Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo zalet łatwej aplikacji i opłacalności, podskórne modele myszy mają poważne ograniczenia i nie symulują dokładnie biologii guza i rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wprowadzono ortotopowe modele myszy; Jednak takie modele są wymagające technicznie, zwłaszcza w pustych narządach, takich jak jelito grube. Aby wytworzyć jednolite guzy, które niezawodnie rosną i dają przerzuty, kluczowe znaczenie mają standaryzowane techniki przygotowania i wstrzykiwania komórek nowotworowych.
Opracowaliśmy ortotopowy mysi model raka jelita grubego (CRC), który rozwija bardzo jednolite guzy i może być używany do badań biologicznych nowotworów, jak również do prób terapeutycznych. Komórki nowotworowe z guzów pierwotnych, dwuwymiarowych (2D) linii komórkowych lub trójwymiarowych (3D) organoidów są wstrzykiwane do jelita ślepego i, w zależności od potencjału przerzutowego wstrzykniętych komórek nowotworowych, tworzą guzy o wysokim przerzutach. Ponadto CTC można znaleźć regularnie. Opisujemy tutaj technikę przygotowania komórek nowotworowych zarówno z linii komórkowych 2D, jak i organoidów 3D, a także pierwotnej tkanki nowotworowej, techniki chirurgiczne i iniekcyjne, a także izolację CTC od myszy z guzem i przedstawiamy wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów.
Wprowadzenie
Rak jelita grubego (CRC) jest jedną z najczęstszych przyczyn zgonów z powodu raka w krajach zachodnich. 1 Podczas gdy pierwotny guz często może być wycięty, wystąpienie odległych przerzutów dramatycznie pogarsza rokowanie i często prowadzi do śmierci. 2,3 Biologicznym korelatem przerzutów są krążące komórki nowotworowe (CTC), które odłączają się od guza, przeżywają krążenie, przyczepiają się do nabłonka w narządzie docelowym, atakują narząd i ostatecznie wyrastają z nowych zmian. 4 Chociaż wiadomo, że CTC mają znaczenie prognostyczne 5
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przedstawione tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały niezależnie ocenione i zatwierdzone przez instytucjonalny i rządowy Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Federacji Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA). Podjęto wszelkie możliwe środki, aby zminimalizować cierpienie, w tym znieczulenie i analgezję lub, jeśli to konieczne, przedwczesną eutanazję.
1. Przygotowanie komórek i organoidów
UWAGA: Użyj objętości 20 μL ze 100 000 komórek do każdego wstrzyknięcia. Użyj macierzy membrany podstawnej (BMM), aby zapobiec wyciekom i zapewnić s....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Skuteczne i powtarzalne generowanie guzów jelita grubego w tym modelu zależy w stopniu krytycznym od precyzyjnego wstrzyknięcia komórek bez ich rozlania lub wycieku. Jeśli zostanie to osiągnięte, model ten jest niezwykle niezawodny i bardzo rzadko prowadzi do sztucznego rozsiewu otrzewnowego. Kinetyka wzrostu guzów, jak i wzorce ich rozsiewu, zależą od biologii użytych organoidów i komórek.15 Podczas gdy komórki HCT116 niezawodnie metastazują do wątroby w tym model.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo ich przedklinicznie udowodnionej aktywności w podskórnych modelach mysich, zdecydowana większość nowych związków zawodzi w badaniach klinicznych i nigdy nie trafia do kliniki. 11 Ten oczywisty brak podskórnych modeli myszy do dokładnej symulacji biologii i wzorców wzrostu nowotworów doprowadził do opracowania ortotopowych modeli myszy opartych na wstrzyknięciu komórek nowotworowych bezpośrednio do pierwotnego narządu.
