Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Podsumowanie

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Streszczenie

Transfekcja, czyli dostarczanie obcych kwasów nukleinowych do komórki, jest potężnym narzędziem w badaniach nad białkami. Dzięki tej metodzie kanały jonowe mogą być badane poprzez analizę elektrofizjologiczną, charakterystykę biochemiczną, badania mutacji i ich wpływ na procesy komórkowe. Transfekcje przejściowe oferują prosty protokół, w którym białko staje się dostępne do analizy w ciągu kilku godzin do kilku dni. Chociaż metoda ta przedstawia stosunkowo prosty i efektywny czasowo protokół, jednym z krytycznych elementów jest kalibracja ekspresji interesującego genu do fizjologicznie odpowiednich poziomów lub poziomów, które są odpowiednie do analizy. W tym celu pojawiło się wiele różnych podejść, które oferują możliwość kontrolowania ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Kilka stabilnych protokołów transfekcji komórek zapewnia sposób na trwałe wprowadzenie interesującego genu do genomu komórkowego pod kontrolą aktywacji transkrypcji kontrolowanej przez tetracyklinę. Chociaż technika ta zapewnia wiarygodne poziomy ekspresji, każdy gen będący przedmiotem zainteresowania wymaga kilku tygodni wykwalifikowanej pracy, w tym kalibracji krzywej zabijania, selekcji kolonii komórkowych i ogólnie większej ilości zasobów. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który wykorzystuje transfekcję przejściowego genu TRPV1 (Transient Receptor Potential kation channel subfamily V member 1) w systemie indukowalnym jako skuteczny sposób ekspresji białka w kontrolowany sposób, co jest niezbędne w analizie kanałów jonowych. Pokazujemy, że za pomocą tej techniki jesteśmy w stanie przeprowadzić obrazowanie wapnia, analizę całych komórek i pojedynczych kanałów z kontrolowanymi poziomami kanałów wymaganymi dla każdego rodzaju zbierania danych za pomocą jednej transfekcji. Ogólnie rzecz biorąc, zapewnia to powtarzalną technikę, którą można wykorzystać do badania struktury i funkcji kanałów jonowych.

Wprowadzenie

Heterologiczne systemy ekspresji to jedna z najczęściej używanych technik do badania wielu funkcji komórkowych¹. Ich niski endogenny profil białkowy, minimalne wymagania dotyczące konserwacji, niezawodny wzrost oraz zdolność do pobierania i ekspresji obcego DNA sprawiły, że linie komórkowe, takie jak ludzka nerka embrionalna (HEK293) i jajnik chomika chińskiego (CHO) są prawie niezbędne do badań biologicznych^2,3. Obszary badań z wykorzystaniem systemów heterologicznych obejmują białka błonowe, sygnalizację wewnątrzkomórkową i aktywność enzymatyczną. Po transfekcji obcego DNA do komórki można przeprowadzić wiele różnych form analizy, w tym elektrofizjologię, ratiometryczne obrazowanie wapnia, western blot itp.^4,5.

Ze względu na szeroki wachlarz potencjalnych zastosowań dla heterologicznych systemów ekspresji, opracowano wiele różnych odczynników i produktów do wykorzystania tych komórek i ich właściwości⁶. Systemy dostarczania DNA, które przejściowo lub na stałe integrują obce DNA z komórkami w celu badania białka egzogennego, stały się jednym z najpopularniejszych i najbardziej użytecznych narzędzi do badań biologicznych. Mówiąc dokładniej, przejściowa transfekcja DNA do komórki jest szeroko stosowana jako prosty, nieskomplikowany proces, który wymaga stosunkowo niewiele czasu i materiałów. Co więcej, wskaźnik powodzenia komórek, które przechodzą transfekcję, jest wysoki⁷. Technika ta jest bardzo niezawodna w połączeniu z genem markerowym, takim jak białko zielonej fluorescencji (GFP), i może być stosowana w wielu różnych technikach, takich jak obrazowanie wapnia i elektrofizjologia⁵. Niestety, przejściowa ekspresja DNA w komórkach gospodarza wiąże się z pewnymi poważnymi pułapkami, między innymi z tym, że poziom ekspresji na komórkę jest niewiarygodny. Liczba kopii plazmidowego DNA pobranych na komórkę jest niekontrolowana, dlatego ekspresja między poszczególnymi eksperymentami może się znacznie różnić². Problem ten staje się istotny, gdy próbuje się odtworzyć warunki fizjologiczne lub stosuje się precyzyjne techniki zbierania danych.

