Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Summary

Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.

Abstract

Wyjaśnienie właściwości wiążących białek ukierunkowanych na chromatynę może być bardzo trudne ze względu na złożoną naturę chromatyny i heterogeniczną naturę większości kompleksów modyfikujących chromatynę u ssaków. Aby pokonać te przeszkody, dostosowaliśmy test sekwencyjnej ekstrakcji soli (SSE) do oceny względnego powinowactwa do wiązania kompleksów związanych z chromatyną. Ten łatwy i prosty test może być wykorzystany przez osoby niebędące ekspertami do oceny względnej różnicy w powinowactwie wiązania dwóch powiązanych kompleksów, zmian powinowactwa kompleksu, gdy podjednostka zostaje utracona lub pojedyncza domena jest dezaktywowana, oraz zmiany powinowactwa wiązania po zmianach w krajobrazie chromatyny. Poprzez sekwencyjne ponowne zawieszanie chromatyny luzem w rosnących ilościach soli, jesteśmy w stanie profilować elucję określonego białka z chromatyny. Korzystając z tych profili, jesteśmy w stanie określić, w jaki sposób zmiany w kompleksie modyfikującym chromatynę lub zmiany w środowisku chromatyny wpływają na interakcje wiążące. Łącząc SSE z innymi testami in vitro i in vivo, możemy określić rolę poszczególnych domen i białek w funkcjonalności kompleksu w różnych środowiskach chromatyny.

Introduction

Regulacja DNA w komórkach eukariotycznych to skomplikowany i wyrafinowany system, który jest ściśle kontrolowany przez szereg białek, które koordynują reakcje na bodźce wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. DNA jest owijane wokół oktamerów histonowych, tworząc nukleosomy, które mogą być luźno rozmieszczone wzdłuż DNA lub zagęszczone w ciasne cewki¹. Ten strukturalny układ DNA i histonów jest znany jako chromatyna, która jest regulowana przez sieć białek, które odczytują, zapisują i usuwają modyfikacje potranslacyjne (PTM) na histonach². Niektóre histonowe PTM, takie jak acetylacja, zmieniają ładunek aminokwasu, na którym są osadzone, zmieniając interakcje między histonami a DNA². Histonowe PTM służą również do rekrutacji regulatorów transkrypcji, remodelerów chromatyny, maszynerii naprawy uszkodzeń DNA i maszynerii replikacji DNA do określonych regionów genomu³.

Większość metod badania oddziaływań chromatyny albo bada interakcje na małą skalę, albo obejmuje analizy całego genomu na dużą skalę. Badania wiązania in vitro często wykorzystują indywidualne rekombinowane domeny z peptydami histonowymi lub DNA w testach takich jak testy przesunięcia ruchliwości elektroforezy (EMSA), izotermiczna kalorymetria miareczkowa, polaryzacja fluorescencji i ściąganie peptydów. Ponieważ testy te zazwyczaj koncentrują się na pojedynczej domenie białkowej, ułatwiają zrozumienie małego elementu układanki, ale nie pozwalają nam zrozumieć kooperatywnego charakteru białek wielodomenowych, nie mówiąc już o ich roli w kompleksach wielobiałkowych. Kolejną warstwę zawiłości dodaje niejednorodny skład większości kompleksów modyfikujących chromatynę u ssaków. Ta niejednorodność białek, w połączeniu z dynamiczną naturą krajobrazu chromatyny, sprawia, że trudno jest odtworzyć interakcje wiązania in vivo białek chromatyny z chromatyną in vitro.

