Zapewniamy niezawodną metodę podwiązania lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) w modelu mysim. Metoda ta jest stosunkowo mniej inwazyjna niż inne metody, obejmujące intubację dotchawiczą, lewostronną torakotomię i toracentezę. Metoda ta może być stosowana jako model zarówno dla ostrego, jak i przewlekłego zawału mięśnia sercowego (MI).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podwiązanie tętnicy wieńcowej lewej lewej przedniej zstępującej (LAD): ulepszony i uproszczony model zawału mięśnia sercowego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba niedokrwienna serca (IHD), lub ostry zespół wieńcowy (ACS), jest jedną z głównych przyczyn zgonów w Stanach Zjednoczonych. ChNS charakteryzuje się zmniejszonym dopływem krwi do serca, co skutkuje utratą tlenu i wynikającą z tego martwicą mięśnia sercowego. Model MI zyskał popularność dzięki zastosowaniu go jako krótkoterminowego modelu niedokrwienno-reperfuzyjnego oraz długoterminowego modelu trwałego podwiązania. Poniżej opisujemy niezawodną metodę trwałego podwiązania LAD. Ponieważ technologia inżynierii genetycznej myszy staje się coraz bardziej zaawansowana, a także przy rosnącej dostępności wysokiej jakości mysich narzędzi chirurgicznych, mysz stała się popularnym modelem do operacji zawału serca. Nasz model chirurgiczny obejmuje użycie łatwo odwracalnego środka znieczulającego w celu szybkiego powrotu do zdrowia myszy; małoinwazyjna intubacja dotchawicza bez tracheotomii; oraz toracenteza przez pierwotne miejsce torakotomii bez tworzenia dodatkowego nacięcia w klatce piersiowej, jak to się robi w niektórych innych metodach, aby skutecznie usunąć nadmiar krwi i powietrza z jamy klatki piersiowej. Metoda ta jest stosunkowo mniej inwazyjna niż inne metody, co znacznie zmniejsza powikłania chirurgiczne i pooperacyjne oraz śmiertelność oraz poprawia odtwarzalność.
Wprowadzenie
Choroba wieńcowa, czyli ACS, jest najczęstszym zdarzeniem sercowo-naczyniowym i będzie uważana za główną przyczynę zachorowalności i śmiertelności na całym świecie w 2020 roku1. Przyczyną OZW jest obecność zakrzepicy mięśnia sercowego spowodowanej pęknięciem blaszki miażdżycowej tętnic wieńcowych, która blokuje lub zmniejsza przepływ krwi do tkanki serca2. W związku z tym istnieją objawy kliniczne zgodne z obecnością ostrego niedokrwienia mięśnia sercowego, takie jak zawał mięśnia sercowego (MI)3,4. MI prowadzi do utraty masy kardiomiocytów i progresji do patologicznej przebudowy komór, co może prowadzić do dysfunkcji komór i niewydolności serca5,6.
Jednym z najskuteczniejszych sposobów badania IHD było naśladowanie ludzkiego zawału mięśnia sercowego na modelu zwierzęcym. Osiąga się to poprzez zamknięcie LAD u myszy. Korzystając z tego modelu, badamy, w jaki sposób można chronić serce przed uszkodzeniami wynikającymi z IHD.
W ciągu ostatniej dekady badacze przeszli od używania większych modeli zwierzęcych do mniejszych zwierząt, w tym od szczurów do myszy. Mniejszy model myszy zaczyna być preferowany z wielu powodów, w tym ich małych rozmiarów, dużego rozmiaru miotu, niskich kosztów utrzymania i krótkiego okresu ciąży, a także ze względu na ekspansywną dostępność modeli transgenicznych i nokautujących geny7. Chociaż myszy są niewielkich rozmiarów, nowe narzędzia chirurgiczne zaprojektowane specjalnie dla nich pomogły w tym rozwoju. Nasza metoda wykorzystuje te nowe narzędzia chirurgiczne.
