Artykuł metodologiczny

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

DOI:

10.3791/55360

⸱

7 marca 2017

 , 
1Graduate Program in Neuroscience, Department of Neurology, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Departments of Neurology, Neurosurgery, Pathology and Pediatrics, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozlany glejak wewnętrzny mostu (DIPG) to nowotwór pnia mózgu wieku dziecięcego, który niesie ze sobą powszechnie śmiertelne rokowania. Ponieważ resekcja chirurgiczna nie jest opłacalną strategią leczenia, a biopsja nie jest rutynowo wykonywana, dostępność próbek pacjentów do badań jest ograniczona. W związku z tym wysiłki mające na celu zbadanie tej choroby zostały zakwestionowane przez niedostatek wiernych modeli choroby. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, opisujemy tutaj protokół szybkiego przetwarzania próbek tkanek z sekcji zwłok w celu wygenerowania trwałych modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta, które można wykorzystać w testach in vitro lub eksperymentach in vivo z ortotopowym ksenoprzeszczepem. Modele te mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych potencjalnych celów leków oraz do badania podstawowych procesów patobiologicznych w obrębie DIPG. Protokół ten można dalej rozszerzyć o analizę i izolację komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), co umożliwia późniejszą analizę ekspresji genów, ekspresji białek lub epigenetycznych modyfikacji DNA na poziomie komórki masowej lub pojedynczej komórki. Wreszcie, protokół ten można również dostosować do generowania posiewów pochodzących od pacjentów dla innych nowotworów ośrodkowego układu nerwowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DIPG to agresywny nowotwór złośliwy ośrodkowego układu nerwowego, który pojawia się w połowie wieku młodzieńczego1,2. Pomimo dziesięcioleci badań klinicznych, obecne leczenie ogranicza się do radioterapii, która zapewnia tymczasową poprawę lub stabilizację objawów i wydłuża medianę przeżycia średnio tylko o 3 miesiące. Nawet w przypadku radioterapii mediana całkowitego przeżycia wynosi tylko 9 miesięcy, a 90% dzieci umiera z powodu choroby w ciągu 2 lat od wstępnego rozpoznania. Ze względu na naciekający charakter guza i krytyczne funkcje pnia mózgu, resekcja chirurgiczna nie jest możliwa. Co więcej, w Stanach Zjednoczonych w przeszłości nie wykonywano biopsji chirurgicznej w kierunku DIPG 3, ponieważ analiza histopatologiczna nie odgrywa obecnie żadnej roli w kierowaniu leczeniem klinicznym, a diagnozę można zwykle postawić za pomocą samego neuroobrazowania. W związku z tym dostępność tkanki nowotworowej do badań jest ograniczona, co ogranicza wysiłki zmierzające do prowadzenia badań nad cząsteczkami kandydującymi na leki i biologią leżącą u podstaw nowotworu. Warto zauważyć, że ulepszenia w neuroobrazowaniu i technikach stereotaktycznych pozwoliły na opracowanie bezpiecznych biopsji DIPG w ostatnich latach4, które w połączeniu z postępem w biologii molekularnej zmieniły nasze rozumienie choroby. Obecnie prowadzonych jest wiele badań klinicznych wykorzystujących biopsję wstępną i profilowanie molekularne DIPG w celu indywidualizacji planów leczenia (NCT01182350, NCT02274987)5.

DIPG i inne glejaki wysokiego stopnia u dzieci reprezentują odrębne choroby od swoich dorosłych odpowiedników glejaka6,7, a zatem wierne modele eksperymentalne DIPG są niezbędne do zrozumienia jego unikalnej patofizjologii i odkrycia skutecznych strategii terapeutycznych. W ostatnich latach skoncentrowane wysiłki mające na celu uzyskanie tkanki nowotworowej DIPG do badań w czasie autopsji lub, rzadziej, biopsji, zrewolucjonizowały nasze zrozumienie i zdolność do badania DIPG. Sekwencjonowanie całego genomu ujawniło powtarzającą się mutację w histonie H3, rodzinie 3A (H3F3A) i klastrze histonów 1, H3b (HIST1H3B), co stanowi pierwszy przykład choroby człowieka spowodowanej mutacjami w białkach kodujących histony8,9,10,11. Ponadto podzbiór DIPG wyraża mutacje w genie ACVR1, które nie zostały wcześniej zgłoszone w raku, ale są identyczne z mutacjami występującymi we wrodzonym zaburzeniu rozwoju wieku dziecięcego fibrodysplazja kostna progressiva8,9,10,11. Również pierwsze hodowle komórek DIPG pochodzące od pacjentów i ortotopowe modele ksenoprzeszczepów zostały już stworzone1,2,12,13,14, a także modele mysie stworzone poprzez bezpośrednią ksenotransplantację komórek nowotworowych myszom z niedoborem odporności w celu wygenerowania seryjnych ksenoprzeszczepów 3,14,15. Wstępne badania przesiewowe leków z wykorzystaniem tych modeli pochodzących od pacjentów zidentyfikowały obiecujące nowe czynniki do translacji klinicznej4,14 i położyły podwaliny pod co najmniej jedno badanie kliniczne (NCT02717455).

