Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Streszczenie

Mikroglej jest główną reakcją na uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego; jednak wiele pozostaje niewiadomych na temat ich roli w regulacji zapalenia nerwów. Mikroglej to komórki mezodermalne, które działają podobnie do makrofagów w badaniu stresu zapalnego. Klasyczna (typ M1) i alternatywna (typ M2) aktywacja makrofagów została również rozszerzona na mikroglej w celu lepszego zrozumienia podstawowej interakcji tych fenotypów w stanach neurozapalnych, takich jak choroba Parkinsona, Alzheimera i Huntingtona. Eksperymenty in vitro z wykorzystaniem pierwotnego mikrogleju oferują szybkie i wiarygodne wyniki, które można rozszerzyć na środowisko in vivo. Chociaż jest to wyraźna przewaga nad eksperymentami in vivo, wyizolowanie mikrogleju przy jednoczesnym osiągnięciu odpowiednich plonów o optymalnej czystości było wyzwaniem. Powszechnie stosowane obecnie metody mają albo niski odzysk, albo niską czystość, albo jedno i drugie. W niniejszym artykule demonstrujemy udoskonalenie metody separacji magnetycznej CD11b bez kolumn, która zapewnia wysoki odzysk komórek i zwiększoną czystość w o połowę krótszym czasie. Proponujemy tę zoptymalizowaną metodę jako wysoce użyteczny model pierwotnej izolacji mikrogleju w celu badania zapalenia nerwów i neurodegeneracji.

Wprowadzenie

Microglej to niezależne od Myb makrofagi pochodzenia mezodermalnego, które odróżniają się od progenitorów erytromieloidalnych c-kit+/CD45- w wyspach krwi woreczka żółtkowego^1,2. Gdy mikroglej embrionalny skolonizuje ośrodkowy układ nerwowy (OUN), przechodzi z formy ameboidalnej do rozgałęzionej ³. Te dorosłe mikroglej są klasyfikowane jako inwigilowane, ponieważ ich dynamiczne rozgałęzienia badają zdrowy miąższ mózgu pod kątem potencjalnych zniewag⁴. Chociaż mikroglej przyczynia się tylko do około 10% populacji komórek OUN, ich zdolność do układania się między sobą zapewnia maksymalne skanowanie miąższu ^4,5. Wzorce molekularne związane z niebezpieczeństwem (DAMP), takie jak α-synukleina^6,7 i amyloid-β⁸, lub wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), takie jak lipopolisacharyd (LPS)⁹, klasycznie aktywują mikroglej w celu promowania odpowiedzi zapalnej charakteryzującej się powrotem do ameboidalnego stanu aktywnego i wytwarzaniem tlenku azotu, czynnika martwicy nowotworu-α (TNFα), interleukina 1β (IL-1β), IL-6, IL-12 i ligand motywu chemokiny C-C 2^9,10,11. W stanach neurozapalnych, takich jak choroba Parkinsona, w których nagromadziła się patogenna α-synukleina, cykl neurodegeneracyjny powstaje w wyniku śmierci neuronów dopaminergicznych, które uwalniają więcej zagregowanej α-synukleiny, co dodatkowo sprzyja klasycznej aktywacji mikrogleju⁷. Podobnie jak makrofagi obwodowe, mikroglej może również mieć zdolność do alternatywnej aktywacji w obecności cytokin przeciwzapalnych IL-4 i IL-10, co daje im potencjał do wspomagania naprawy neuronów i łagodzenia stanu zapalnego^2,11. Oprócz ich ról immunologicznych w OUN, mikroglej został opisany jako ważny regulator obwodów neuronalnych poprzez przycinanie synaps podczas rozwoju. Na przykład myszy Cx3cr1-KO mają mniej gęsty mikroglej i zmniejszone przycinanie synaptyczne, co prowadzi do nadmiaru kolców dendrytycznych, niedojrzałych synaps i wzorców elektrofizjologicznych słabo rozwiniętej klasy CNS¹². Zrozumienie tych fizjologicznych zawiłości i różnorodnych funkcjonalnych ról mikrogleju w homeostazie OUN ma kluczowe znaczenie dla poszukiwania terapii ukierunkowanych na zaburzenia neurodegeneracyjne.

