Artykuł metodologiczny

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

DOI:

10.3791/55357

⸱

18 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo zalet łatwej aplikacji i opłacalności, podskórne modele myszy mają poważne ograniczenia i nie symulują dokładnie biologii guza i rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wprowadzono ortotopowe modele myszy; Jednak takie modele są wymagające technicznie, zwłaszcza w pustych narządach, takich jak jelito grube. Aby wytworzyć jednolite guzy, które niezawodnie rosną i dają przerzuty, kluczowe znaczenie mają standaryzowane techniki przygotowania i wstrzykiwania komórek nowotworowych.

Opracowaliśmy ortotopowy mysi model raka jelita grubego (CRC), który rozwija bardzo jednolite guzy i może być używany do badań biologicznych nowotworów, jak również do prób terapeutycznych. Komórki nowotworowe z guzów pierwotnych, dwuwymiarowych (2D) linii komórkowych lub trójwymiarowych (3D) organoidów są wstrzykiwane do jelita ślepego i, w zależności od potencjału przerzutowego wstrzykniętych komórek nowotworowych, tworzą guzy o wysokim przerzutach. Ponadto CTC można znaleźć regularnie. Opisujemy tutaj technikę przygotowania komórek nowotworowych zarówno z linii komórkowych 2D, jak i organoidów 3D, a także pierwotnej tkanki nowotworowej, techniki chirurgiczne i iniekcyjne, a także izolację CTC od myszy z guzem i przedstawiamy wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jelita grubego (CRC) jest jedną z najczęstszych przyczyn zgonów z powodu raka w krajach zachodnich. 1 Podczas gdy pierwotny guz często może być wycięty, wystąpienie odległych przerzutów dramatycznie pogarsza rokowanie i często prowadzi do śmierci. 2,3 Biologicznym korelatem przerzutów są krążące komórki nowotworowe (CTC), które odłączają się od guza, przeżywają krążenie, przyczepiają się do nabłonka w narządzie docelowym, atakują narząd i ostatecznie wyrastają z nowych zmian. 4 Chociaż wiadomo, że CTC mają znaczenie prognostyczne 5,6,7,8,9, ich biologia jest tylko częściowo zrozumiała, co wynika z ich ekstremalnej rzadkości w CRC. 10

Modele myszy są potężnym narzędziem do badania różnych aspektów biologii raka. Klasyczne, podskórne modele guzów są wytwarzane przez podskórne wstrzyknięcie komórek nowotworowych do myszy biorców, które mogą być immunokompetentne (jeśli stosuje się syngeniczne mysie komórki nowotworowe) lub z niedoborem odporności. Podskórne modele guzów są niedrogie i szybko dostarczają danych; Ich wzrost guza w punkcie końcowym można łatwo i nieinwazyjnie zmierzyć. Jednak 88% nowych związków, które wykazały działanie przeciwnowotworowe w takich modelach, zawodzi w badaniach klinicznych. 11 Jest to częściowo spowodowane różnicami międzygatunkowymi między ludźmi a myszami; Jednak duża część tego niepowodzenia wynika z niskiej wartości predykcyjnej podskórnych modeli myszy.

Ortotopowe modele myszy, w których komórki nowotworowe są wstrzykiwane do narządu pochodzenia i w ten sposób rosną w swoim pierwotnym mikrośrodowisku, są coraz częściej wykorzystywane w badaniach nad rakiem. 11,12,13,14 Modele ortotopowe nie tylko symulują lokalne warunki wzrostu guza; w wyniku anatomicznie prawidłowego miejsca wzrostu guza, ortotopowe modele myszy umożliwiają również realistyczną symulację przerzutów i dlatego są wykorzystywane do badania biologii CTC8,15,16 lub ich odpowiedzi na różne metody leczenia w CRC. 13,17

Główną wadą ortotopowych modeli myszy jest ich techniczna złożoność. W zależności od narządu, do którego mają zostać wstrzyknięte komórki, krzywa uczenia się, zanim eksperymentator będzie w stanie wywołać powtarzalne nowotwory, jest dość długa. Dotyczy to zwłaszcza modeli raka jelita grubego, ponieważ komórki nowotworowe muszą zostać wstrzyknięte do ściany jelita, co często prowadzi do perforacji, wycieku komórek nowotworowych lub utraty komórek nowotworowych w dole śluzowym. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie metody przygotowania komórek z pierwotnych próbek tkanek, linii komórkowych 2D oraz hodowli organoidów 3D i ich wstrzykiwania do jelita ślepego myszy. Opisana tutaj technika prowadzi do wysoce jednorodnych guzów i, w zależności od biologii guza linii komórkowej użytej do iniekcji, powtarzalnego tworzenia odległych przerzutów i CTC u myszy biorców. 15