Metody in vivo poczyniły znaczne postępy; jednak często są drogie, czasochłonne i technicznie wymagające. Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie (ChIP-seq) jest bardzo przydatna do określania lokalizacji białek i modyfikacji histonów w całym genomie, jednak wymaga znacznej optymalizacji⁴. Białka są często sieciowane z chromatyną w celu zachowania interakcji; Może to jednak powodować sztuczne interakcje i maskowanie epitopów⁵. Ponadto immunoprecypitacje (IP) wymagają wysoce specyficznych przeciwciał oraz szeroko zakrojonej optymalizacji ścinania DNA i warunków IP za pomocą ChIP-qPCR przy użyciu znanego miejsca wiązania, które często nie jest dostępne a priori. Po optymalizacji warunków ChIP przetwarzanie próbek jest kosztowne i wymaga od kilku tygodni do miesięcy w celu sekwencjonowania i analizy. Chociaż metoda ta jest nieoceniona w identyfikacji lokalizacji białek związanych z chromatyną w całym genomie, koszt i zaangażowanie czasowe sprawiają, że stosowanie tej metody do generowania hipotez na temat tego, jak małe zmiany mogą wpływać na globalne właściwości wiązania, jest zaporowe.

W tym artykule opisujemy, jak można wykorzystać test sekwencyjnej ekstrakcji soli (SSE) do zbadania globalnych profili wiązania białek związanych z chromatyną i rozróżnienia, jak zmiany w białku, kompleksie lub globalnym profilu PTM mogą zmieniać interakcje. Chociaż ekstrakcja soli jest powszechnie i szeroko stosowaną techniką, pokazujemy, że ta sekwencyjna metoda jest wysoce powtarzalna i wszechstronna. SSE pozwala nam scharakteryzować, w jaki sposób pojedyncza podjednostka kompleksu lub nawet pojedyncza domena przyczynia się do ogólnego powinowactwa kompleksu do chromatyny masowej. SSE można również wykorzystać do określenia, czy na wiązanie białka mają wpływ zmiany w krajobrazie chromatyny, dostarczając interesujących hipotez dotyczących celowania w znaczniki histonowe, które można potwierdzić za pomocą ChIP-seq i innych badań całego genomu.

Pierwotnie zaadaptowaliśmy tę metodę od Wu et al., aby zbadać funkcję Polybromo1 (PBRM1) w wiązaniu remodelera chromatyny PBAF^6,7. Korzystając z tej techniki, określiliśmy rolę PBRM1 w wiązaniu chromatyny w kompleksie przebudowy chromatyny PBAF, a następnie określiliśmy względny wkład sześciu indywidualnych bromodomen w tę funkcję⁷.

Tutaj opisujemy, jak zoptymalizować tę metodę, aby badać wiązanie chromatyny w różnych typach komórek, aby ocenić względne powinowactwo wiązania podobnych kompleksów modyfikujących chromatynę, aby zbadać przemieszczenie białka z chromatyny przez chemiczny inhibitor i określić efekty wiązania chromatyny po zmianach w krajobrazie chromatyny.

Protocol

1. Przygotowania

1. Przygotuj 100 ml roztworu hipotonicznego Bufor A: 0,3 M sacharozy, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA i 0,5% NP-40. Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
   UWAGA: Niektóre linie komórkowe, takie jak HEK293T, wymagają mniej rygorystycznych warunków lizy. Jeśli jądra łatwo ulegają lizie, użyj zmodyfikowanego buforu A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0,05 mM EDTA, 0,1% NP-40 i 10% glicerolu.
2. Przygotować 250 ml roztworu podstawowego 2x mRIPA: 100 mM Tris pH 8,0, 2% NP-40 i 0,5% deoksycholanu sodu.
3. Przygotować 100 ml roztworu podstawowego 5 M NaCl.
4. Używając roztworów 2x mRIPA i 5 M NaCl, przygotuj 50 ml 1x roztworu mRIPA dla każdego z sześciu stężeń soli: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM i 500 mM NaCl. Przed rozpoczęciem eksperymentu ostudź wszystkie roztwory na lodzie.
5. Hoduj linie komórkowe w pożądanych warunkach.
   UWAGA: Podczas określania skutków strącenia białka, SSE dla linii eliminacji należy porównać z komórkami typu dzikiego. Te SSE muszą być wykonywane równolegle. Przykłady stosowania chemicznych inhibitorów lub bodźców znajdują się w sekcjach 3 - 5.