W dziedzinie neuroimmunologii, eksperymenty in vitro są wysoce pożądane ze względu na większą wykonalność badań mechanistycznych, niższe koszty utrzymania oraz mniejszą czaso- i pracochłonność. Co więcej, zdolność do izolowania populacji komórek ma kluczowe znaczenie dla określenia funkcjonalności tych komórek docelowych w określonych warunkach. Istnieje wiele metod izolacji mikrogleju, ale są one ograniczone przez ich zdolność do uzyskiwania stosunkowo dużej liczby i czystości do szerokich eksperymentów^13,14,15. Na przykład klaster różnicowania 11b (CD11b) jest wspólnym markerem powierzchniowym monocytów, makrofagów i mikrogleju¹⁶. Wykorzystując CD11b, metoda separacji magnetycznej została po raz pierwszy opisana jako podejście oparte na kolumnach, które dało ~99,5% czystości i ~1,6 x 10⁶ mikrogleju na mózg noworodka17. Nasze laboratorium niedawno opracowało metodę separacji magnetycznej CD11b bez kolumny¹⁵, którą przeprowadziliśmy w probówce polistyrenowej, oznaczając CD11b przeciwciałem monoklonalnym sprzężonym z fikoerytryną (PE). Bispecyficzne przeciwciało drugorzędowe przeciwko kompleksom PE i dekstranu z PE. Po związaniu wprowadzane są cząstki magnetyczne pokryte dekstranem, które wiążą się z końcem dekstranowym kompleksu przeciwciał. Na koniec rurkę polistyrenową umieszcza się w magnesie w celu izolacji mikrogleju. Podejście to podwoiło wydajność do ~3,2 x 10⁶ mikrogleju na mózg noworodka, ale kosztem zmniejszenia czystości do ~97%.

Tutaj demonstrujemy szybki i wyrafinowany protokół separacji magnetycznej CD11b bez kolumn (Rysunek 1). Ta ulepszona metoda pozostaje tak samo wykonalna, jak nasza oryginalna metoda bez kolumny, ponieważ cena zestawu do separacji magnetycznej CD11b jest taka sama. Czas ukończenia skraca się o połowę, co może mieć kluczowe znaczenie dla maksymalizacji przeżywalności i wydajności komórek. Warto zauważyć, że czystość osiągnięta dzięki tej zoptymalizowanej metodzie wynosi ~>99%, co stanowi wyraźną poprawę w stosunku do czystości osiągniętej przy użyciu oryginalnej metody bez kolumn opracowanej przez nasze laboratorium¹⁵. Co najważniejsze, CD11b-PE nie jest wykorzystywany, co eliminuje potrzebę inkubacji z dala od światła i umożliwia wykorzystanie kanału czerwonego do mikroskopii fluorescencyjnej. Wreszcie, podobnie jak w oryginalnej metodzie CD11b, za pomocą tej ulepszonej metody uzyskuje się frakcję astrocytową o wysokiej wydajności i czystości. Astrocyty są najliczniejszymi komórkami glejowymi w OUN, co prowadzi do wniosku, że ich funkcje homeostatyczne są niezbędne w odniesieniu do patofizjologii¹⁸. Te komórki glejowe odgrywają rolę w różnych funkcjach fizjologicznych, takich jak tworzenie bariery krew-mózg, dostarczanie składników odżywczych, utrzymywanie homeostazy neuroprzekaźników, tworzenie blizn glejowych w odpowiedzi na uraz, neuroprotekcja, uczenie się i pamięć oraz zapalenie nerwów, co ilustruje ich potencjał badawczy w biologii gleju¹⁹. Morfologię i funkcjonalność mikrogleju i astrocytów ustalono za pomocą mikroskopii konfokalnej, Western blot, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), testu azotynów Griessa i testu cytokin Luminex multiplex. Udoskonalenie zapewnione przez ten protokół daje większą pewność co do czystości mikrogleju lub astrocytów, szersze zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej z dostępnością kanału czerwonego oraz oszczędność czasu, co jest ważne dla eksperymentów in vitro.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt i procedury protokolarne zostały zatwierdzone i nadzorowane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Iowa (Ames, IA, USA)