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały niezależnie ocenione i zatwierdzone przez instytucjonalny i rządowy Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Federacji Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA). Podjęto wszelkie możliwe środki, aby zminimalizować cierpienie, w tym znieczulenie i analgezję lub, jeśli to konieczne, przedwczesną eutanazję.

1. Przygotowanie komórek i organoidów

UWAGA: Użyj objętości 20 μL ze 100 000 komórek do każdego wstrzyknięcia. Użyj macierzy membrany podstawnej (BMM), aby zapobiec wyciekom i zapewnić standaryzowaną iniekcję. Aby zapewnić powtarzalne wyniki, należy przeprowadzać testy uwierzytelniania linii komórkowych (np. za pomocą profilowania STR) w regularnych odstępach czasu.

  1. Przygotowanie pierwotnych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek
    UWAGA: Zawsze pracuj w sterylnych warunkach. Konieczne jest natychmiastowe przeniesienie świeżo wyciętej tkanki z sali operacyjnej do laboratorium na lodzie w celu zapewnienia wysokiej żywotności komórek.
    Dobre samopoczucie pacjenta i optymalne leczenie muszą być zawsze na pierwszym miejscu. Dlatego próbki tkanek do badań muszą być pozyskiwane w sposób, który nie przeszkadza w późniejszym badaniu patologicznym i ocenie stopnia zaawansowania wyciętego guza. W większości przypadków uzasadnione jest zatem zlecenie pobrania próbek do badań przez przeszkolonego patologa, aby zapewnić brak ingerencji w diagnozę patologiczną.
    1. Natychmiast po sterylnym usunięciu z wyciętej próbki (najlepiej ~1 cm3) umieść próbkę tkanki w probówce o pojemności 50 ml wstępnie wypełnionej 20-30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przechowywać probówkę na lodzie i natychmiast przenieść do laboratorium.
    2. Umieść tkankę na szalce Petriego i umyj ją dwukrotnie dużą ilością PBS, aby usunąć pozostałą krew.
    3. Pokrój tkankę na małe kawałki (~ 2-4 mm) za pomocą skalpela (np. z ostrzem #20 lub #36).
    4. Użyj dysocjatora zgodnie z instrukcjami producenta w celu dalszej dysocjacji tkanki nowotworowej do zawiesiny jednokomórkowej. Alternatywnie, użyj innych protokołów enzymatycznego trawienia guza.
    5. Policz komórki otrzymanej zawiesiny jednokomórkowej (np. w liczniku redlic lub hemocytometrze).
    6. Odwirować (5 minut przy 1 500 x g) i dwukrotnie przepłukać zawiesinę komórek PBS.
    7. Ponownie zawiesić komórki w BMM w stężeniu 5 x 106 komórek/ml i przechowywać je na lodzie.
  2. Przygotowanie linii komórkowych do iniekcji
    1. Hoduj wszystkie linie komórkowe raka jelita grubego w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO2 ) i przygotuj je w dniu operacji.
    2. Pobrać komórki zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych, policzyć komórki (np. w liczniku redlic lub hemocytometrze) i obliczyć wymaganą ilość dla wszystkich wstrzyknięć w zależności od liczby zwierząt, które mają zostać wstrzyknięte.
    3. Przygotować 3-5 razy więcej niż faktycznie potrzebna objętość, aby uwzględnić straty w pipetowaniu i martwą objętość strzykawki do wstrzykiwań.
    4. Odwirować (5 minut przy 1 500 g) i dwukrotnie przemyć zawiesinę komórkową PBS.
    5. Ponownie zawiesić komórki w BMM w stężeniu 5 x 106 komórek/ml i przechowywać je na lodzie.
  3. Preparat organoidowy
    UWAGA: Wszystkie hodowle organoidów 3D są hodowane w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO2 ). Szczegółowe protokoły hodowli organoidów zostały opublikowane wcześniej. 18,19,20 Podobnie jak w przypadku konwencjonalnych linii komórkowych, zalecamy objętość 20 μL BMM przy 100 000 komórek na wstrzyknięcie. Organoidy przygotowuje się w dniu zabiegu w następujący sposób:
    1. Przygotuj następującą pożywkę (zwaną dalej DMEM/F12+++): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutaminy (200 mM) + 1% penicyliny/Streptomycyny.
    2. Napełnij wstępnie probówki o pojemności 15 ml 1 ml DMEM/F12+++.
    3. Ostrożnie odessać organoidy z powierzchni płytki hodowlanej i przenieść zawartość 3 do 5 studzienek do jednej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Ostrożnie rozbij organoidy na mniejsze kawałki, pipetując je w górę i w dół za pomocą przedłużonej szklanej pipety.
    5. Dodać 5 ml DMEM/F12+++ do probówki, a następnie odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut.
    6. Po odwirowaniu usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 600 μl enzymatycznego buforu dysocjacyjnego i przenieść zawiesinę do jednego dołka na płytce 6-dołkowej.
    7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-5 minut, a następnie ostrożnie pipetować zawiesinę w górę i w dół w celu rozpuszczenia organoidów.
      UWAGA: Sprawdź trawienie pod mikroskopem; Jest kompletny, gdy wszystkie skupiska komórek zostały zdysocjowane na pojedyncze komórki.
    8. Po pomyślnym trawieniu dodaj 1,4 ml DMEM/F12+++, aby zatrzymać trawienie. Następnie przenieś wszystkie studzienki strawionych organoidów do probówki o pojemności 50 ml.
    9. Policz komórki i oblicz wymaganą ilość dla wszystkich wstrzyknięć.
    10. Przygotować 3 - 5 razy większą objętość niż faktycznie potrzebna objętość, aby uwzględnić straty w pipetowaniu i martwą objętość strzykawki iniekcyjnej
    11. Odwirować (5 minut przy 1 500 x g) i dwukrotnie przepłukać zawiesinę komórek PBS.
    12. Ponownie zawiesić komórki w BMM do stężenia 5 x 106 komórek/ml i utrzymywać je na lodzie.

