów, układu odpornościowego, śródbłonka i neuronów. Wreszcie, wykazano, że zmiany w mikrośrodowisku trzustki regulują nowotworzenie trzustki. Jednak wskazówki leżące u podstaw tych procesów nie są w pełni zdefiniowane. Dlatego scharakteryzowanie różnych typów komórek, które składają się na mikrośrodowisko trzustki i profilowanie ich ekspresji genów, ma kluczowe znaczenie dla określenia rozwoju i funkcji tkanek w stanach normalnych i chorobowych. W tym miejscu opisujemy metodę, która pozwala na izolację komórek mezenchymalnych z trzustki myszy embrionalnych, noworodkowych i dorosłych. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne tkanki trzustki myszy, a następnie sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) lub analizę cytometryczną znakowanych komórek. Komórki mogą być znakowane albo przez barwienie immunologiczne dla markerów powierzchniowych, albo przez ekspresję białek fluorescencyjnych. Izolacja komórek może ułatwić charakterystykę genów i białek ulegających ekspresji w komórkach mezenchymy trzustki. Protokół ten okazał się skuteczny w izolowaniu i hodowli wysoce wzbogaconych populacji komórek mezenchymalnych z zarodkowej, noworodkowej i dorosłej trzustki myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Homeostaza energetyczna i trawienie pokarmu u ssaków zależą od prawidłowego funkcjonowania trzustki. Dorosła trzustka składa się z dwóch głównych przedziałów komórkowych: zewnątrzwydzielniczego i hormonalnego. Komórki zewnątrzwydzielnicze, w tym komórki groniaste, które produkują i wydzielają enzymy trawienne oraz komórki przewodów, które transportują te enzymy do jelit, obejmują ponad 80% całkowitej masy trzustki1. Komórki endokrynne, które obejmują komórki beta produkujące insulinę i komórki alfa wytwarzające glukagon, są zorganizowane w wysepkach Langerhansa, które są osadzone w tkance zewnątrzwydzielniczej i wydzielają hormony regulujące poziom glukozy we krwi2.

Komórki trzustki nabywają swój zróżnicowany los w wysoce regulowanym, wieloetapowym procesie3. Dowody sugerują, że zewnętrzne sygnały dostarczane przez komórki neuronalne, śródbłonkowe i mezenchymalne kierują różnicowaniem i proliferacją komórek trzustki w zarodku3,4,5. Jednym z przykładów jest wymóg aorty do specyfikacji wczesnych prekursorów trzustki6. W późniejszym okresie rozwoju wykazano, że komórki śródbłonka odgrywają kluczową rolę w rozwoju zarówno komórek endokrynnych, jak i zewnątrzwydzielniczych trzustki oraz promują różnicowanie komórek beta4,6,7. Wykazano, że komórki mezenchymalne wspierają przeżycie i ekspansję wspólnych komórek progenitorowych trzustki, głównie poprzez wydzielanie czynnika wzrostu Fgf108,9. Wykazaliśmy ponadto, że komórki te wspierają proliferację prekursorów endokrynnych i zewnątrzwydzielniczych, a także komórek zróżnicowanych (w tym komórek groniastych i beta) w trzustce embrionalnej5. Ostatnio wykazano, że komórki mezenchymalne regulują różnicowanie komórek endokrynnych10.

U osoby dorosłej wykazano, że funkcja i masa komórek beta zależą od komórek w ich mikrośrodowisku, w tym komórek neuronalnych, immunologicznych i śródbłonka, a także perycytów11,12,13. Wykazano, że podczas uszkodzenia komórki śródbłonka rekrutują komórki odpornościowe do trzustki, aby promować replikację komórek beta13. Wykazano ponadto, że komórki śródbłonka wytwarzają składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w celu wspierania ekspresji insuliny i funkcji komórek beta14. Niedawno wykazaliśmy zapotrzebowanie na perycyty wysp trzustkowych dla funkcji komórek beta11. Na koniec wykazano, że komórki zrębu trzustki regulują postęp gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC)15,16. Jednak tożsamość zewnętrznych sygnałów, które kierują rozwojem, funkcją i nowotworzeniem trzustki, jest w dużej mierze nieznana.