Jako rozwiązanie wyżej wymienionych komplikacji, zaprojektowano stabilne protokoły transfekcji, w których interesujący gen może być wstawiony do genomu komórki pod ścisłą kontrolą indukowalnego promotora, takiego jak system ekspresji represora tetracykliny, zapewniając, że pojedyncza kopia plazmidu integruje się z genomem każdej komórki i ulega ekspresji dopiero po indukcji mechanizmu transkrypcji, Na przykład w obecności doksycykliny. Chociaż rozwiązuje to przeszkody związane z niespójnymi poziomami ekspresji białek, metoda ta traci wygodę szybkiego i stosunkowo prostego protokołu przejściowych transfekcji. Ustanowienie stabilnej linii komórkowej zajmuje co najmniej kilka tygodni, w ciągu których należy skalibrować krzywą zabijania wyznaczoną przez określone antybiotyki, aby utrzymać ekspresję białka i zapewnić integrację wektora oraz umiejętnie selekcjonować i hodować kolonie komórkowe. Ogólnie rzecz biorąc, zajmuje to znacznie więcej czasu i wysiłku przy niższym wskaźniku sukcesu⁸.

Tutaj wprowadzamy protokół pośredni, który wykorzystuje mocne strony obu popularnych opcji transfekcji, aby zapewnić prosty i skuteczny sposób kontrolowania poziomów ekspresji w dowolnej indukowalnej linii komórkowej. Utrzymując komórki z indukowalnym układem tet, przejściowo transfekujemy nasz interesujący nas gen, podrodzinę kanałów kationowych przejściowego potencjału receptora V członka 1 (TRPV1), zligowany w wektor, który może homologicznie łączyć się z układem represorowym. W ten sposób gen może zostać wprowadzony do komórek bez rozpoczynania ekspresji. Dopiero po dodaniu doksycykliny gen zaczyna ulegać ekspresji, co pozwala nam skalibrować poziomy ekspresji białka zgodnie z techniką lub poziomami obserwowanymi w warunkach fizjologicznych. Nasz protokół pozwala również uniknąć długotrwałych komplikacji związanych z generowaniem linii komórkowej o stabilnej ekspresji. Zaczynamy od pokazania zmieniających się poziomów aktywacji TRPV1 w obrazowaniu wapnia od nieindukowanego przez cztery godziny indukcji i jak koreluje ze wzrostem wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Następnie powielamy protokół w całej konfiguracji ogniwa techniki patch clamp, pokazując rosnący prąd wraz ze wzrostem czasu indukcji. Na koniec przedstawiamy przykłady jednokanałowych zapisów elektrofizjologii i pokazujemy, że technika ta jest szczególnie przydatna do kontrolowanej ekspresji, gdy szuka się precyzyjnego zbierania danych na podstawie poszczególnych jednostek białka. Dzięki naszemu protokołowi oferujemy wygodny sposób kontrolowania ekspresji białek w systemach heterologicznych przy jednoczesnym unikaniu długotrwałych komplikacji związanych z hodowlą komórkową, zapewniając w ten sposób sposób kontrolę warunków między eksperymentami i zapewniając bardziej powtarzalne wyniki.