2. Ortotopowy model myszy

  1. Przygotowanie zwierząt biorców do zabiegu chirurgicznego
    UWAGA: Użyj 6-8 tygodniowego NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, NSG) myszy jako biorcy. 21 NSG to jedne z najbardziej zagrożonych immunologicznie myszy, pozbawione dojrzałych komórek B, T i NK oraz wielu innych wad immunologicznych. 21 Niezawodnie rozwijają guzy, nawet jeśli wstrzykuje się im niską liczbę komórek i są bardzo podatne na odległe przerzuty. Myszy NSG są doskonałymi hodowcami i mogą być trzymane w konwencjonalnych jednostkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF).
    1. Przed pierwszym nacięciem należy wstrzyknąć podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny.
    2. Stosować sewofluran w stężeniu 3-3,5% obj. do znieczulenia ogólnego. Utrata odruchu szczypania palca u nogi wskazuje na wystarczające znieczulenie.
    3. Zakryj oczy znieczulonych myszy maścią okulistyczną, aby uniknąć wysuszenia rogówki.
    4. Unieruchamiaj myszy w pozycji leżącej na małym stole.
    5. Ogol brzuch golarką elektryczną (alternatywnie można użyć kremu do depilacji) i zdezynfekuj go co najmniej 3-krotną ilością klorheksydyny/jodu i 70% alkoholu.
    6. Przykryj pole operacyjne sterylnymi serwetami.
      UWAGA: Stosowanie antybiotyków okołooperacyjnych jest opcjonalne i podlega wytycznym instytucjonalnym.
  2. Laparotomia w linii środkowej i odsłonięcie jelita ślepego
    1. Użyj nożyczek (alternatywnie można użyć skalpeli), aby wykonać małe nacięcie w linii środkowej (3 - 5 mm) skóry w dolnej części brzucha. Podnieś muskulaturę ściany brzucha kleszczami i ostrożnie naciąć ją nożyczkami, otwierając w ten sposób jamę brzuszną.
    2. Zidentyfikuj i ostrożnie zewnętrz jelito ślepe za pomocą atraumatycznych kleszczy. Umieść ślepy woreczek końcowy jelita ślepego na brzuchu, kierując się w stronę czaszki.
    3. Po utwardzeniu utrzymuj jelito ślepe wilgotne za pomocą ciepłych wacików z soli fizjologicznej przez cały czas.
  3. Iniekcja ortotopowa, zamknięcie jamy brzusznej i rekonwalescencja pooperacyjna
    1. Do wstrzykiwań dociernych należy użyć standardowej strzykawki o pojemności 1 ml z kaniulą 30 G. Zamontuj tę strzykawkę na pompie do mikroiniekcji, która z kolei jest zamontowana na mikromanipulatorze.
    2. Ostrożnie chwyć czubek jelita ślepego atraumatycznymi kleszczami i delikatnie go wygładzij, głaszcząc go w dół drugim zestawem kleszczy zwilżonych ciepłą solą fizjologiczną.
    3. Umieść kaniulę bezpośrednio nad jelitem ślepym.