Identyfikacja sygnałów dostarczanych przez komórki mikrośrodowiska trzustki wymaga scharakteryzowania genów i białek wyrażanych przez te komórki. Zależy to od wyizolowania tych komórek od trzustki w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów i proteomiki i/lub od ustanowienia linii komórkowych. W tym miejscu proponujemy metodę izolacji komórek mezenchymalnych mikrośrodowiska trzustki poprzez wykorzystanie trawienia enzymatycznego tkanek i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) komórek znakowanych immunofluorescencyjnie lub komórek eksprymujących białka fluorescencyjne. Protokół ten został z powodzeniem przeprowadzony w celu wyizolowania i analizy komórek mezenchymalnych eksprymujących żółte białko fluorescencyjne (YFP) w embrionalnej, noworodkowej i dorosłej trzustce5,17.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Tel Awiwie.

1. Izolacja tkanki trzustki od myszy

  1. Dla dorosłych myszy:
    1. Przygotuj bufor do wytrawiania: 0,4 mg/ml kolagenazy P i 0,1 ng/ml DNazy I rozpuszczonych w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS). Świeżo przygotuj 5 ml buforu na mysz w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i trzymaj je na lodzie do czasu użycia.
    2. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    3. Przeprowadź sekcję każdej myszy w celu usunięcia trzustki (instrukcja znajduje się w Odnośniku 18); umieść ją w naczyniu hodowlanym zawierającym HBSS. Możliwe jest wykonanie tego etapu pod mikroskopem stereoskopowym, a w celu zwiększenia efektywności trawienia pokroić tkankę na 2 - 4 części.
    4. Umieść tkankę trzustki w probówce zawierającej bufor trawienny (przygotowany w kroku 1.1.1). Trzymaj probówki na lodzie, dopóki wszystkie myszy nie zostaną wycięte, a tkanki trzustki zebrane.
    5. Powtórz kroki 1.1.2 - 1.1.4 z pozostałymi myszami.
  2. Dla zarodków i noworodków myszy:
    1. Przygotować bufor do wytrawiania: 0,4 mg/ml kolagenazy P i 0,1 ng/ml DNazy I rozpuszczonych w HBSS. W przypadku zarodków i młodych w 7. dniu po urodzeniu (p7) lub młodszych, należy przygotować świeżo 1,5 - 2 ml buforu na mysz w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. W przypadku szczeniąt p7 lub starszych przygotuj 3-4 ml buforu na mysz w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
    2. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W przypadku zarodków należy usunąć wszystkie zarodki z macicy matki i umieścić je w 10-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym PBS. Analizuj jeden zarodek na raz.
    3. Połóż mysz na plecach, z głową skierowaną w stronę przeciwną do badacza. Za pomocą cienkich kleszczy podciągnij skórę brzucha i otwórz ją na linii środkowej, aby odsłonić jamę brzuszną na przeponę myszy18.
    4. Za pomocą cienkich kleszczy odłącz wątrobę od tylnej ściany brzucha. Ciągłym ruchem w kierunku ogona myszy zgarnij narządy wewnętrzne (w tym wątrobę, żołądek, śledzionę, jelita, nerki i trzustkę) i umieść je w naczyniu hodowlanym zawierającym HBSS.
    5. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń wątrobę i nerki, aby odsłonić trzustkę (ryc. 1). Za pomocą cienkich kleszczy oderwij trzustkę od żołądka, dwunastnicy, a na końcu od śledziony.
    6. Umieść tkankę trzustki w probówce zawierającej bufor trawienny (przygotowany w kroku 1.2.1). W przypadku szczeniąt p14 lub starszych pokrój tkankę na 2 części, aby zwiększyć wydajność trawienia. Trzymaj probówki na lodzie, dopóki wszystkie myszy nie zostaną wycięte, a tkanki trzustki zebrane.
    7. Powtórz kroki 1.2.2 - 1.2.6 z pozostałymi myszami.