1. Uprawa mieszanych kultur glejowych

1. Szybko odetnij głowę 1-2 jednodniowym szczeniętom za pomocą 5,5-calowych nożyczek operacyjnych i natychmiast umieść głowy w probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Zauważmy, że ta dekapitacja jest sposobem eutanazji.
2. W kapturze z laminarnym przepływem powietrza wykonaj małe nacięcie w czaszce i oponach mózgowych za pomocą 4.5-calowych prostych nożyczek do mikropreparowania. Rozpocznij cięcie od końca ogonowego do końca rostralnego (nosa). Dostań się pod skórę, korzystając z otworu utworzonego przez dekapitację.
   1. Po nacięciu oderwij jedną z półkul na bok. Następnie użyj pęsety zakrzywionej lub haczykowatej, aby usunąć cały mózg.
3. Zanurz mózg (mózgi) w nowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 0,25% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctan (EDTA) na 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Użyj 2 ml trypsyny-EDTA na mózg.
4. Umyj mózg (mózgi) świeżymi pożywkami wzrostowymi (10% FBS, DMEM/F12, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu i 1% aminokwasów endogennych), dodając i usuwając pożywkę. Powtórz to 4 razy.
5. Dla każdego mózgu umieść na płytce dwie kolby T-75 zawierające pożywkę wzrostową. Dlatego dodaj do probówki 2 ml pożywki wzrostowej na mózg. Zatem będzie to odpowiednik 1 ml homogenizowanego mózgu z 8-9 ml pożywki wzrostowej na kolbę T-75.
6. Homogenizuj poprzez rozcieranie mózgu (mózgów) pipetami o różnych rozmiarach apertury, w kolejności od największego do najmniejszego. Kiedy widać, że tkanka mózgowa nie zmniejsza się, przejdź do następnej pipety. Pod koniec rozcierania zawiesina powinna być przezroczysta, bez widocznych fragmentów.
   1. Użyj kolejno pipety o pojemności 25 ml, pipety o pojemności 5 ml, a następnie pipety o pojemności 10 ml.
7. Przepuść każdą jednorodną zawiesinę mózgu przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm, aby przekształcić ją w pojedynczą hodowlę komórkową.
8. Dla każdego homogenizowanego mózgu należy umieścić na płytce dwie kolby T-75 zawierające pożywkę wzrostową, jak opisano w kroku 1.5 (1 ml homogenizowanego mózgu z 8-9 ml pożywki wzrostowej na kolbę T-75).
9. Zmień pożywkę wzrostową po 6 dniach i rosnąć do izolacji 16 dnia.