Protokół

1. Ligowanie interesującego genu w represyjnym miejscu wektora

1. Uzyskaj wektor indukowalny, taki jak pcDNA5/FRT/TO lub pcDNA4/TO.
2. Przeanalizuj interesujący nas gen pod kątem potencjalnie podatnych miejsc restrykcyjnych w środku genu, które są również zawarte w miejscu wielokrotnego klonowania wybranego wektora za pomocą oprogramowania do analizy DNA in silico⁴.
3. Korzystając ze standardowych technik nakładania się PCR⁴, należy otoczyć interesujący gen dwoma wybranymi miejscami rozpoznawania enzymu restrykcyjnego (które nie występują w genie będącym przedmiotem zainteresowania), pierwszym wstawionym przed kodonem start, a drugim po kodonie stop.
4. Trawić zarówno wektor, jak i wstawkę za pomocą enzymów restrykcyjnych (wybranych w kroku 1.2) w temperaturze roboczej enzymów przez jedną godzinę, a następnie dodać jedną jednostkę fosfatazy jelita cielęcego () do reakcji wektora tylko przez 30 minut, aby uniknąć samoligacji.
5. Załaduj strawione DNA na 1% żel agarozowy i oddziel rozszczepione segmenty za pomocą elektroforezy⁹.
6. Za pomocą światła UV odetnij ostrzem kawałki żelu zawierające pożądane segmenty wektora i włóż do podwiązania.
7. Ekstrahować segmenty DNA z kawałków żelu agarozowego (przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji DNA) i zmierzyć ich końcowe stężenie za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm.
8. Zliguj interesujący gen do indukowalnego wybranego wektora za pomocą enzymu ligazy T4 w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo podwiązania wkładki z wektorem, należy użyć stosunku molowego insert: wektora 3:1. Do kontroli przygotuj reakcję ligacji, która obejmuje tylko wektor.
9. W celu transformacji bakteryjnej dodaj 10 ng samego wektora i genu wektor + do 50 μl kompetentnej E. coli. Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut, a następnie inkubować przez 45 sekund w temperaturze 42 °C. Natychmiast umieścić z powrotem na lodzie na dwie minuty i przenieść przekształcone bakterie na pożywkę o pojemności 500 μl LB. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C przy mieszaniu przy 220 obr./min.
10. W celu selekcji pomyślnie przekształconych bakterii, należy umieścić 100 μl każdej reakcji (jak opisano w ppkt 1.9) na przygotowanej płytce agarowej LB zawierającej odpowiedni antybiotyk (np. 100 μg/ml ampicyliny w przypadku stosowania pCDNA4/TR).
11. Pozostawić na noc do wyrośnięcia w temperaturze 37 °C. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni, szczelnie owijając je folią parafinową z tworzywa sztucznego.
12. Podnieś poszczególne kolonie za pomocą końcówki o pojemności 10 μl i pozostaw na noc do wzrostu w pożywce z antybiotykiem o pojemności 3 ml LB + w temperaturze 37 °C pod mieszaniem przy 220 obr./min. Bakterie z DNA będącym przedmiotem zainteresowania można zamrozić (w temperaturze -20 °C) w celu krótkotrwałego przechowywania poprzez odwirowanie LB i bakterii w temperaturze 11 000 x g i odsysanie supernatantu. Długotrwałe przechowywanie wymaga zamrożenia bakterii w postaci glicerolu w temperaturze -80 °C.
13. Ekstrahować DNA za pomocą mini-prepu i zmierzyć końcowe stężenie za pomocą spektrofotometru przy 260 nm⁵.
14. Potwierdź pomyślną insercję interesującego genu, sekwencjonując oczyszczony konstrukt⁴. Alternatywnie, diagnostyczne trawienie konstruktu przez enzymy restrykcyjne przy użyciu elektroforezy do oddzielenia ciętych segmentów i oceny ich obecności i długości może być również wykorzystane do tego celu⁴.

2. Hodowla linii komórkowych wyrażających TetR

1. Uzyskaj linię hodowli komórkowej zawierającą plazmid represorowy Tet włączony do ich genomowego DNA. W tym przypadku protokół zostanie napisany na przykładzie ludzkich embrionalnych komórek 293T nerki (HEK-293T) zawierających plazmid pcDNA6 / TR.
2. Komórki nasienne na 100 mm płytce do hodowli tkankowej z modyfikowanym podłożem Eagles (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 10% FBS, 1% penicyliną-streptomycyną, 2 mM l-glutaminą i 25 mM HEPES, pH 7,3 (tutaj: Full DMEM) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Cała praca z komórkami powinna być wykonywana w okapie biologicznym w sterylnych warunkach.
3. W celu utrzymania ekspresji genu represora Tet należy odessać pożywkę i zastąpić ją Full DMEM uzupełnionym o 5 μg/ml blasticydyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Gdy komórki osiągną 80 - 90% konflufluencji, należy odessać pożywkę i delikatnie przemyć komórki dwukrotnie DPBS (bez wapnia i magnezu) podgrzanym do 37 °C.
5. W celu delikatnego uniesienia komórek bez powodowania uszkodzeń mechanicznych należy inkubować kulturę w DMEM zawierającym 0,05% trypsyny podgrzanej do 37 °C przez 1,5 min.
6. Zablokuj działanie trypsyny równą objętością pełnego DMEM. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby podnieść komórki i przenieść je do sterylnej probówki.
7. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.
8. Odessać supernatant i zastąpić go 1 ml Full DMEM. Pipetować roztwór z komórkami w górę i w dół, aż nie będzie widać grudek komórek. Policz i oblicz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
9. Nasiona 1 - 2 x 10⁶ komórek w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm zawierającym 12 ml pełnego DMEM z 5 μg/ml blasticydyny. Dziel komórki dwa razy w tygodniu, gdy osiągną 90% zbieżności.