2. Trawienie trzustki

  1. Inkubować probówki zawierające tkankę trzustki (w buforze do wytrawiania) w bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 30 minut z mieszaniem przy 700 obr./min. Po 15 minutach ręcznie potrząśnij rurkami, odwracając je 3 - 4 razy i umieść je z powrotem w bloku grzewczym.
    UWAGA: W przypadku korzystania z bloku grzewczego bez możliwości mieszania, należy odwracać rurki co 5 - 10 minut. Upewnij się, że tkanka jest prawidłowo trawiona. Jeśli nie, pokrój tkankę na mniejsze kawałki przed inkubacją lub zwiększ mieszanie.
  2. Aby zatrzymać trawienie tkankowe, umieść probówki na lodzie i dodaj 10 ml zimnego HBSS do każdej probówki. Odwirować probówki w temperaturze 4 °C i 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
  3. Ponowne zawieszenie:
    1. W przypadku dorosłych myszy i szczeniąt p14 lub starszych, ponownie zawiesić osad z 6 ml PBS i przecedzić go przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm umieszczone na nowej stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Aby zapewnić maksymalny odzysk komórek, umyj oryginalną probówkę dodatkowymi 6 ml PBS i przecedź ją przez sitko do komórek do probówki zbiorczej.
    2. W przypadku zarodków i młodych młodszych niż p14 ponownie zawiesić osad z 2 ml PBS i przecedzić go przez sitko do komórek o średnicy 35 μm umieszczone na 5-mililitrowej probówce do pobierania polistyrenu z okrągłym dnem (probówka FACS). Aby zapewnić maksymalny odzysk komórek, umyj oryginalną probówkę dodatkowymi 2 ml PBS i przecedź ją przez sitko do komórek do probówki zbiorczej.
  4. Odwirować probówki w temperaturze 4 °C i 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Ostrożnie usuń płyn, ponieważ komórki są luźno przymocowane do rurki polistyrenowej.

3. Przygotowanie oznaczonych pojedynczych komórek

  1. Preparaty buforowe: Do izolacji komórek za pomocą FACS należy przygotować bufor sortujący, mieszając PBS (bez chlorku wapnia i chlorku magnezu), 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 mM EDTA. Do analizy metodą cytometrii przepływowej należy przygotować bufor analityczny, uzupełniając bufor sortujący o 0,05% azydku sodu. Oba mogą być przechowywane w temperaturze 4–8 °C przez okres do 2 miesięcy.
  2. Ponownie zawieś komórki w buforze sortowania lub analizy. Ponownie zawiesić każdą trzustkę wyizolowaną z zarodków i młodych młodszych niż p7 w 1 ml, od szczeniąt w wieku od p8 do jednego miesiąca w 1,5 ml oraz od myszy starszych niż jeden miesiąc w 3 ml. Przecedź komórki przez sitko o średnicy 35 μm umieszczone na okrągłodennej rurce z polistyrenu (rurka FACS).
  3. Do kontroli barwienia należy pobrać od 50 do 100 μl podwielokrotności z próbek wykonanych w poprzednim etapie (nie więcej niż 5% całkowitej objętości próbki) i umieścić je w nowych probówkach FACS; dołączyć probówkę dla każdego użytego fluoroforu, w tym DAPI i białek fluorescencyjnych, jak również dla niebarwionej kontroli.
    UWAGA: W przypadku używania myszy transgenicznych z komórkami wykazującymi ekspresję białka fluorescencyjnego lub gdy liczba komórek jest ograniczona, należy dołączyć tkankę nietransgeniczną jako kontrolę barwienia. Jeśli komórki wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego są używane bez dalszego barwienia, przejdź do kroku 3.8.
  4. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
  5. W celu zablokowania ponownie zawiesić komórki roztworem blokującym (100 μl buforu do sortowania lub analizy uzupełnionego 1 μl koziej IgG) i inkubować przez 30 minut na lodzie.
  6. Aby wybarwić markery powierzchniowe komórek, należy przygotować mieszaninę zawierającą wszystkie pożądane przeciwciała sprzężone z fluoroforem w objętości 100 μl na próbkę. Przygotować 2x rozcieńczenia przeciwciał w buforze do sortowania lub analizy (tj. rozcieńczyć przeciwciało, aby uzyskać podwójne wymagane stężenie; jeśli pożądane jest końcowe rozcieńczenie 1:200, rozcieńczyć przeciwciało 1:100). Nie przemując roztworu blokującego, dodać 100 μl mieszaniny do komórek próbki, aby uzyskać końcową objętość barwienia 200 μl. Inkubować przez 30-60 minut na lodzie i w ciemności.
  7. Aby ustawić parametry analizy lub sortowania (patrz kroki 4.3 i 5.2), należy przygotować dodatkowe probówki, które zawierają tylko jedno z użytych przeciwciał (kontrola barwienia). Przygotować 2x rozcieńczenia przeciwciał w buforze do sortowania lub analizy (jak opisano w kroku 3.6). Upewnij się, że dołączyłeś pojedyncze rozcieńczenie kontroli barwienia dla każdego użytego fluoroforu, a także niebarwioną kontrolę. Nie przemując roztworu blokującego, dodać do komórek 100 μl mieszanin przeciwciał (przygotowanych w kroku 3.3), aby uzyskać ostateczną objętość barwienia wynoszącą 200 μl. Inkubować przez 30 - 60 minut na lodzie i w ciemności.
  8. Przemyć, napełniając każdą probówkę buforem do analizy lub sortowania do maksymalnej objętości 4 ml. Opcjonalnie należy ponownie przecedzić komórki przez sitko o średnicy 35 μm (zgodnie z opisem w kroku 3.2).
  9. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant.
  10. Ponownie zawiesić próbki w buforze do analizy lub sortowania. Ponownie zawiesić komórki wyizolowane z zarodków w 500 μl, od młodych młodszych niż jeden miesiąc w 1 ml, od 1 do 3 miesięcy w 2 ml, a od myszy starszych niż 3 miesiące w 3 ml. Kontrole barwienia mogą być ponownie zawieszone w 300 μl buforu.
  11. Dodaj 200 ng/ml DAPI do ponownie zawieszonych komórek, aby zidentyfikować martwe komórki. Upewnij się, że dołączyłeś probówkę zawierającą niebarwione komórki bez DAPI do ustawień cytometru. Przejdź do sortowania komórek (krok 4) lub analizy (krok 5).