Te pierwsze kroki w kierunku postępu to dopiero początek, a liczne próbki tkanek pochodzących od pacjentów i modele hodowlane będą niezbędne do zdefiniowania podtypów choroby i opracowania najskuteczniejszych strategii terapeutycznych. Genetycznie zmodyfikowane mysie modele DIPG ułatwią również badania mające na celu pogłębienie naszej podstawowej wiedzy na temat choroby. Wysiłki podjęte w celu wygenerowania modeli genetycznych dla DIPG będą wspomagane przez podstawowe badania genomiczne omówione powyżej, ale obecnie dostępna jest ograniczona liczba opcji. Jeden z takich modeli, który generuje histologicznie podobne glejaki pnia mózgu o wysokim stopniu złośliwości, wykorzystuje wirusowy system RCAS/tv-a do napędzania nadekspresji PDGF-B i utraty Ink4a-ARF w komórkach gniazdynowo-dodatnich w tylnym dole noworodków5,16. Inne podejście polega na rekapitulacji kilku głównych mutacji związanych z DIPG (mutacja histonu H3.3 K27M, utrata p53 i aktywacja PDGFRA) w nerwowych komórkach prekursorowych pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, co jest wystarczające do uczynienia tych komórek rakotwórczymi6,7,17. Połączenie metod genetycznych i modeli pochodzących od pacjentów umożliwi przeprowadzanie badań przedklinicznych i dalszy rozwój skutecznych terapii.

Aby sprostać wyzwaniom związanym z badaniami DIPG opisanym powyżej, ten protokół szybkiej autopsji został opracowany w celu generowania kultur komórkowych pochodzących od pacjentów do badania8,9,10,11,12,14. Protokół ma na celu ochronę żywotności tkanki i maksymalizację prawdopodobieństwa wytworzenia trwałych kultur pomimo wyzwań związanych z wydłużonymi odstępami między sekcjami pośmiertnymi i czasem transportu. Po pomyślnym wygenerowaniu, te hodowle DIPG mogą być wykorzystane w kolejnych manipulacjach in vitro i eksperymentach ksenoprzeszczepów in vivo, co pozwoli na ocenę potencjalnych cząsteczek terapeutycznych na komórkach pobranych od pacjenta.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został przeprowadzony za zgodą naszej instytucjonalnej komisji rewizyjnej z odpowiednią deidentyfikacją wszystkich danych pacjenta i zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobra człowieka. Uzyskaj odpowiednią zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej i świadomą zgodę rodziny pacjenta przed rozpoczęciem pracy z tym protokołem.

1. Pobieranie próbek tkanek

UWAGA: Krytyczny element tego protokołu wymaga właściwego postępowania z pobraniem tkanki, począwszy od razu po autopsji. Ogólna żywotność próbki zależy w znacznym stopniu od zminimalizowania interwału pośmiertnego (PMI), natychmiastowego przeniesienia tkanki do odpowiedniego zimnego podłoża uzupełnionego antybiotykami/środkami przeciwgrzybiczymi, utrzymywania próbki na mokrym lodzie przez cały transport i utrzymania sterylnej techniki przez cały protokół.