3. Transfekcja plazmidu będącego przedmiotem zainteresowania do komórek

1. Stosując tę samą metodę dzielenia komórek, jak opisano powyżej, przenieś komórki do studzienek na 12-dołkowej płytce przygotowanej z 0,9 ml pełnego DMEM, wystarczającego do uzyskania 50% zlewania (~ 200 000 komórek) i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ .
2. Przygotować mieszaninę transfekcji z pcDNA4/TO zawierającą interesujący nas gen, obojętny plazmid, aby doprowadzić całkowitą ilość DNA do 1 μg (w razie potrzeby), 3 μl odczynnika do transfekcji lipidów i DMEM, aby uzyskać końcową objętość 100 μl. Optymalna ilość plazmidowego DNA, która ma być użyta, różni się znacznie, ponieważ różne białka wyrażają się z różną wydajnością. W przypadku eksperymentów elektrofizjologicznych należy uwzględnić EGFP w plazmidzie ekspresyjnym ssaków w koktajlu transfekcji, aby uwidocznić komórki, które pomyślnie przeszły transfekcję⁴.
3. Inkubować mieszaninę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Transfekcję komórek poprzez pipetowanie mieszaniny do transfekcji kroplami na posiane komórki na płytce 12-dołkowej i energiczne kołysanie płytki, aby zapewnić jednorodną dyspersję DNA i odczynnika do transfekcji. Komórki powinny być ~ 80% zlewające się w momencie transfekcji.
5. Inkubować transfekowane komórki O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
6. Upewnij się, że komórki zostały pomyślnie transfekowane, obserwując sygnał fluorescencyjny EGFP pod lampą UV następnego ranka, jeśli wykonujesz elektrofizjologię.

4. Komórki posiewne na szkiełkach nakrywkowych/studzienkach z poli-D-lizyny (PDL)

1. Wysterylizuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm, oblewając je 70% roztworem etanolu izopropylowego. Wysuszyć i umieścić pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki w celu zapisu elektrofizjologicznego.
2. Pobrać pipetą roztwór 0,1 - 0,2 mg/ml roztworu PDL na każde szkiełko nakrywkowe lub studzienkę komory obrazowania wapnia.
3. Pozostawić na 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
4. Przemyć trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną (DDW) klasy hodowli komórkowej, zasysając między każdym praniem. Po ostatnim praniu dokładnie wysuszyć i pozostawić do odstawienia na suchą rękę.
5. Do celów elektrofizjologii każdą studzienkę zawierającą szkiełko nakrywkowe pokryte PDL należy wypełnić 500 μl pełnego DMEM ogrzanego do temperatury 37 °C.
6. Wykonaj tę samą metodę podziału transfekowanych komórek, jak opisano powyżej. Po ponownym zawieszeniu komórek po leczeniu trypsyną i zablokowaniu, przenieś 80 μl komórek (lub około 30 000 komórek) do środka każdego szkiełka nakrywkowego pokrytego PDL w celu zapisu elektrofizjologicznego. Pozostawić komórki na co najmniej 1,5 godziny lub inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2
.
7. Do obrazowania wapnia przenieś i umieść 20 μl komórek (około 20 000 komórek) do środka każdej studni obrazowania wapnia pokrytego PDL. Pozostawić komórki na co najmniej 30 minut i dodać 180 μl pełnego DMEM do każdej studzienki.

5. Indukowanie ekspresji genów

1. Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny o stężeniu 1 mg/ml w DDW zgodnie z instrukcjami producenta. Roztwór podstawowy należy chronić przed światłem w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni. W przypadku długotrwałego przechowywania roztwór podstawowy doksycykliny należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotować świeży roztwór doksycykliny o stężeniu 2 μg/ml (elektrofizjologia) lub 3 μg/ml (obrazowanie wapnia) w pełnym DMEM i ogrzać go do temperatury 37 °C.
3. W przypadku zapisów elektrofizjologicznych należy odpipetować 500 μl roztworu doksycykliny o stężeniu 2 μg/ml do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/ml doksycykliny. Do obrazowania wapnia dodać 100 μl 3 μg/ml roztworu doksycykliny do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/ml doksycykliny. Zapisz godzinę indukcji.
4. Inkubować przez żądany czas do indukcji w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