4. Sortowanie komórek

  1. Preparaty:
    1. W przypadku sortowania komórek przed ekstrakcją RNA, bezpośrednio przed sortowaniem należy pokryć probówkę zbiorczą o pojemności 1,5 ml inhibitorem RNazy. W tym celu dodać 1 ml buforu sortującego, zawierającego 0,01 U/ml inhibitora RNazy, do sterylnej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Po 5 minutach zmieszaj rurkę i usuń płyn.
    2. W celu sortowania komórek przed hodowlą komórkową dodaj 3 ml sterylnej pożywki hodowlanej (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnione 20% FBS, 1% L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny) do sterylnej probówki zbiorczej o pojemności 15 ml.
  2. Przed załadowaniem probówki do sortownika FACS należy ją krótko przetrząsnąć, aby ponownie zawiesić komórki. Pozostałe probówki trzymaj na lodzie.
  3. Zacznij od przeanalizowania kontroli barwienia w celu określenia parametrów sortowania (np. napięcia i kompensacji) oraz bramek sortowania (np. całkowitej populacji komórek, żywych komórek ujemnych DAPI i populacji komórek do sortowania).
  4. Po ustawieniu parametrów sortowania i bramek załaduj próbki i rozpocznij sortowanie komórek do probówek zbiorczych.
    UWAGA: Warunki sortowania w dużym stopniu zależą od urządzenia. Używamy dyszy o szerokości 100 μm, ciśnieniu 23,1 psi i maksymalnej prędkości sortowania 5.
  5. Przejdź do ekstrakcji RNA lub hodowli posortowanych komórek.
    UWAGA: W przypadku ekstrakcji RNA należy odwirować komórki przy 2,000 x g przez 5 minut i usunąć nadmiar płynu przed kontynuowaniem standardowego protokołu ekstrakcji. W przypadku komórek do hodowli, jeśli komórki zostały posortowane w warunkach niesterylnych, należy je umyć dwukrotnie, wypełniając probówkę pożywką hodowlaną i odwirowując ją przy 300 x g przez 7 minut przed hodowlą, aby zminimalizować ich zanieczyszczenie.