  1. Po otrzymaniu powiadomienia o zbliżającej się dawce przygotuj zestaw do pobierania próbek. Korzystając z pudełka transportowego z izolowanym pojemnikiem, który może być bezpośrednio użyty do transportu zwrotnego próbki tkanki, dołącz następujące materiały:
    1. Dołącz materiały do sterylnego przygotowania, w tym sterylne rękawiczki, serwety i skalpele.
    2. Dołącz 8 - 10 sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml zawierających 30 ml pożywki transportowej w izolowanym pojemniku z lodem lub zimnymi wkładami.
      UWAGA: Chociaż każda standardowa pożywka do hodowli komórkowych może działać, najlepszą żywotność próbki uzyskuje się za pomocą Hibernate-A uzupełnionego antybiotykiem/antybiotykiem.
    3. Dołączyć wszelkie dalsze probówki z próbkami do innych analiz (np. utrwalaczy).
    4. Jeśli sekcja zwłok nie zostanie przeprowadzona na miejscu badacza, dołącz dokument, który jasno określa, jak pobrać próbkę guza. Obejmuje to takie szczegóły, jak utrzymanie sterylności, trzymanie probówek z próbkami na mokrym lodzie oraz dołączanie próbek ze śródmózgowia i rdzenia, ponieważ komórki nowotworowe często atakują te obszary.
  2. Zachowaj sterylność podczas autopsji. Weź pod uwagę, że mózg jest sterylny wewnątrz czaszki, więc obserwuj sterylną technikę (w tym zmianę rękawiczek), gdy czaszka jest otwarta. Unikanie zanieczyszczenia skóry i włosów ma kluczowe znaczenie.
  3. Wypreparuj guz od strony brzusznej ("brzuch" mostu, patrz rysunek uzupełniający 1). Za pomocą sterylnego skalpela odetnij małe 1 cm kawałki guza i natychmiast przenieś do zimnego podłoża transportowego (patrz UWAGA w kroku 1.1.2) i połóż na mokrym lodzie. Umieść 10 ml tkanki w każdej probówce, uzyskując końcową objętość tkanki i pożywki w każdej probówce wynoszącą 40 ml.
    UWAGA: W przypadku DIPG guz dylanowo nacieka most i często resztę pnia mózgu. W związku z tym należy pobrać jak najwięcej próbki, zwykle w tym 3-4 probówki (30-40 ml tkanki) z mostu i 1-2 probówki (10-20 ml tkanki) każda ze śródmózgowia i rdzenia.
  4. Zbierz próbki ze śródmózgowia i rdzenia zestawione z mostem, który często zawiera wiele komórek nowotworowych.
  5. Po pobraniu próbki wyślij O/N na mokrym lodzie w izolowanym pojemniku. Nie wysyłaj próbki na suchym lodzie, ponieważ zamrożenie zabije komórki.

2. Przygotowanie do przetwarzania próbek

  1. Przed rozpoczęciem przygotowywania próbki sterylizuj kaptury do hodowli tkankowych wraz z żyletkami, zakrzywionymi hemostatykami i innymi niesterylnymi narzędziami w świetle UV przez 1 godzinę. Wykonaj wszystkie poniższe czynności w sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu kultur.
  2. Przygotować i sterylne roztwory filtracyjne.
    1. Aby przygotować 1,8 M roztwór sacharozy, rozpuść 308,07 g sacharozy w 300 ml wody destylowanej. Dodaj 50 ml 10x buforowany roztworem soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) bez wapnia i magnezu i zwiększ całkowitą objętość do 500 ml za pomocą wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Aby przygotować roztwór do wytrawiania enzymatycznego, należy pobrać 50 ml HBSS z wapniem i magnezem na każde 10 ml tkanki mielonej i dodać 500 μl 5 mg/ml deoksyrybonukleazy I (stężenie końcowe 50 μg/ml), 500 μl 2,5 mg/ml kolagenazy I/II i roztworu dyspazy (końcowe stężenie 25 μg/ml) oraz 500 μl 1 M buforu HEPES. Wstępnie podgrzej roztwór wytrawiający w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Aby przygotować podłoże z pnia nowotworu (TSM), wymieszaj 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco's Modified Eagle Media: Mieszanka składników odżywczych F12 (DMEM/F12), 5 ml 100x antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy, 5 ml 200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy (GlutaMAX-A), 5 ml buforu HEPES, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu i 5 ml 100x MEM aminokwasów endogennych.
    4. Aby przygotować kompletny TSM z czynnikami wzrostu, dodaj następujące suplementy do bazy TSM: 50x B27 Suplement Minus Witamina A (1:50), ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (H-EGF, 20 ng/ml), ludzki czynnik wzrostu fibroblastów (H-FGF, 20 ng/ml), ludzki płytkopochodny czynnik wzrostu AA (H-PDGF-AA, 10 ng/ml), ludzki czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego BB (H-PDGF-BB, 10 ng/ml) i roztwór heparyny (2 μg/ml).
  3. Schłodzenie wirówki laboratoryjnej wyposażonej w obracający się wirnik kubełkowy do temperatury 4 °C.