Podczas gdy kilka metod implementuje inwazyjną tracheotomię, my stosujemy mniej inwazyjną metodę intubacji dotchawiczej. Korzystając z górnego oświetlenia jamy ustnej gardła, intubujemy bez tworzenia żadnych nacięć, zapewniając zwierzęciu bezpieczniejsze i mniej traumatyczne doświadczenie. Mysz jest następnie umieszczana na respiratorze i utrzymywana na izofluranie podczas całego zabiegu. Ze względu na krótki czas trwania znieczulenia wytwarzanego przez lek, zwierzę potrzebuje tylko kilku minut, aby dojść do siebie po odstawieniu znieczulenia. Nasz model chirurgiczny obejmuje również małoinwazyjną toracentezę. Ostrożne usunięcie krwi i nadmiaru powietrza z jamy klatki piersiowej za pomocą toracentezy przez pierwotne nacięcie torakotomii rozwiązało powszechne powikłanie pooperacyjne podwiązania LAD: odmę opłucnową napięciową. Ta metoda, która eliminuje potrzebę dwóch dodatkowych nacięć stosowanych w innych metodach - jednego do tracheotomii, a drugiego do toracentezy - przyniosła mniej powikłań pooperacyjnych i drastycznie zmniejszyła śmiertelność.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół dla zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Szpitalu Rhode Island.
1. Znieczulenie i intubacja
- Zważ mysz, aby obliczyć dawkę pooperacyjnych leków przeciwbólowych.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej i dostarczaj 4% izofluranu przez 9 - 10 minut, monitorując zwierzę przez cały czas. Włącz sterylizator z gorącymi kulkami, aby urządzenie mogło się nagrzać do około 250 °C. Podgrzewanie zajmie 15 - 20 minut.
- Gdy mysz osiągnie głęboką płaszczyznę znieczulenia, z częstością oddechów około 32 oddechów/min, połóż mysz na wznak na płycie styropianowej i użyj elastycznej opaski przymocowanej pod górnymi siekaczami, aby utrzymać otwarte usta. Potwierdź sedację, wykonując szczypanie palca u nogi. Umieść oświetlacz o dużej intensywności nad myszą, aby można było uwidocznić część ustną gardła.
- Użyj zakrzywionych kleszczy, aby otworzyć szczękę i drugiej pary kleszczy, aby usunąć język z drogi. Pamiętaj, aby zaintubować, gdy znajduje się na poziomie oczu lub nieco poniżej ciała myszy. Zaleca się stosowanie lup chirurgicznych.
- Wizualizuj otwieranie i zamykanie strun głosowych. Po otwarciu wprowadzić cewnik dożylny (IV) o rozmiarze 20 rozmiarów 1 cala z wprowadzaczem igły z końcówką. Użyj igły, aby poprowadzić cewnik do otworu tchawicy, ale unikaj wkładania igły do tchawicy. Weryfikację prawidłowego umieszczenia można przeprowadzić za pomocą plastikowej pipety transferowej.
- Przenieś zaintubowaną mysz na powierzchnię roboczą wyposażoną w urządzenie grzewcze. Podłącz mysz do małego wentylatora dla gryzoni ustawionego na objętość wyrzutową 150 μl/skok i częstotliwość uderzeń 130 uderzeń/min.
- Dostarcza 2,5% izofluranu. Sprawdź intubację, sprawdzając, czy nie ma obustronnego uniesienia klatki piersiowej. Sprawdź znieczulenie, wykonując szczypanie palca u nogi. Mysz może potrzebować 5-10 minut na respiratorze, aby zostać w pełni znieczuloną.
2. Przygotowanie myszy
- Przyklej taśmą rurkę intubacyjną w miejscu połączenia między respiratorem a cewnikiem dożylnym. Zaklej taśmą kończyny. Umieść sterylne krople nawilżające na oczach.
- Przytnij brzuszną lewą stronę klatki piersiowej za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Odkurz ogoloną sierść suchymi chusteczkami i nałóż niewielką warstwę kremu do depilacji za pomocą sterylnego wacika. Krem powinien pozostawać w kontakcie z mieszkami włosowymi przez około 30 - 45 s.
- Podczas przetwarzania kremu umieść trzy sterylne bawełniane waciki w trzech 1,5 ml probówkach wypełnionych Betadine do namoczenia. Za pomocą chusteczek zwilżonych wodą destylowaną delikatnie zetrzyj krem i sierść.
- Oczyść pole operacyjne trzy razy, naprzemiennie Betadine i sterylne płatki przygotowawcze z 70% izopropanolem, czyszcząc okrężnymi ruchami, przesuwając się od środka do obrzeży. Umieść sterylną serwetkę z otworem wielkości ćwiartki nad polem operacyjnym myszy.