5. Analiza komórek za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Przed załadowaniem każdej probówki do cytometru należy ją na chwilę zawirować, aby ponownie zawiesić komórki. Pozostałe probówki trzymaj na lodzie.
  2. Rozpocznij od analizy próbek niebarwionych i barwionych pojedynczo w celu określenia parametrów analizy (np. napięcia i kompensacji).
  3. Po ustawieniu parametrów analizy załaduj każdą próbkę, w tym kontrolę barwienia, i zapisz wyniki. Analizuj uzyskane wyniki za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchyma trzustki jest wymagana podczas rozwoju i dorosłości. Opisana tutaj metoda pozwala na izolację komórek mezenchymalnych z trzustki embrionalnej, noworodkowej i dorosłej. Komórki mezenchymalne, ale bez innych typów komórek, wyrażają żółte białko fluorescencyjne (YFP) w trzustce Nkx3.2-Cre; Myszy R26R-YFP5,11,17,19. Podczas rozwoju Nkx3.2 (znany również jako BapX1) ulega ekspresji przez embrionalną mezenchymę trzustki, żołądka i jelit, a także w podzbiorze somitów szkieletowych19,20,21. Gen ten ulegał ekspresji w mezenchymie trzustki od e9.5 do e11.5, umożliwiając ekspresję genu pod kontrolą Nkx3.2-Cre z e9.55,19,20. Na podstawie tego znakowania komórki można oczyścić z objętości tkanki trzustki za pomocą cytometrii przepływowej. Rycina 2 przedstawia analizę cytometrii przepływowej pojedynczych komórek z tkanek embrionalnych, noworodkowych i dorosłych trzustki, wyizolowanych w sposób opisany tutaj. nietransgeniczne tkanki trzustki nie zawierały komórek fluorescencyjnych, Nkx3.2-Cre; Tkanka trzustki R26R-YFP ze wszystkich analizowanych grup wiekowych zawiera odrębną populację komórek znakowanych YFP (ryc. 2; oznaczona bramkami).

Zgodnie z opisaną tutaj metodą, komórki wyrażające białka fluorescencyjne mogą być oczyszczane lub analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, z dodatkowym barwieniem immunologicznym lub bez niego. Na przykład, po sortowaniu na podstawie znakowania fluorescencyjnego, komórki mezenchymalne można hodować w celu ustanowienia linii komórkowej (dla co najmniej pięciu pasaży), jak pokazano na rysunku 3A. Zwróć uwagę na morfologię fibrocytarną hodowanych komórek, typową dla komórek mezenchymalnych. Ponadto system ten został wykorzystany do analizy ekspresji genów przez posortowane komórki. W tym celu RNA wyekstrahowano z posortowanych komórek mezenchymalnych w celu syntezy cDNA, a poziomy ekspresji genów analizowano za pomocą qPCR. Taka analiza wykazała, że posortowane komórki wyrażają marker pan-mezenchymalny wimentynę (Figura 3B). Wreszcie, ekspresję markerów powierzchniowych przez komórki trzustki można analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Na przykład wyizolowaliśmy komórki z tkanki trzustki Nkx3.2-Cre; Dorosłe myszy R26R-YFP przy użyciu metody opisanej tutaj i wybarwiły je glikoproteiną CD9 na powierzchni komórki, która według doniesień ulega ekspresji przez fibroblasty22. Jak pokazano na rysunku 3C, wszystkie znakowane fluorescencyjnie komórki w Nkx3.2-Cre; Ekspres trzustkowy R26R-YFP CD9.