    4. Wykonaj następujące czynności pod kontrolą wzrokową za pomocą dwuokularowego mikroskopu chirurgicznego.
    5. Ostrożnie chwyć jelito ślepe dwoma atraumatycznymi kleszczami na obu końcach zewnętrznej części jelita ślepego, lekko je rozciągnij, a następnie powoli przeciągnij nad kaniulą, która jest umieszczona równolegle i bezpośrednio powyżej. Bardzo ważne jest, aby nie dokonywać perforacji całej ściany jelita (a więc wstrzykiwania komórek do światła), a także nie dokonywać perforacji błony surowiczej poza początkowy punkt penetracji, ponieważ doprowadziłoby to do przecieku i rozsiewu otrzewnej.
      1. Przesuń jelito w kierunku kaniuli, a nie kaniulę w kierunku jelita. Przytrzymaj i rozciągnij jelito między dwoma kleszczami. Ręce chirurga muszą spoczywać na powierzchni, aby zmniejszyć drżenie.
    6. Wstrzyknąć komórki między błoną surowiczą (widzianą jako bardzo cienka, półprzezroczysta wyściółka nad śródściennymi naczyniami krwionośnymi) a mięśniami. Dlatego kaniula musi być wizualnie umieszczona nad naczyniami krwionośnymi i pod cienką półprzezroczystą błoną.
    7. Użyj przełącznika nożnego, aby rozpocząć wstrzykiwanie w celu zmniejszenia drżenia, gdy kaniula znajduje się w ścianie jelita.
    8. Gdy kaniula znajdzie się na swoim miejscu, rozpocznij wstrzykiwanie. Stosować czas trwania 20 s, co daje ustawienie 1 μl/s na jednostce sterującej pompy.
      UWAGA: Wstrzyknięcie do uszkodzonego naczynia krwionośnego lub w jego pobliżu prowadzi do bezpośredniego rozsiewu wewnątrznaczyniowego i przerzutów odległych, dlatego należy go unikać.
    9. Po zakończeniu iniekcji należy ostrożnie wyjąć kaniulę, pociągając ją do tyłu.
    10. Umieść suchy wacik pod jelitem ślepym, a następnie dokładnie spłucz jelito ślepe wodą destylowaną, aby zlizować wyciekające komórki i tym samym zapobiec sztucznemu rozprzestrzenianiu się otrzewnej.
  4. Zamknięcie brzucha i rekonwalescencja pooperacyjna
    1. Po spłukaniu delikatnie cofnij jelito ślepe do jamy brzusznej.
    2. Zamknij ścianę brzucha za pomocą 6-0 szybko wchłaniających się szwów biegowych.
    3. Zamknij skórę klipsami chirurgicznymi do ran.
    4. Umieść mysz na mapie ogrzewania ustawionej na 38 °C, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
    5. Uważnie obserwuj stan pooperacyjny myszy przez następne 48 godzin. W przypadku wystąpienia dolegliwości należy podawać 0,05 mg/kg buprenorfiny co 12 godzin.
    6. Monitoruj myszy co najmniej raz dziennie pod kątem oznak niepokoju spowodowanego wzrostem guza.