3. Dysocjacja mechaniczna

  1. Przenieść tkankę do wysokościennego naczynia do hodowli komórkowej o wymiarach 100 mm x 20 mm. Usuń pozostałą pożywkę z transportu i zastąp ją 10-15 ml zimnej pożywki hodowlanej.
  2. Używając zakrzywionych hemostatów do chwycenia żyletki, drobno zmiel tkankę, usuwając widoczne naczynia krwionośne lub opony mózgowe.
    UWAGA: Końcowe fragmenty tkanki powinny być mniejsze niż 1 mm (patrz rysunek 1B).
  3. Przenieś tkankę do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Umyj naczynie do hodowli komórkowych dodatkowym 5 ml zimnej pożywki hodowlanej i przenieś do stożkowej probówki. W razie potrzeby powtórz ten etap mycia, aby przenieść pozostałą tkankę.
  4. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie rozetrzeć (4 - 5 razy). Pozwól, aby większe fragmenty tkanki osiadły na dnie probówki. W razie potrzeby krótko odwirować próbkę przez 1 minutę (350 x g, 4 °C).
  5. Zbierz frakcję mechanicznie zdysocjowaną.
    1. Usunąć supernatant i przefiltrować go przez filtr 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z napisem "Dysocjacja mechaniczna". Odwróć filtr nad oryginalną stożkową probówką i przemyj pożywką hodowlaną w celu odzyskania fragmentów tkanki.
    2. Odwirować frakcję "dysocjacji mechanicznej" przez 5 minut (350 x g, 4 °C).
    3. Usunąć supernatant z granulowanej frakcji "dysocjacji mechanicznej" i ponownie zawiesić tkankę w zimnej pożywce hodowlanej. Jeśli w stożkowej probówce "Dysocjacja mechaniczna" znajduje się więcej niż 5 ml tkanki, podziel tkankę na inne stożkowe probówki o pojemności 50 ml tak, aby żadna probówka nie zawierała więcej niż 5 ml tkanki.
  6. Mechanicznie zdysocjowaną frakcję przechowywać na lodzie do momentu etapu wirowania w gradiacji sacharozy (etap 5). Alternatywnie, frakcja zdysocjowana mechanicznie może przejść do etapu 5 podczas okresu inkubacji dysocjacji enzymatycznej (etap 4.4).

4. Dysocjacja enzymatyczna

  1. Jeśli w probówce zawierającej pozostałe większe fragmenty tkanki znajduje się więcej niż 5 ml tkanki, należy podzielić tkankę na inne nowe stożkowe probówki o pojemności 50 ml tak, aby żadna probówka nie zawierała więcej niż 5 ml tkanki.
  2. Odwirować stożkową probówkę (stożki) zawierającą pozostałe fragmenty tkanek przez 5 minut (350 x g, 4 °C).
  3. Usunąć supernatant i dodać wstępnie podgrzany roztwór do wytrawiania enzymatycznego, tak aby na każdy 1 ml tkanki przypadało 5 ml roztworu wytrawiającego (np. 25 ml roztworu do wytrawiania na 5 ml tkanki).
  4. Uszczelnić stożkowe pokrywki probówek folią laboratoryjną i inkubować reakcję na rotatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Po inkubacji próbki należy delikatnie rozcierać (zob. rysunek 1C).
    1. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml pipetować próbkę w górę i w dół 6 - 8 razy. Unikaj generowania nadmiernej ilości pęcherzyków powietrza.
    2. Dodać końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl na koniec pipety i rozcierać dodatkowe 6-8 razy.
    3. Pozwól, aby pozostałe kawałki osiadły na dnie tuby. Usunąć i przefiltrować supernatant z komórkami nadal zawieszonymi w filtrze 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z napisem "Dysocjacja enzymatyczna" i przechowywać na lodzie.
    4. Jeśli pozostaną znaczne fragmenty tkanki, dodać do nich dodatkowe 10 ml HBSS z wapniem i magnezem i powtórzyć kroki 3.5.1 i 3.5.2. Przefiltrować ten końcowy roztwór przez filtr 100 μm do probówki "dysocjacja enzymatyczna".
  6. Odwirować probówkę "dysocjacja enzymatyczna" przez 5 minut (350 x g, 4 °C) i kontynuować wirowanie w gradiacji sacharozy.

5. Wirowanie w gradinie sacharozy

  1. Jeżeli próbki są nadal zawieszone w roztworze, odwirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).
  2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić tkankę w 20 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Zwiększyć objętość do 25 ml za pomocą zimnego HBSS.
  3. Powoli dodać 25 ml 1,8 M roztworu sacharozy i odwrócić probówkę, aby wymieszać. Daje to gradient sacharozy 0,9 M.
  4. Wirówka bez hamulca przez 10 min (800 x g, 4 °C). Użycie hamulca wirowania spowoduje zakłócenie gradientu i zmniejszenie wydajności (patrz rysunek 1D dla przykładu próbki przed i po odwirowaniu).
  5. Ostrożnie odessać resztki mieliny i jak najwięcej roztworu sacharozy. Przemyć próbkę, dodając 30 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu i delikatnie mieszając. Wirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).