figure-results-1
Rycina 1: Tkanka trzustki embrionalnej i noworodka. Izolowany cały przewód pokarmowy, w tym żołądek, śledziona, jelito i trzustka, zarodka e15.5 (A) i szczeniaka p4 (B). Tkanka trzustki jest wyznaczona niebieską linią. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Ryc. 2: Komórki mezenchymalne są znakowane fluorescencyjnie w Nkx3.2-Cre; R26R-YFP tkanka trzustki. Analiza cytometrii przepływowej komórek trzustki wyizolowanych z nietransgenicznych (lewe panele) i Nkx3.2-Cre; Transgeniczne myszy R26R-YFP (prawe panele) w różnym wieku: embrionalnym (A), noworodkowym (B) i dorosłym (C). Komórki analizowano pod kątem rozproszenia bocznego (oś y) i fluorescencji żółtej (oś x). Gates (oznaczony literą "D") wskazał na obecność populacji komórek YFP+ u myszy transgenicznych, ale nie u nietransgenicznych myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Analizy izolowanych komórek trzustki. (A) Komórki posortowane z tkanki trzustki Nkx3.2-Cre; Nowonarodzone myszy R26R-YFP (jak opisano na rysunku 2B) hodowano w celu ustanowienia linii komórkowej. Hodowane komórki obrazowano pod kątem fluorescencji (zielony; prawy i lewy panel) oraz kontrastu fazowego (szary; prawy panel). (B) Wykres słupkowy przedstawiający poziomy ekspresji wimentyny1 (Vim1) przez komórki posortowane YFP+ z tkanki trzustkowej Nkx3,2-Cre; R26R-YFP dorosłe myszy (jak opisano na rysunku 1C; zielony) w porównaniu z niesortowaną tkanką trzustki (). RNA wyekstrahowano, a ekspresję genów przeanalizowano za pomocą qPCR; ekspresja została znormalizowana do cyklofiliny. N = 4. P < 0,001. Dane przedstawiają średnią ± SD. (C) Analiza metodą cytometrii przepływowej rozproszonych komórek trzustki z Nkx3.2-Cre; Dorosłe myszy R26R-YFP wybarwione immunologicznie przeciwciałem anty-CD9 sprzężonym z allofikocyjaniną (APC) i analizowane pod kątem APC (oś y) i żółtej fluorescencji (oś x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy metodę izolowania i analizowania komórek mikrośrodowiska trzustki. Metoda ta może być stosowana do izolowania komórek mezenchymalnych z embrionalnej i dorosłej tkanki trzustki. Ponadto z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do wyizolowania komórek śródbłonka z trzustki dorosłego i noworodka 5,17. Jednak może nie być odpowiedni do uzyskania odtwarzalnej zawiesiny jednokomórkowej komórek nabłonka trzustki (alternatywne protokoły są opisane w odniesieniach 18, 23 i 24). Stosując tę metodę, komórki znakowane fluorescencyjnie, wyrażające białka fluorescencyjne lub barwione immunologicznie na markery powierzchniowe, mogą być oczyszczane za pomocą FACS lub analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. RNA można wyekstrahować z oczyszczonych komórek w celu sprofilowania ich wzorca ekspresji genów. Alternatywnie, oczyszczone komórki można hodować w celu ustanowienia linii komórkowej do późniejszej analizy proteomicznej. Metoda ta umożliwi scharakteryzowanie czynników wyrażanych przez mikrośrodowisko trzustki, które rządzą jej organogenezą, fizjologią i patofizjologią.

Mezenchyma trzustki wspomaga organogenezę tkanek poprzez promowanie proliferacji prekursorów i komórek zróżnicowanych 5,9. Wykazano, że komórki te wspierają ekspansję komórek progenitorowych trzustki pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) 17,25,26. W związku z tym określenie tożsamości embrionalnych czynników mezenchymalnych ułatwiłoby obecne wysiłki na rzecz generowania komórek beta produkujących insulinę z hESC i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) jako potencjalnego leku na cukrzycę. Badania genetyczne myszy pozwoliły na zidentyfikowanie czynników wzrostu, takich jak Fgf10, które są wytwarzane przez mezenchymę w celu promowania ekspansji nabłonka trzustki we wczesnych stadiach rozwoju trzustki 3,9. W celu zidentyfikowania dodatkowych czynników ulegających ekspresji w mezenchymie embrionalnej, wyizolowaliśmy te komórki za pomocą laserowej mikrodysekcji, wyekstrahowaliśmy ich RNA i przeprowadziliśmy analizę ekspresji genów26. Jednak oprócz tego, że jest pracochłonna, metoda ta opiera się na identyfikacji komórek na podstawie ich cech morfologicznych, co ogranicza jej zastosowanie do etapów rozwojowych poprzedzających rozgałęzienie się nabłonka na otaczającą mezenchymę (tj. e12.5). Aby scharakteryzować komórki mezenchymalne w późniejszych stadiach rozwojowych, zastosowaliśmy metodę opisaną tutaj 5,17.

Zastosowaliśmy tę metodę do analizy ekspresji markerów powierzchniowych przez mezenchymę trzustkinoworodka 5. Ponadto wyizolowano komórki mezenchymalne z embrionalnej i noworodkowej tkanki trzustki Nkx3.2-Cre; Myszy R26-EYFP, w oparciu o ich znakowanie fluorescencyjne w tej linii myszy, hodowano w celu ustanowienia linii komórkowych17. Analiza proteomiczna tych komórek pozwoliła na identyfikację czynników wydzielanych przez mezenchymę trzustki ze zdolnością do promowania komórek progenitorowych trzustki pochodzących z hESC17. Następnie zastosowaliśmy tę metodę izolacji komórek do oczyszczenia komórek mezenchymalnych z dorosłych tkanek trzustki w celu ekstrakcji RNA i analizy ekspresji genów17. Dlatego metoda ta może być stosowana do identyfikacji genów i białek ulegających ekspresji przez mezenchymę trzustki, ze zdolnością do wspomagania rozwoju komórek trzustki.