2. Podstawowa sekwencyjna ekstrakcja soli

1. Zbierz 8 milionów komórek w każdym stanie i umyj dwukrotnie 5 ml lodowatego PBS.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby mieć równą liczbę komórek, aby mieć równoważne stężenia białka. Dokładna liczba komórek może wymagać optymalizacji dla poszczególnych linii komórkowych lub określonych białek. Ważne jest, aby nie było ich zbyt wiele, ponieważ wzrost stężeń białek uniemożliwi obserwację krzywej elucji, która jest zależna od wiązania równowagi. Jednak przy zbyt małej liczbie komórek może nie być wystarczającej ilości białka do wykrycia krzywej, a osad chromatyny jest trudniejszy do wyizolowania i może zostać utracony między frakcjami.
2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml inhibitorów proteazy Buffer A +, przenieść do 1,5 ml mikroprobówek wirówkowych i obracać od góry do dołu w temperaturze 4 ºC przez 10 minut.
3. Izolować jądra przez odwirowywanie przy 6000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C .
   UWAGA: Po tym kroku otoczka jądrowa powinna być nadal nienaruszona. Jeśli otoczka jądrowa jest nienaruszona, pastylka ponownie całkowicie się zawiesi; Jednak gdy otoczka zostanie poddana lizie i chromatyna zostanie uwolniona, osad nie zostanie ponownie zawieszony. Jeżeli otoczka jądrowa nie jest nienaruszona po inkubacji buforu A, należy użyć zmodyfikowanego buforu A.
4. Dodać 200 μl inhibitorów proteazy mRIPA 0 mM NaCl + do każdej osady jądra przed ponownym zawiesieniem osadu. Homogenizować każdą próbkę, pipetując 15 razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Osad powinien łatwo ponownie zawiesić się, jednak jądra ulegną lizie podczas pipetowania, a próbka stanie się gęsta, lepka i trudna do pipetowania.
   1. Aby wciągnąć osad do końcówki, należy postukać końcem końcówki pipety o dno probówki wirówki. Osad nie rozpuści się w pełni po uwolnieniu DNA z jąder, ale pipetowanie go rozbije.
5. Gdy wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane, inkubować wszystkie próbki na lodzie przez 3 min.
   UWAGA: Może być konieczne zoptymalizowanie czasu inkubacji w zależności od interesującego białka.
6. Wyizolować osad chromatyny, wirując próbki przez 3 minuty w temperaturze 6500 x g w temperaturze 4 °C.
7. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Będzie to frakcja 0 mM. Ten roztwór mRIPA o stężeniu 0 mM może działać jako etap płukania w celu lizy jąder i usunięcia wszelkich luźnych białek niezwiązanych z chromatyną.
8. Dodaj 200 μl inhibitorów proteazy mRIPA 100 mM NaCl + do każdej osadki chromatyny przed ponownym zawiesiniem osadu. Rozdrobnij osad chromatyny, pipetując osad w górę iw dół 15 razy.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby być konsekwentnym w kwestii liczby pipetowania granulek.
9. Inkubować na lodzie przez 3 minuty. Ten etap inkubacji pozwala wszystkim próbkom osiągnąć stan równowagi, co jest szczególnie ważne, gdy istnieje wiele próbek.
10. Wirować przy 6500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
11. Powtórzyć 2,6 - 2,10 dla pozostałych stężeń soli.
    UWAGA: Po 400 mM NaCl, mRIPA granulka powinna być przezroczysta i lepka i nie pozostanie na dnie tuby. Osad można umieścić w pokrywie probówki wirówkowej, podczas gdy supernatant jest odizolowany.
12. Dodaj 70 μl 4x barwnika ładującego białko do każdej frakcji i załaduj 30 μl każdej frakcji do żelu akrylamidowego SDS do analizy western blot.
    UWAGA: Aby określić profil wiązania białka, ważne jest, aby załadować równoważne objętości lizatu, a nie ładować równe stężenia białka.
13. Wykonaj standardowy western blot, przenosząc go na błonę i użyj przeciwciał pierwszorzędowych dla białek będących przedmiotem zainteresowania.
14. Aby określić ilościowo białko eluowane z chromatyny, należy inkubować blot w przeciwciałach drugorzędowych IRDye we fluorescencji w podczerwieni i zobrazować go za pomocą imagera. Chociaż można zastosować inne metody wywoływania, zalecamy obrazowanie fluorescencyjne lub w podczerwieni, ponieważ ma ono bardziej ilościowy charakter.
15. Użyj ImageJ lub podobnego oprogramowania, aby obliczyć intensywność białka eluowanego przy każdym stężeniu soli. Tworząc wykres intensywności pasma w stosunku do stężenia soli, można określić wzór elucji interesującego Cię białka.