6. ACK Deliza czerwonych krwinek

  1. Usunąć supernatant z przemywania płucz. Dodać 5 ml buforu do lizy ACK i delikatnie zawiesić osad komórkowy, obracając probówkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  2. Ugasić lizę, dodając 30 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu.
  3. Wirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).

7. Początkowe utrzymanie kultury

  1. Zawiesić końcowe granulki komórek w 10 - 15 ml ciepłym, kompletnym TSM z czynnikami wzrostu i określić ilościowo gęstość żywotnych komórek na hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego.
    UWAGA: Zakres żywotnych komórek różni się znacznie w zależności od okoliczności dawstwa tkanki, a kwantyfikacja może być trudna na tym wczesnym etapie ze względu na resztki resztek komórkowych. W idealnym przypadku należy dążyć do tego, aby na próbkę przypadało milion żywych komórek. W przypadkach, gdy pozostaje nadmierna ilość zanieczyszczeń, rozpylić płytkę o mniejszej gęstości w kolbie T175.
  2. Przenieść końcowe zawiesiny komórek do nowej kolby hodowlanej T75. Zwiększ dodatkowe czynniki wzrostu co drugi dzień, aby utrzymać ogólny poziom czynnika wzrostu i monitorować rozwój neurosfer komórek nowotworowych (patrz Rysunek 1E i Rysunek 2).
  3. Alternatywnie, przetwarzaj enzymatycznie zdysocjowane komórki do dalszej analizy, w tym cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją.
  4. Po rozwinięciu się neurosfer (co średnio trwa 3-4 tygodnie, ale waha się od kilku dni do nawet 2 miesięcy), należy odwrócić filtr próbki za pomocą nylonowego filtra siatkowego o grubości 100 μm, aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń.
    UWAGA: Przesącz powinien być utrzymywany w hodowli na wypadek, gdyby obecne były żywe pojedyncze komórki lub małe kulki.
  5. Zapewnić integralność i czystość hodowli, wykonując odciski palców DNA podczas pasażu, w porównaniu z początkową próbką pacjenta.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół jest podsumowany jako pięcioetapowy przepływ pracy z obrazami tkanki na różnych etapach przetwarzania na rysunku 1. Próbka jest najpierw pobierana w drodze szybkiej sterylnej autopsji. Podczas dysocjacji mechanicznej tkanka jest mielona podczas usuwania naczyń krwionośnych i opon mózgowych z próbki i filtrowana przez nylonowy filtr siatkowy o grubości 100 μm. Pozostałe fragmenty tkanek są enzymatycznie dysocjowane w rozgrzewającym piecu. Następnie zanieczyszczenia są redukowane przez wirowanie w gradiencie sacharozy, izolując wyraźną warstwę mieliny od próbki. Ponadto liza ACK widocznie zmniejsza ilość czerwonych krwinek obecnych w próbce. Na koniec komórki są siane w pożywce bez surowicy uzupełnionej czynnikami wzrostu.

Rysunek uzupełniający 1 to przykład guza podczas autopsji. Guz rośnie jako rozlana infiltracja mostu i przyległych obszarów pnia mózgu. Podczas przygotowywania próbek, małe kawałki o wymiarach ~1 cm x 1 cm należy pokroić i natychmiast umieścić w chłodnym podłożu transportowym na lodzie.

Rysunek 2 pokazuje różne przykłady tego, jak próbki mogą wyglądać od wczesnych etapów hodowli do trwałej kultury. Początkowo posiane i wczesne hodowle (A, B) często wydają się nie zawierać wielu ocalałych komórek. Co więcej, wczesne skupiska komórek (C, D) często nie wykazują stopnia kontrastu typowego dla neurosfer. Warto zauważyć, że czas w hodowli przed pojawieniem się klastrów komórek może trwać od tygodni do kilku miesięcy. Jednak początkowe przejście tych skupisk komórkowych, w połączeniu z odwrotnym filtrowaniem klastrów komórkowych, może wyizolować zdrowe komórki nowotworowe, które są w stanie tworzyć kule (F). Przesącz (E) zazwyczaj zawiera resztki zanieczyszczeń; Zalecamy jednak posiewanie i konserwację filtratu oraz monitorowanie rozwoju klastrów komórkowych. Te próbki pobrane od pacjenta mogą być następnie utrzymywane w kulturze przez wiele pasaży (G, H).