- Oczyść obszar wokół myszy 70% etanolem. Sprawdź znieczulenie jeszcze raz za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
3. Podwiązanie LAD
- Umieść autoklawizowane narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze z gorącymi kulkami nagrzanym do 250 °C na około 20 sekund. Umieść wysterylizowane narzędzia na sterylnej, autoklawizowanej serwety chirurgicznej. Załóż rękawiczki chirurgiczne.
- Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby delikatnie unieść skórę w punkcie około 5 mm na lewo od wystającej chrząstki mieczykowatej. Użyj skalpela chirurgicznego z ostrzem nr 10, aby wykonać pionowe nacięcie w skórze od tego miejsca w górę, do poziomu brzucha.
- Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oddzielić warstwę skóry i mięśni. Otwórz warstwę mięśniową, podążając za nacięciem skóry. Przełóż dwa szwy polipropylenowe 5-0 przez warstwę mięśniową, po jednym z każdej strony nacięcia, i tymczasowo zabezpiecz szwy zaciskami, aby utrzymać otwartą warstwę mięśniową.
- Zidentyfikuj i wykonaj nacięcie w trzeciej przestrzeni międzyżebrowej, zgodnie z naturalnym kątem klatki piersiowej. Usuń taśmę z lewych końców myszy i przymocuj jej lewą tylną stopę do prawej tylnej stopy za pomocą taśmy. Wytnij dłuższy kawałek taśmy i przymocuj lewą przednią stopę do powierzchni roboczej w lekko uniesionej pozycji. Wyczyść rękawice 70% etanolem.
- Użyj retraktora, aby delikatnie rozsunąć 3. i 4. żeberka. Wytnij mały fragment sterylnej gazy, około 1 cala x 1/2 cala, i zanurz go w sterylnym 0,9% soli fizjologicznej. Wyciśnij nadmiar soli fizjologicznej i za pomocą kleszczy delikatnie przyłóż gazę do lewego płuca, aby zapobiec przypadkowemu uszkodzeniu płuc podczas zabiegu.
- Delikatnie usuń cienkie osierdzie za pomocą kleszczy.
- Oderwij niewielką ilość bawełny od sterylnego wacika i zwiń go w małą kulkę. Zanurz ten wacik w sterylnym 0,9% soli fizjologicznej i delikatnie przetrzyj powierzchnię serca, aby docenić tętnice. Delikatnie popchnij lewą małżowinę uszną do góry i zlokalizuj tętnice wieńcowe pod spodem.
- Zidentyfikuj LAD i przekaż 8-0 nylonowy szew pod LAD; Wykonaj dwa rzuty, aby zabezpieczyć podwiązanie. Jeśli podwiązanie się powiedzie, lewa komora dystalna od więzadła zblednie.
- Za pomocą kleszczy usuń włożoną wcześniej gazę, a następnie delikatnie wyjmij zwijacz. Włóż elastyczną rurkę o rozmiarze 6 cali i rozmiarze 25 przymocowaną do igły o rozmiarze 25 do jamy klatki piersiowej przez otwór torakotomii. Przesuń rurkę o około 1-2 cale do przestrzeni nad lewym płucem. Przywróć mysz do pozycji leżącej na plecach i wyczyść rękawice 70% etanolem.
- Użyj szwów polipropylenowych 5-0 w prostym, przerywanym wzorze, aby zamknąć klatkę piersiową, utrzymując rurkę piersiową na miejscu. Usuń dwa szwy przytrzymujące otwartą warstwę mięśniową. Użyj szwów polipropylenowych 5-0 w prostym, ciągłym wzorze, aby zamknąć warstwę mięśniową, ponownie utrzymując rurkę piersiową na miejscu.
- Podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml do igły o rozmiarze 25 na rurce klatki piersiowej. Delikatnie pociągnąć tłok w górę, jednocześnie stopniowo wyjmując rurkę klatki piersiowej z jamy klatki piersiowej za pomocą kleszczy. Wyjmij rurkę powoli, ponieważ ten krok usuwa nadmiar powietrza i krwi, które w przeciwnym razie zostałyby uwięzione w klatce piersiowej i spowodowałyby odmę opłucnową.
- Po napełnieniu strzykawki należy odłączyć ją od igły i wyrzucić odpadki do pojemnika na odpady lub zlewu. Kontynuuj ten proces, aż rurka do klatki piersiowej zostanie całkowicie usunięta. Upewnij się, że skrzynia jest szczelnie zamknięta.
- Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1,5%. Zamknij skórę za pomocą szwów polipropylenowych 4-0 w prostym przerywanym wzorze. Wyłącz waporyzator izofluranu.
- Podawać 0,1 mg/ml buprenorfiny w 0,9% soli fizjologicznej we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP). Stosować miejscowo 2 mg/ml lidokainy z 2 mg/ml bupiwakainy w 0,9% soli fizjologicznej do nacięcia. Podawać od 200 do 500 μl 0,9% soli fizjologicznej we wstrzyknięciu podskórnym, zwiększając ilość soli fizjologicznej do wagi myszy.
- Odczekaj 5 minut po podaniu leków przeciwbólowych, aby wyjąć mysz z rurki intubacyjnej. Pomaga to w odłączeniu od respiratora.
- Jeśli mysz nie ma obustronnego uniesienia klatki piersiowej po odłączeniu od respiratora, wykonaj dekompresję igły. Aby to zrobić, wprowadź sterylną igłę o rozmiarze 25 i strzykawkę o pojemności 1 ml między 3. i 4. żeber, aż dostanie się do jamy klatki piersiowej, co oznacza nagły spadek oporu. Delikatnie pociągnij tłok do góry, aby usunąć nadmiar powietrza.
- Gdy mysz wykaże odpowiednią obustronną częstość i głębokość oddychania oraz zareaguje na uszczypnięcie palca u nogi, umieść ją w czystej klatce regeneracyjnej pod lampą grzewczą. Zapewnij myszce wilgotny pokarm i butelkę z wodą, monitorując w okapie z przepływem laminarnym przez 15 - 20 minut. Monitoruj nadmierny wysiłek oddechowy, nadmierne krwawienie lub inne potencjalnie zagrażające życiu powikłania.
- Przez następne trzy dni należy podawać 0,1 mg/ml buprenorfiny w postaci zastrzyku IP dwa razy dziennie. Monitoruj mysz codziennie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Myszy są uśpione dwadzieścia osiem dni po operacji, a następnie serca są pobierane i badane. Myszy znieczula się ketaminą w dawce 50 - 75 mg/kg oraz ksylazyną w dawce 5 - 10 mg/kg. Po uzyskaniu odpowiedniego poziomu znieczulenia zwierzęcia otwiera się jamę klatki piersiowej i za pomocą igły 23G wstrzykuje zimny chlorek potasu (KCL, 30 mM) w tylny obszar podstawy serca. Serce zostaje zatrzymane w rozkurczu. W celu dalszej walidacji podwiązania serce jest usuwane z organizmu zwierzęcia, a n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wraz z rosnącym wykorzystaniem modelu MI w laboratoriach, opisana procedura ma na celu zwiększenie wydajności i przeżywalności myszy przy jednoczesnym zminimalizowaniu ich bólu pooperacyjnego i dyskomfortu. Protokół ten ma na celu zminimalizowanie śmiertelności poprzez wprowadzenie licznych ulepszeń w różnych aspektach procedury podwiązania LAD. Jest kilka różnic. Niektóre badania intubacji na myszach, które wykorzystują ketaminę i ksylazynę wraz z izofluranem do indukcji, ze względu na korzyści płynące ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ten model został opracowany dzięki wsparciu National Institute of General Medical Sciences (NIGMS)/National Institute of Health (NIH) grant 1P20GM103652 (Project# 3) (dla MRA) oraz American Heart Association (AHA) Grant-in-Aid 14GRNT20460291 (dla MRA); grant rządu brazylijskiego CAPES (dla KR i FR); oraz nagroda Brown University LINK (dla IM). Dziękujemy również za wyjątkowe wsparcie techniczne ze strony naszych weterynarzy i personelu obiektu dla zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Źródło światła o wysokiej intensywności | Aparat Harvard | 72-0215 | |
| Platforma operacyjna SurgiSuite | Kent Scientific Corporation | SurgiSuite | Wykorzystuje ładowalną, zasilaną bateryjnie podkładkę grzewczą dalekiej podczerwieni. Ładowanie przez noc przed zabiegiem. |
| Zestaw oświetleniowy LED SurgiSuite | Kent Scientific Corporation | SURGI-5003 | |
| Sterylizator gorących koralików | Fine Science Tools | 18000-45 | Podgrzewanie trwa 15 - 20 minut. Sterylizacja narzędzi trwa 20 s. |
| Mały system znieczulenia gryzoni | VetEquip Inc. | 901810 | |