2. Izolacja komórek mikrogleju

1. Po 16 dniach wyjąć pożywkę wzrostową z kolby i umieścić ją w świeżej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA do każdej kolby T-75. Potrząsać kolbami przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.
   1. Odwirować usuniętą pożywkę wzrostową o masie 0,4 x g przez 5 minut i użyć do zatrzymania reakcji trypsyna-EDTA w następnym etapie.
2. Po wytrząsaniu przez 5 minut, dodać co najmniej 4 ml pożywki wzrostowej (świeżej lub użytej pożywki z 2.1.1), aby zatrzymać reakcję trypsyna-EDTA.
3. Wykonaj trituration, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały odłączone.
4. Po roztarciu przepuść komórki przez sitko o wielkości 70 μm, aby przekształcić je w pojedynczą hodowlę komórkową, wykonaj zliczanie komórek, a następnie wiruj komórki w temperaturze 0,4 x g przez 5 minut.
5. Na każde 100 x 10⁶ komórek (około 15 x kolby T-75) użyj 1 ml zalecanej pożywki (2% FBS, DPBS (bez chlorku wapnia i magnezu), 1 mM EDTA) do ponownego zawieszenia osadu komórkowego.
   UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są dostosowane do separacji 1 ml.
6. Weź probówkę z polistyrenu o pojemności 5 ml, dodaj 1 ml zalecanej pożywki i zaznacz menisk. Dodaj zalecane podłoże o pojemności do 2,5 ml i również to oznacz. Wyrzuć zalecane podłoże i przenieś ponownie zawieszone komórki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml.
7. Dodać 50 μl surowicy szczurzej na każdy 1 ml zawieszonych komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Przygotuj koktajl selekcyjny, mieszając 25 μl składnika A i 25 μl składnika B. Te komponenty są zastrzeżone.
9. Dodaj 50 μl koktajlu selekcyjnego do komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
   UWAGA: W przypadku czystszych kultur powtórz krok 2.9 (zalecany, ale nie obowiązkowy).
10. Wiruj mikrosfery przez 45 s. Dodaj 80 μl mikrosfer na 1 ml próbki. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
11. Doprowadzić objętość do 2,5 ml w probówce polistyrenowej, dodając zalecane podłoże.
12. Umieść rurkę w magnesie na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Dostosuj inkubację, aby zwiększyć czystość. Powoli wylej zalecane podłoże do probówki o pojemności 15 ml z magnesem nadal w probówce z polistyrenu.
13. Powtórz krok 2.12 jeszcze trzy razy. W celu zwiększenia czystości można przeprowadzić dodatkowe inkubacje magnetyczne.
14. Dodaj 3 ml pożywki wzrostowej i policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
15. Komórki płytkowe odpowiednio w płytkach pokrytych poli-D-lizyną (PDL) do zabiegów. Traktować komórki 48 godzin po wysianiu płytek pokrytych inPDL. Dzięki temu komórki mogą zregenerować się po stresie związanym z separacją.
    UWAGA: Sprawdź czystość kultury za pomocą immunocytochemii, jak opisano wcześniej¹⁵.
16. Frakcję ujemną (zebraną w probówce o pojemności 15 ml), która zawiera głównie astrocyty, należy umieścić w kolbach T-75 w pożywce wzrostowej.
17. Po co najmniej 6 godzinach inkubacji w inkubatorze o temperaturze 37 °C należy zmienić pożywkę i pozwolić jej wyrosnąć O/N. Następnego dnia należy podzielić astrocyty na potrzeby zabiegów.

Wyniki

Mikroglicja wyizolowana przy użyciu zestawu CD11b Positive Selection kit II charakteryzuje się wysoką czystością

Pierwotne mikrogleje mysie wyizolowano zgodnie z wyżej opisanym protokołem i wysiano na szkiełka nakrywki pokryte poli-D-lizyną w celu sprawdzenia czystości izolacji. Na każdą studzienkę wysiano dziesięć tysięcy komórek, a analizę immunocytochemiczną przeprowadzono z użyciem cząsteczki adaptorowej wiążącej jony wapnia 1 ...

Dyskusja

Starsze metody izolacji mikrogleju mają ograniczone poziomy odzysku, które nie są odpowiednie dla różnych analiz białek metodą Western blot i analiz RNA metodą qRT-PCR. Zróżnicowane przyleganie i łagodne metody trypsynizacji to dwa powszechne podejścia o niskiej wydajności mikrogleju 13,14,15. Podejście oparte na kolumnach CD11b również ma niski odzysk, ale osiąga większą czystość niż zróżnicowane przyleganie i łagodna trypsyna ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw separacyjny EasySep CD11b II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Pirogronian sodu	Life Technologies	11360070
MEM Aminokwasy endogenne (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamina (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma	13H469
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco firmy Life Technologies	25200
Dulbecco's PBS (DPBS)	Gibco firmy Life Technologies	14190250