Rysunek 3 pokazuje zdolność tych komórek do ksenoprzeszczepowania myszy. W każdym z tych przypadków komórki DIPG transfekowano reporterem GFP-lucyferazy w celu monitorowania rozwoju guzów poprzez bioluminescencję (A). Guzy można również badać histologicznie, na przykład w celu obserwacji wszczepienia guza (B) lub ekspresji określonych markerów (C). Te modele in vivo, w połączeniu z testami in vitro, mogą być używane do oceny skutków różnych leków lub manipulacji genami (np. 8,9,10,11,14).

figure-results-1
Rysunek 1. Próbki tkanek na różnych etapach przetwarzania. (A) Pobrać próbkę za pomocą sterylnych procedur autopsyjnych i nocnej wysyłki na mokrym lodzie. (B) Od lewej do prawej: (rząd 1) probówki zawierające tkankę nowotworową w pożywce transportowej; świeże tkanki w naczyniu do hodowli komórkowej o wymiarach 100 mm x 20 mm; wstępne mielenie tkanki; (rząd 2) częściowo rozdrobniona tkanka; usunięcie opon mózgowych i naczyń krwionośnych; ostateczny rozmiar kawałków tkanki mielonej. C) Od lewej do prawej: (rząd 1) tkanka inkubowana na stole obrotowym w piecu o temperaturze 37 °C; (rząd 2) rozcieranie tkanki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 μl przymocowanej do pipety o pojemności 10 ml; Filtracja zdysocjowanej tkanki przez nylonowy filtr siatkowy o grubości 100 μm. (D) Od lewej do prawej: zdysocjowana tkanka zawieszona w 0,9 M roztworze sacharozy przed odwirowaniem; zdysocjowana tkanka oddzielona w poprzek gradientu sacharozy po odwirowaniu; widoczna warstwa resztek mieliny na szczycie gradientu sacharozy; końcowy osad komórkowy po lizie i umyciu ACK. (E) Próbka końcowa może być umieszczona w hodowli lub wykorzystana w innych dalszych analizach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Obrazy kultur pierwotnych i komórek wczesnego pasażu. (A - B) Kultury posiane natychmiast po dysocjacji (SU-DIPG-XXX, A), lub które nie wyrosły jeszcze neurosfery (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) Wczesne pojawienie się neurosfer w pierwotnych kulturach SU-DIPG-XXVIII (C) i SU-DIPG-XXIX (d). (E-F) Pierwsze przejście kultury pierwotnej z D przy użyciu filtra nylonowego o grubości 100 μm, z filtratem (E) i filtratem odwróconym (F) pokrytym powłoką. (G - H) Dojrzałe neurosfery z pierwszego przejścia SU-DIPG-XXVII (G) i trzeciego pasażu SU-DIPG-XXV (H) rosnące w kulturze. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Hodowle komórkowe pochodzące od pacjentów mogą wszczepiać się i tworzyć guzy u myszy. (A) Obrazy bioluminescencyjne czterech różnych kultur komórkowych pochodzących od pacjentów transfekowanych reporterem GFP-lucyferazy. (B) Przekrój strzałkowy z ksenoprzeszczepu myszy, pokazujący komórki nowotworowe wszczepione w moście myszy. Zielony: GFP, Czerwony: podstawowe białko mielinowe. Podziałka = 1 mm. (C) Przykładowy obraz immunofluorescencyjny przedstawiający komórki nowotworowe GFP wszczepione do mózgu myszy. Niebieski: DAPI, Zielony: GFP, Czerwony: IGF2R. Podziałka = 40 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1. Próbka z autopsji guza Pontine. Natychmiastowe pośmiertne pojawienie się rozlanego glejaka mostu. Guz pojawia się jako duża, bogata w mielinę masa na brzusznej powierzchni mostu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten obraz.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnych dawców tkanek nowotworowych w celu opracowania kultur komórkowych pochodzących od pacjentów, które mogą być wykorzystane w różnych eksperymentach in vitro lub in vivo . Ze względu na charakter pracy z próbkami z autopsji, utrzymanie ich żywotności stanowi poważne wyzwanie. Kilka czynników przyczyniających się do tego, w tym odstęp między sekcją zwłok do autopsji lub czas potrzebny na transport tkanki, powinno być zminimalizowanych w jak największym stopniu, ale często są one trudne do kontrolowania. Z naszego doświadczenia wynika, że interwał pośmiertny krótszy niż 6-8 godzin (od momentu śmierci do momentu, gdy tkanka jest umieszczana w lodowatych podłożach do wysyłki i transportu) dał największą szansę na ustanowienie trwałej hodowli komórkowej. Najlepiej jest następnie otrzymać tkankę w laboratorium w ciągu 24 godzin i przetworzyć ją do hodowli natychmiast po otrzymaniu.