| Izofluoran | Piramal Enterprises | 66794-017-10 | |
| Buprenorfina | Apteka szpitalna Rhode Island NDC | 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Lupy chirurgiczne | Roboz | RS-6687 | |
| Mały respirator dla gryzoni | Aparat Harvard | 73-0043 | |
| Krople smarujące | Thermo Fisher Scientific | 19-898-350 | |
| Elektryczna maszynka do golenia | Kent Scientific Corporation | CL 9990-1201 | |
| Krem do depilacji | Taśma medyczna Nair | ||
| Thermo Fisher Scientific | 18-999-380 | ||
| Betadine | Thermo Fisher Scientific | 19-027136 | |
| Chusteczki 70% z izopropanolu | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Serwety chirurgiczne | Rękawice chirurgiczne Braintree | SP-TS | |
| Thermo Fisher Scientific | 18999102D | ||
| 5-0 Nici polipropylenowe | Ethicon | 8630G | |
| 8-0 Nici nylonowe | Fine Science Tools | 12051-08 | |
| Rurki utwardzane platyną | Aparat Harvard | 72-1042 | 0,3 mm średnica wewnętrzna x 0,6 mm średnica zewnętrzna |
| 0,9% soli fizjologicznej | Thermo Fisher Scientific | 19-310-207 | |
| 4-0 Nici polipropylenowe | Ethicon | 8631G | |
| 1 CC Strzykawka z igłą o rozmiarze 25 | Nożyczki Thermo Fisher Scientific | 14-826-100 | |
| Scientific Corporation | INSS600225 | ||
| Kleszcze | Kent Scientific Corporation | INS700100 | |
| Waciki bawełniane | Thermo Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| Cewnik dożylny, rozmiar 20 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Retraktor | Kent Scientific Corporation | INS 750369 | |
| Kleszcze | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Kleszcze preparacyjne, Straight | Kent Scientific Corporation | INS 700101 | |
| Kleszcze preparacyjne, Curved | Kent Scientific Corporation | INS 700103 | |
| Kleszcze hemostatyczne, Straight | Kent Scientific Corporation | INS 750451 | |
| Kleszcze hemostatyczne, zakrzywione | Kent Scientific Corporation | INS 750452 | |
| Kleszcze do tkanek | Kent Scientific Corporation | INS 700131 | |
| Uchwyt na igły | Kent Scientific Corporation | INS 600109 | |
| Nożyczki | Kent Scientific Corporation | INS 600225 |
Bibliografia
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway. Cardiovasc Res. 61 (3), 448-460 (2004).
- Roffi, M., et al. 2015 ESC Guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation. Eur Heart J. 37 (3), 267-315 (2015).
- Kumar, A., Cannon, C. P. Acute Coronary Syndromes: Diagnosis and Management, Part I. Mayo Clin Proc. 84 (10), 917-938 (2009).
- Eitan, A., Nikolsky, E. Antithrombotic therapy in patients with acute coronary syndromes: how to make the right choice. Minerva Med. 104 (4), 357-381 (2013).
- Abbate, A., Bussani, R., Amin, M. S., Vetrovec, G. W., Baldi, A. Acute myocardial infarction and heart failure: role of apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 38 (11), 1834-1840 (2006).
- Zheng, Z., et al. Nebivolol protects against myocardial infarction injury via stimulation of beta 3-adrenergic receptors and nitric oxide signaling. PLOS ONE. 9 (5), 98179(2014).
- Tarnavski, O., et al. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16 (3), 349-360 (2004).
- Buitrago, S., Martin, T. E., Tetens-Woodring, J., Belicha-Villanueva, A., Wilding, G. E. Safety and Efficacy of Various Combinations of Injectable Anesthetics in BALB/c Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (1), 11-17 (2008).
- Kolk, M. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. J Vis Exp. (32), e1438(2009).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. Acute myocardial infarction in rats. Journal of visualized experiments : J Vis Exp. (48), (2011).
- Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in Langendorff rat model. Cardiovasc Drugs Ther. 23 (4), 327-331 (2009).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Res. 1319, 21-32 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