Ortotopowe modele myszy są w stanie symulować.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (WE 3548/4-1) oraz Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywki i komponenty do hodowli komórkowych | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Suplement Glutamax-I (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicylina/ Streptomycyna (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ podłoże |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | podstawowa pożywka linii komórkowych 2D (DMEM/10% FCS) |
| Surowica cielęca płodu (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | podstawowa pożywka linii komórkowych 2D (DMEM/10% FCS) |
| Bufor dysocjacji enzymatycznej TrypLE Express | Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel Matryca błony podstawnej (BMM, bez czerwieni fenolowej) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, czerwień fenolowa) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Płytki 6-/48-dołkowe z pokrywką | CORNING | 3516/3548 | |
| kolba do hodowli komórkowych 75 cm², 250 ml | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| kolba do hodowli komórkowych 150 cm², 600 ml | Corning B.V. Nauki Przyrodnicze | 355001 | |
| Probówki Eppendorf 1,5 ml / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| Probówki wirówkowe 15 mL, 50 mL | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Szkiełka liczące (do maszyny liczącej TC20) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pipety Pasteura (szkło, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | cienko ciągnięte za pomocą palnika Bunsena |
| GentleMACS Dysocjator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej |
| Rurki MACS C | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej |
| Zestaw do dysocjacji guza ludzkiego | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | do przygotowania |
| pierwotnej tkanki nowotworowejSokół 70 i mikro; m Sitko komórkowe | Corning BV Life Sciences | 352350 | do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Sprzęt chirurgiczny | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Tlen | medyczny Air Liquide Medical | ||
| Temgesic-Bepanthen | |||
| - maść okulistyczna | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Sól fizjologiczna 0,9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| Strzykawka 1 ml (bez martwej objętości) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | ||
| Kleszczyki Micro-Adson | FST - Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Nożyczki do tęczówki - ToughCut | FST - Narzędzia do nauki o lasce | 14058-11 | |
| Uchwyt do igieł Olsen-Hegar | FST - Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Zestaw AutoClip | FST - Narzędzia do nauki o nauce | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgiczny szew) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Stołowy aparat do znieczulenia badawczego z płukanką O2 i waporyzatorem Sevoflurane | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump z kontrolerem Micro4 World | Precision Instruments | UMP3-4 | sprzęt do wysoce kontrolowanego iniekcjonizmu ortotopowego |
| Przełącznik nożny do kontrolera SYS-Micro4 | World Precision Instruments | 15867 | sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej |
| Trójosiowy ręczny mikromanipulator | World Precision Instruments | M325 | sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej |
| Magnetyczny stojak do mikromanipulatora | World Precision Instruments | Sprzęt M10 | do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej |
| Stalowa podstawa do stojaka magnetycznego M10 | World Precision Instruments | 5479 | sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej |
| Płyta grzejna 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Golarka do włosów | AESCULAP - | ||
| mikroskop chirurgiczny | Parkland | Scientific VS-2Z | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Izolacja CTC | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Gradient gęstości średni – Ficoll | StemCell - Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anty-ludzkie przeciwciało CD326 (EpCAM) klon 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anty-mysie CD326 (EpCAM) klon przeciwciała G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| szalka Petriego, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescencyjny mikroskop do hodowli komórek | Mikromanipulator Leica | ||
| Transferman 4r | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | podłączona do mikromanipulatora | |
| Uniwersalny ściągacz mikroelektrod Dmz | Dagan Corporation | wymagany do produkcji mikrokapilar do aspiracji pojedynczych komórek | |
| Kapilary szklane z pryzmatem | Dagan Corporation | ||
| Długopis PAP | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | bufor do zbierania |
| Surowicy cielęcej płodu (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | bufor do pobierania |
| penicylina/streptomycyna (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | bufor do pobierania |
| EDTA | Roth | 8040.1 | bufor do kompletacji |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Immunohistochemistry | |||
| Oczyszczony klon przeciwciała anty-ludzkiego CD326 (EpCAM) 9C4 | BioLegend | 324201 | immunohistochemia EpCAM (por. rys. 2C) |
| HRP królik anty-mysie IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemia (cf, ryc. 2C) |
Bibliografia
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