Ponieważ lokalizacja tych rzadkich przypadków jest bardzo zróżnicowana, a jakość etapu pobierania tkanek silnie wpływa na szansę powodzenia, logistyka przeprowadzenia autopsji może być wyzwaniem. W wielu przypadkach, aby osiągnąć 6-8 godzinne ramy czasowe, nie jest możliwe przeprowadzenie pobrania tkanek w ośrodku akademickim. Zamiast tego, posiadanie usługi odzyskiwania tkanek na wezwanie w celu odzyskania tkanki nowotworowej w domu pogrzebowym zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB jest często bardziej celowe dla odzyskania tkanek. Uzyskanie świadomej zgody przed śmiercią jest zalecane i ułatwia planowanie logistyczne. Zdecydowanie zaleca się przygotowanie samodzielnych zestawów do autopsji z jasnymi i dokładnymi instrukcjami oraz sterylnymi materiałami do pobierania tkanek (rękawice, serwety, skalpele). Ponadto kluczowe znaczenie ma ustanowienie jasnych punktów komunikacji między badaczem, patologiem i domem pogrzebowym. Na przykład badacz powinien omówić protokół z patologiem przed sekcją zwłok i zwrócić uwagę na typowe błędy. Błędy te obejmują zanieczyszczenie mikrobiologiczne (zwykle drożdże) podczas pobierania tkanek, brak wysyłki nocnej/przyspieszonej oraz niewysyłkę próbki na wystarczającej ilości mokrego lodu w termoizolowanym pojemniku. Na koniec zalecamy skorzystanie z usługi kurierskiej "od drzwi do drzwi" do wysyłki próbki, aby zminimalizować czas transportu.

Należy również zachować ostrożność podczas dysocjacji tkanek, aby zachować żywotność komórek. Na przykład zastosowanie pożywek zaprojektowanych w celu zachowania zdrowia tkanek nerwowych do transportu (Hibernate-A uzupełniony antybiotykiem/antybiotykiem) zwiększy szansę na uzyskanie udanej hodowli. Ważne jest również, aby utrzymywać próbkę w niskiej temperaturze przez cały czas trwania protokołu, zawsze przenosząc próbki na lodzie. Zbieranie zarówno mechanicznych, jak i enzymatycznych frakcji dysocjacyjnych wraz z minimalizacją trituracji może poprawić skuteczność protokołu, ponieważ oba etapy są traumatyczne dla komórek. Z naszego doświadczenia wynika, że podczas gdy większość udanych kultur wyrasta z obu frakcji, mieliśmy przypadki, w których tylko jeden z dwóch preparatów stworzył trwałą kulturę, potencjalnie odzwierciedlającą delikatną naturę tych próbek. Kolejnym traumatycznym krokiem w protokole jest utarcie; Jedną ze strategii, która może zmniejszyć niezbędny stopień roztarcia, jest upewnienie się, że próbki są dokładnie rozdrobnione na samym początku przygotowania. Inne przykłady aspektów protokołu mających na celu poprawę żywotności próbki obejmują dodawanie (np . HEPES) w całym protokole, co jest szczególnie ważne podczas dysocjacji enzymatycznej.

Możliwą modyfikacją tego protokołu w celu dalszego zwiększenia żywotności komórek jest usunięcie etapu lizy czerwonych krwinek ACK. Jednak w tym przypadku często konieczne jest wykonanie etapu lizy ACK w pierwszym tygodniu hodowli w celu usunięcia czerwonych krwinek. Innym aspektem tego protokołu, który może być modyfikowany, jest eliminacja mieliny i resztek komórkowych za pomocą gradientu gęstości sacharozy. W szczególności na tym etapie możliwe są również inne strategie, które zostały zgłoszone w celu poprawy żywotności komórek mikrogleju, takie jak nieciągły gradient gęstości Percoll18 lub magnetyczne kulki do usuwania mieliny.