3. Izolacja krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pełnej

UWAGA: Pobieranie krwi przez przezskórne nakłucie serca u znieczulonych myszy, a następnie eutanazja. Idealnie byłoby, gdyby 1000 μl krwi zostało pobrane do strzykawki wypełnionej 100 μl antykoagulantu (kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) lub heparyna). Użyj przeciwciała anty-ludzkiego-EpCAM (cząsteczka adhezyjna komórek nabłonka), aby zidentyfikować CTC. Działa to bardzo dobrze, jeśli w modelu mysim wykorzystuje się ludzkie linie komórkowe nabłonka. W przypadku innych urządzeń mogą być wymagane inne przeciwciała.

  1. Wzbogacenie CTC:
    1. Napełnij wstępnie probówki o pojemności 15 ml pożywką o gradiencie gęstości o pojemności 5 ml i ostrożnie przenieś krew do probówki o pojemności 15 ml.
    2. Odwirować (30 minut przy 300 x g bez hamulca) i ostrożnie usunąć górny supernatant.
    3. Resztę przelać do nowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować (15 min, 300 x g z hamulcem).
    4. Odzyskać interfazę zawierającą komórki jednojądrzaste (odrzucić resztę) i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
    5. Zawiesić osad w 200 μl PBS/1% EDTA i dodać 4 μl przeciwciała EpCAM. Inkubuj 20 minut na lodzie w ciemności.
  2. Przesiewanie i kompletacja
    1. Przygotować następujący bufor (zwany dalej buforem do zbierania): PBS + 10% płodowa surowica cielęca (FCS) + 1% penicylina/streptomycyna (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Za pomocą pisaka PAP narysuj okrąg o średnicy ~1 cm na sterylnej szalce Petriego o średnicy 6 cm (zapobiega rozpraszaniu się płynu w naczyniu) i odpipetuj 700 μl buforu do tego koła.
    3. Dodaj 50 μl zawiesiny komórek do 700 μl buforu do pobierania w okręgu. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem. Podziel próbkę na różne naczynia, jeśli jest zbyt gęsta.
    4. Poczekaj, aż komórki się uspokoją (~5 min).
    5. Przesiewać kroplę zawiesiny komórkowej dla komórek barwionych (= EpCAM-dodatnich) komórek.
    6. Po znalezieniu komórki należy ją pobrać za pomocą mikromanipulatora i umieścić w buforze o pojemności 50 μl, w zależności od zamierzonej dalszej analizy (np. buforu do ekstrakcji RNA lub pożywki hodowlanej).
    7. W zależności od zamierzonych dalszych analiz, wyizolować komórki i/lub pożywkę EpCAM-ujemne jako kontrole ujemne.
    8. Kontynuuj dalsze analizy (np. hodowla komórkowa, PCR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne i powtarzalne generowanie guzów jelita grubego w tym modelu zależy przede wszystkim od dokładnego wstrzykiwania komórek bez rozlewania lub wycieku. Jeśli uda się to osiągnąć, model ten jest niezwykle niezawodny i bardzo rzadko prowadzi do sztucznego rozsiewu otrzewnej. Kinetyka wzrostu guzów, a także wzorce ich rozprzestrzeniania się zależą od biologii użytych organoidów i komórek. 15 Podczas gdy komórki HCT116 niezawodnie dają przerzuty do wątroby w tym m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo ich przedklinicznie udowodnionej aktywności w podskórnych modelach mysich, zdecydowana większość nowych związków zawodzi w badaniach klinicznych i nigdy nie trafia do kliniki. 11 Ten oczywisty brak podskórnych modeli myszy do dokładnej symulacji biologii i wzorców wzrostu nowotworów doprowadził do opracowania ortotopowych modeli myszy opartych na wstrzyknięciu komórek nowotworowych bezpośrednio do pierwotnego narządu.