3. Sekwencyjne wydobycie soli w obecności inhibitora "czytnika"

1. Zbierz dwa zestawy komórek (4 miliony) i wyizoluj jądra, jak w standardowym SSE.
2. Ponownie zawiesić oba zestawy w 200 μl mRIPA 0 mM NaCl i inkubować przez 3 minuty. Pozwoli to na usunięcie wszelkich wolnych białek z jąder.
3. Dodać 200 μl mRIPA 0 mM NaCl do każdej granulki. Dodać inhibitor (2 μl z 1 mM (+)JQ1) do jednej próbki, a DMSO do zestawu kontrolnego.
4. Mieszać granulki przez pipetowanie 15 razy i inkubować na lodzie przez 5 minut.
5. Wirować przy 6500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
6. Powtórz 3,3 - 4 dla wszystkich stężeń soli i wykonaj standardowy western blot.

4. Sekwencyjna ekstrakcja soli w obecności inhibitora "writer"

1. Traktuj komórki inhibitorem (10 μM SAHA) lub DMSO przez 3 godziny.
2. Zbierz 4 miliony komórek do każdego zabiegu.
3. Wykonaj standardowe SSE dla próbek z inhibitorem dodanym do wszystkich.

5. Sekwencyjna ekstrakcja soli po uszkodzeniu DNA

1. Traktuj komórki doksorubicyną 1 μM przez 1 godzinę.
2. Zmień pożywkę na komórkach i pozwól im się zregenerować przez 3 godziny.
3. Zbierz 8 milionów komórek i wykonaj podstawowe SSE.

6. Niesekwencyjna ekstrakcja soli

1. Zbierz 12 milionów komórek i umyj je za pomocą PBS.
2. Podziel komórki tak, aby w mikroprobówce wirówkowej znajdowały się 2 miliony komórek.
3. Zawiesić ponownie w 500 μl buforu A i inkubować przez 10 minut.
4. Wyizolować jądra przez odwirowanie przy 6000 x g.
5. Ponownie zawiesić granulki w 200 μl każdego z mRIPA + NaCl.
6. Homogenizować każdą próbkę, pipetując 15 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
7. Inkubować na lodzie przez 3 minuty.
8. Wyizolować chromatynę przez odwirowanie przy 6500 x g i przenieść supernatant do czystych probówek. Dodaj 70 μl barwnika ładującego i przeprowadź 30 μl na żelu SDS do analizy western blot.

Results

W tym artykule prezentujemy zalety i zastosowania powszechnie stosowanej metody sekwencyjnej ekstrakcji soli (SSE), którą zaadaptowaliśmy z literatury⁶. W Rysunek 1, porównujemy odtwarzalność SSE do ekstrakcji białek niesekwencyjnie, wykrywając wzorce elucji ARID1a i PBRM1. Konsekwentnie obserwujemy, że ARID1a, podjednostka BAF, eluuje głównie przy 200 mM NaCl, a PBRM1, wyłączna podjednostka PBAF, eluuje głównie przy 300 mM NaCl.