Wreszcie, czas między początkową dysocjacją tkanek a pojawieniem się neurosfer różni się w zależności od próbki i może trwać od tygodnia do miesiąca lub dłużej. Ponieważ początkowe hodowle zazwyczaj zawierają znaczny stopień martwych komórek i resztek komórkowych, ustalenie, czy żywe komórki pozostają, może być trudne; kultura powinna być utrzymywana przez co najmniej 4 - 8 tygodni (ryc. 2). Przedstawiono tutaj jedną ze strategii izolowania rosnących komórek od pozostałych szczątków (tj. odwrotne filtrowanie klastrów komórek i ponowne powlekanie w świeżych pożywkach). Decyzja o tym, czy kontynuować utrzymywanie posiewu, jest ostatecznie decyzją indywidualną w każdym przypadku opartą na czynnikach otaczających autopsję (np. przedłużony okres pośmiertny, problemy podczas transportu tkanki), dysocjacji tkanek (np. nadmierna ilość krwi lub szczątków) oraz tym, jak próbka pojawia się w hodowli. Po ustaleniu posiewu tożsamość powinna zostać zweryfikowana za pomocą odcisków palców DNA przy użyciu krótkiej analizy powtórzeń tandemowych lub podobnej metody, porównując hodowlę z próbką pierwotnego guza zachowaną w tym celu. Zalecamy rutynową walidację kultur za pomocą odcisków palców DNA, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia innymi kulturami, na przykład co 3-6 miesięcy.

Stworzenie tych kultur DIPG pochodzących od pacjentów stanowi ważny krok w pomyślnym rozwoju skutecznych terapii. Rozszerzenie dostępnych kultur DIPG i modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów będzie miało kluczowe znaczenie dla określenia najskuteczniejszych strategii terapeutycznych i ostatecznego przezwyciężenia tej wyniszczającej choroby.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Fundacji McKenna Claire, Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS K08NS070926 i R01NS092597), Departamentu Obrony (NF140075), Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (CIRM RB4-06093 i RN3-06510), Fundacji Alex's Lemonade Stand, Fundacji The Cure Starts Now i DIPG Collaborative, Fundacji Lyla Nsouli, Unravel Pediatric Cancer, Childhood Brain Tumor Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Godfrey Family Fund in Memorial of Fiona Penelope, Wayland Villars DIPG Foundation, Dylan Jewett, Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen i Jennifer Kranz Memorial Funds, N8 Foundation, Virginia and D.K. Ludwig Fund for Cancer Research, Child Health Research Institute w Stanford Anne T. and Robert M. Bass Endowed Faculty Scholarship in Pediatric Cancer and Blood Diseases.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hibernate-AGibcoA12475-01
HBSS z wapniem/magnezemGibco24020-117
HBSSCorning21-022-CV
HEPESGibco15630-080
Liberase DH (kolagenaza / dispaza)Roche5401054001
DNAse IWorthingtonBiochemical LS002007
SacharozaSigmaS0389
Antybiotyk/Antybiotyk GrzybiczeGibco15240-096
Neurobasal-AGibco10888-022
DMEM/F12Gibco11330-032
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050-061
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco11360-070
B27 Suplement minus witamina AGibco12587-010
MEM Aminokwasy endogenne (100x)Gibco11140-050
Ludzki PDGF-AAShenandoah Biotechnologia100-16
Ludzki PDGF-BBShenandoah Biotechnologia100-18
Ludzki EGFShenandoah Biotechnologia100-26
Ludzki FGFShenandoah Biotechnology100-146
Sterylne ostrza skalpelaBard Paker372610
Zakrzywione hemostatykiFine Science Tools13013-14
ŻyletkiVWR55411-050
Naczynie do hodowli komórkowych 100 x 20 mmCorning353003
Sterylne kleszczeTWD TradewindsDF8988-5
Sterylne serwety3M2037
Sterylnerękawiczki Kimberly Clark1182307
ACK Lysis BufferGibcoA1049201
100 mikronowy filtr siatkowyFisher352360
50 ml rurka stożkowaFisher1495949A

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).">Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
  2. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).">Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
  3. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).">Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
  4. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).">Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
  5. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).">Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
  6. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).">Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
  7. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).">Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
  8. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).">Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
  9. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).">Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
  10. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).">Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
  11. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).">Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
  12. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).">Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
  13. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).">Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
  14. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).">Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
  15. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).">Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
  16. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).">Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
  17. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).">Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
  18. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).">Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Diffuse Intrinsic Pontine GliomaPost mortem Cell CulturePatient derived Cell CultureMechanical DissociationEnzymatic DissociationSucrose Gradient CentrifugationFluorescence activated Cell SortingOrthotopic XenograftingDrug ScreeningTumor Neurospheres

Powiązane artykuły