Ortotopowe modele myszy są w stanie symulować...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (WE 3548/4-1) oraz Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywki i komponenty do hodowli komórkowych
Advanced DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ medium
Suplement Glutamax-I (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++ medium
Penicylina/ Streptomycyna (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ podłoże
DMEMLife Technologies GmbH61965026podstawowa pożywka linii komórkowych 2D (DMEM/10% FCS)
Surowica cielęca płodu (FCS)BIOCHROM AGS 0115podstawowa pożywka linii komórkowych 2D (DMEM/10% FCS)
Bufor dysocjacji enzymatycznej TrypLE ExpressTechnologies GmbH12604021
Matrigel Matryca błony podstawnej (BMM, bez czerwieni fenolowej)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Trypsin-EDTA (0,25%, czerwień fenolowa)Life Technologies GmbH25200072
Płytki 6-/48-dołkowe z pokrywkąCORNING3516/3548
kolba do hodowli komórkowych 75 cm², 250 mlVWR International GmbH734-2066
kolba do hodowli komórkowych 150 cm², 600 mlCorning B.V. Nauki Przyrodnicze355001
Probówki Eppendorf 1,5 ml / 2 mLSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
Probówki wirówkowe 15 mL, 50 mLGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 Szkiełka liczące (do maszyny liczącej TC20)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
Pipety Pasteura (szkło, 150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251cienko ciągnięte za pomocą palnika Bunsena
GentleMACS DysocjatorMiltenyi Biotec130-093-235do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej
Rurki MACS CMiltenyi Biotec130-093-237do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej
Zestaw do dysocjacji guza ludzkiegoMiltenyi Biotec130-095-929do przygotowania
pierwotnej tkanki nowotworowejSokół 70 i mikro; m Sitko komórkoweCorning BV Life Sciences352350do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Sprzęt chirurgiczny
SevofluraneAbbVie Germany GmbH & Co. KG-
Tlenmedyczny Air Liquide Medical
Temgesic-Bepanthen
- maść okulistycznaBayer Vital GmbH10047757
Sól fizjologiczna 0,9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
Strzykawka 1 ml (bez martwej objętości) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
30GBECTON DICKINSON304000
Lohmann & Rauscher Deutschland13356
Kleszczyki Micro-AdsonFST - Fine Science Tools11018-12
Nożyczki do tęczówki - ToughCutFST - Narzędzia do nauki o lasce14058-11
Uchwyt do igieł Olsen-HegarFST - Fine Science Tools12002-12
Zestaw AutoClipFST - Narzędzia do nauki o nauce12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgiczny szew)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Stołowy aparat do znieczulenia badawczego z płukanką O2 i waporyzatorem SevofluraneParkland ScientificV3000PS/PK
UltraMicro Pump z kontrolerem Micro4 WorldPrecision InstrumentsUMP3-4sprzęt do wysoce kontrolowanego iniekcjonizmu ortotopowego
Przełącznik nożny do kontrolera SYS-Micro4World Precision Instruments15867sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej
Trójosiowy ręczny mikromanipulatorWorld Precision InstrumentsM325sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej
Magnetyczny stojak do mikromanipulatoraWorld Precision InstrumentsSprzęt M10do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej
Stalowa podstawa do stojaka magnetycznego M10World Precision Instruments5479sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej
Płyta grzejna 062Labotect13854
Isis - Golarka do włosówAESCULAP -
mikroskop chirurgicznyParklandScientific VS-2Z
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izolacja CTC
EDTARoth8040.1
Gradient gęstości średni – FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 anty-ludzkie przeciwciało CD326 (EpCAM) klon 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 anty-mysie CD326 (EpCAM) klon przeciwciała G8.8BioLegend118210
szalka Petriego, ø 60 x 15 mm, 21 cm², VentGreiner bio-one628102
Fluorescencyjny mikroskop do hodowli komórekMikromanipulator Leica
Transferman 4rEppendorf
CellTram AirEppendorfpodłączona do mikromanipulatora
Uniwersalny ściągacz mikroelektrod DmzDagan Corporationwymagany do produkcji mikrokapilar do aspiracji pojedynczych komórek
Kapilary szklane z pryzmatemDagan Corporation
Długopis PAPAbcamab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169bufor do zbierania
Surowicy cielęcej płodu (FCS)BIOCHROM AGS 0115bufor do pobierania
penicylina/streptomycyna (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122bufor do pobierania
EDTARoth8040.1bufor do kompletacji
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Immunohistochemistry
Oczyszczony klon przeciwciała anty-ludzkiego CD326 (EpCAM) 9C4BioLegend324201immunohistochemia EpCAM (por. rys. 2C)
HRP królik anty-mysie IgGAbcamab97046EpCAM immunohistochemia (cf, ryc. 2C)
Life do delikatnego GmbH-Buprenorphine Igła iniekcyjna Waciki celulozowe Braun-lornetkowy Pompa aspiracyjna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wtryskiwanie kom rek nowotworowychwtryskiwanie do k tnicywirowanie w gradiencie g sto ciizolacja CTCtechnika chirurgicznaprzerzuty nowotworowe

Powiązane artykuły