Discussion

Charakterystyka interakcji białek i chromatyny poprzez ekstrakcję solą jest powszechną metodą stosowaną od dziesięcioleci^14,15; Jednak wcześniej nie był systematycznie optymalizowany, aby ujawnić jego pełną użyteczność. Pokazujemy, w jaki sposób ta sekwencyjna metoda zapewnia szybki i niedrogi sposób rozróżniania zmian w wiązaniu chromatyny, gdy zmienia się białko lub środowisko. SSE jest wysoce elastyczny i optymalizowalny, a co ważne, jest technicznie prosty i ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorek sodu, kryształ 2,5 kg (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
Sacharoza, kryształ 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
Chlorek potasu, granulowany 500 g (cz.�g.) (ACS)	Avantor/Macron	6858-04
Baza trizma(R), podstawowy wzorzec i bufor, >=99,9% (miareczkowanie), krystaliczny	kwas Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA (etylenodinitrylo) tetraoctowy, sól disodowa, dihydrat 125 g ar (ACS)	Avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES Bufor Roztwór (1M)	Gibco	15630-080
Chlorek magnezu, 6-hydrat, kryształ 500 g cz.d.a.; (ACS)	Avantor/Macron	5958-04
GLICEROL, 1L	Amresco	0854-1L
SÓL SODOWA KWASU DEOKSYCHOLOWEGO, 100g	Amresco	0613-100G
Pipeta Eppendorf Research plus	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R mikrowirówka z chłodzeniem	Eppendorf	5424 R
Wtórna mysz IgG połączona z HRP	Sygnalizacja komórkowa	7076
Wtórna królicza IgG sprzężona z HRP	Sygnalizacja komórkowa	7074
Przeciwciało BMI-1	Przeciwciało Millipore
PBRM1	Przeciwciało Bethyl	A301-591A
ARID1a	Cruz	sc-32761
Przeciwciało BRD4	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
Doxorubicin	AK Scientific	25316-40-9
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Macron	4948-02
Mini komórka trans-blot	BioRad	1703930
Mini zbiornik żelowy	ThermoFisher	A25977
Albumina bydlęca (BSA)	Amresco	0332-100g	Stosowany jako 5% roztwór w PBS-T jako roztwór blokujący dla Western blot
Bufor do biegania Bolt MOPS SDS (20x)	Life Technologies	B0001
Bufor do próbek Bolt LDS (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Wstępnie barwiona drabinka białkowa, 10 do 250 kDa	ThermoFisher	26619
metylowy Alkohol, bezwodny	Macron	3041-10
Trypsyna kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
AZYDEK SODU, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
DODECYLOSIARCZAN SODU (SDS)500g UN1325	Amresco	0227-500G
Glicyna, do elektroforezy, >=99%	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop Probówki do mikrowirówek, polipropylen	VWR	20170-333
1000 µ L Końcówki do pipet	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris Prefabrykowane żele 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
Hemisulfan leupeptyny, 5 MG	RPI Research Products	22035-0,005	Stosowany do roztworu inhibitora proteazy.
APROTININ, 10 MG	RPI Research Products	20550-0.01	Stosowany do roztworu inhibitora proteazy.
PEPSTATYNA A, 5 MG	RPI Research Products	30100-0,005	Stosowany jako roztwór inhibitora proteazy.
OVCA429 komórki	Dar od Karen Cowden Dahl. Ph.D.
HEK293T	Ogniwa ATCC	CRL-3216
HeLa	ATCC	CCL-2
Nośniki McCoy's 5A	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Minimum Essential Medium (MEM), Proszek	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) aminokwas endogenny	Gibco	11140-050
FB-11: Surowica bydlęca płodu, USA Źródło	Omega Scientific	FB-11
Roztwór penicyliny-streptomycyny	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
pirogronian sodu	Life Technologies	11360070
VWR Power Źródło:	VWR	13-690-032