Wykazano ponadto, że mezenchymalne komórki trzustki odgrywają rolę w nowotworzeniu trzustki. PDAC charakteryzuje się tworzeniem bogatego w fibroblasty zrębu desmoplastycznego składającego się z fibroblastów, komórek odpornościowych i ECM27. Chociaż uważano, że zrąb sprzyja rozwojowi wielu rodzajów raka, wykazano, że hamuje on postęp PDAC 15,16,28. Sugeruje to, że składniki zrębu trzustki wydzielają czynniki hamujące nowotworzenie Ponadto zmiany w składzie komórkowym zrębu, a także w fenotypie komórki mogą leżeć u podstaw ich wpływu na komórki nabłonkowe 15,16,28. Opisana tutaj metoda może zatem pomóc w scharakteryzowaniu różnych typów komórek tworzących zrąb PDAC w porównaniu ze zdrową tkanką trzustki. Pozwoliłoby to na dalsze oczyszczanie różnych typów komórek zrębu w celu scharakteryzowania potencjalnych zmian w ich profilach ekspresji genów podczas progresji PDAC. Jednak ze względu na zmiany w składzie ECM trzustki podczas nowotworzenia27 może być konieczne dostosowanie parametrów trawienia tkankowego, takie jak włączenie dodatkowych typów kolagenazy lub wydłużenie czasu inkubacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Adi Sassonowi za pomoc techniczną i Helen Guez za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (European Research Council) w ramach grantu startowego nr 336204.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagenaza PRoche11213865001
DNazaSigma-AldrichD5025-15KUEfektywne jednostki powinny wynosić co najmniej 2,000 jednostekz/ml białka
Hanksa Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Sigma-AldrichH6648
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Przemysł biologiczny04-127-1A
EDTAPrzemysł biologiczny01-862-1A
Azydek soduSigma-AldrichS2002
Kozia surowica IgGSigma-AldrichG9023
DAPISigma-AldrichInhibitor RNAzy D9542
InvitrogenN8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen11965092
L-glutaminaBiological Industries03-020-1B
Penicylina-streptomycynaPrzemysł biologiczny03-031-1B
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu
Probówki 1,5 mlSarstedt72 690
15 ml Rurka stożkowaCorning430052
Polistyren okrągłodenny 5 mlCorning352008Rurka FACS. Upewnij się, że probówka jest kompatybilna z cytomterem przepływowym, który ma być używany, ponieważ istnieją niewielkie różnice w wymaganych probówkach między markami
Probówka 5 ml z 35 μ m sitko komórkowe Snap CapCorning352235rurka FACS
70 μ Filtr siatkowy M Miltenyi Biotec130-098-462
Blok grzewczy z mieszadłem Wirówka EppendorfThermoMixer C
ThermoFisherHeraeus Megafuge 40R
SteromikroskopNikonSMZ 745
Sortownik komórekBD BiosciencesFACSAria IIu
cytometr przepływowyBeckman CoulterGallios 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
  2. Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -O., Caicedo, A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  3. Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).
  4. Villasenor, A., Cleaver, O. Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog. Seminars in cell & developmental biology. , 1-8 (2012).
  5. Landsman, L., Nijagal, A., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), e1001143(2011).
  6. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  7. Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).
  8. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Developmental biology. 4, 242-255 (1962).
  9. Bhushan, A., Itoh, N., et al. Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis. Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).
  10. Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation. Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).
  11. Sasson, A., Rachi, E., et al. Islet pericytes are required for beta-cell maturity. Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).
  12. Stanley, S. A., Kelly, L., et al. Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism. Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).
  13. Brissova, M., Aamodt, K., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes β cell regeneration. Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).
  14. Nikolova, G., Jabs, N., et al. The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation. Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).
  15. Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  16. Özdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  17. Russ, H. A., Landsman, L., et al. Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation. Stem cells international. 2016, 6183562(2016).
  18. Gout, J., Pommier, R. M., et al. Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), e50514(2013).
  19. Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development. Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).
  20. Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton. Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).
  21. Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2. Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).
  22. Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).
  23. Morris, J. P., Greer, R., et al. Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation. PloS one. 9 (5), 95486(2014).
  24. Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -A., et al. Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated β-cells. Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).
  25. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  26. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  27. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  28. Raz, Y., Erez, N. An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer. Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

izolacja kom rektrawienie tkankibia ka fluorescencyjnemarkery powierzchnioweekstrakcja RNAsortowanie kom rekkom rki mezenchymalnetkanka trzustki

Powiązane artykuły