6. Kalibracja osi czasu ekspresji białek

1. Kalibracja ekspresji białek za pomocą obrazowania wapnia^5,10
   1. Przygotować roztwór Ringera (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 2 mM_MgSO4, 20 mM HEPES, pH dostosowane do 7,4 z NaOH) i ogrzać go do 37 °C.
   2. Przygotować stężenia nasycające agonistę kanału w roztworze Ringera. Ponieważ ilość agonisty jest rozcieńczana po dodaniu do komór obrazowania wapnia zawierających komórki i roztwór zewnątrzkomórkowy, należy podwoić ilość pożądanego końcowego stężenia agonisty. To również sprawia, że ilość roztworu do kąpieli w każdej studzience ma kluczowe znaczenie dla kontroli.
   3. Przygotować roztwór niejonowego F-127 20% W/V w DMSO. Podgrzać roztwór do temperatury 40 °C aż do rozpuszczenia niejonowego F-127. Przechowywać niejonowy roztwór F-127 w temperaturze pokojowej i ogrzać go do 40 °C przed użyciem. Niejonowy F-127 jest stosowany do pomocy w dyspersji estrów acetoksymetylowych (AM) fluorescencyjnych wskaźników jonowych, takich jak Fura-2, w roztworach wodnych.
   4. Odessać pożywkę i zastąpić ją roztworem ładującym Fura-2AM (roztwór Ringera uzupełniony o 2 - 3 μM Fura-2AM, 0,02 mg/ml niejonowego F-127 i 10 mM D-glukozy).
   5. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   6. Odessać roztwór Fura-2AM i przemyć komórki roztworem D-glukozy Ringera + 10 mM w celu usunięcia barwnika zewnątrzkomórkowego. Powtórz ten krok dwukrotnie.
   7. Pozostawić 200 μl roztworu D-glukozy Ringera + 10 mM w każdym dołku i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   8. Umieść komorę na stoliku nad końcówką nosową mikroskopu i zabezpiecz ją uchwytem.
   9. Włącz lampę, kamerę i mikroskop i wybierz filtr Fura-2, aby wykryć emisję o długości fali 510 nm.
   10. Dostosuj żądane powiększenie i ustaw ostrość komórek w wybranym polu.
   11. W ciemności odejmij światło tła i ustaw czas ekspozycji.
   12. Ustaw próbkowanie obrazu z żądaną szybkością i rejestruj odpowiedź fluorescencyjną komórek obciążonych Fura-2, wzbudzając je na długościach fal 340 i 380 nm. Stosunek sygnałów 340/380 jest wskaźnikiem wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺, a tym samym również aktywności TRPV1.
   13. Dodać 2 μM kapsaicynę do 200 μl roztworu Ringera przez pipetowanie, aby uzyskać końcowe stężenie nasycające 1 μM kapsaicyny w celu oceny poziomu ekspresji TRPV1.
   14. Przeanalizuj odpowiedź TRPV1 zgodnie z czasem indukcji i określ protokół dla interesującego Cię białka.
2. Regulacja ekspresji białek w układach heterologicznych przy użyciu całej konfiguracji komórkowej techniki patch clamp^4,11.
   1. Przygotować roztwór kąpieli z (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2_MgSO4, 5 HEPES i 5 kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), dostosowany do pH 7,4 za pomocą NaOH.
   2. Przygotować stężenia nasycające agonistę kanału w roztworze zewnątrzkomórkowym.
   3. Wyciągnąć szklane elektrody o średnicy wewnętrznej (ID) 1,10 mm i wypolerować ogniowo do rezystancji 2 - 4 MΩ.
   4. Przygotować roztwór pipet o stężeniu (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2_MgSO4, 0,5 CaCl₂, 1 EGTA i 10 HEPES o pH 7,2 z KOH. Przefiltruj roztwór pipety przed użyciem. Przed każdym eksperymentem pojedyncza, wypolerowana ogniowo szklana pipeta jest ponownie napełniana, zanurzając końcówkę w roztworze pipety na co najmniej minutę, a następnie napełniana za pomocą stopionej i rozciągniętej końcówki za pomocą strzykawki wypełnionej tym samym roztworem pipety.
   5. Delikatnie podnieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe pokryte PDL z platerowanymi komórkami z dołka na plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną około 2 ml roztworu do kąpieli w temperaturze pokojowej. Obserwuj pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
   6. Zlokalizuj dodatnią komórkę EGFP, jak pokazano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, na przygotowanym szkiełku nakrywkowym i przejdź do środka wizualizowanego pola.
   7. Podłącz napełnioną pipetę do uchwytu pipety mikromanipulatora i wstrzyknij niewielką ilość dodatniego ciśnienia do systemu, aby uniknąć zanieczyszczenia wewnątrzkomórkowego roztworu pipety. Obniż go do poziomu tuż nad GFP - ogniwem dodatnim, sprawdzając prawidłową rezystancję.
   8. Gdy pipeta dotknie ogniwa, zastosuj niewielką ilość podciśnienia, aby utworzyć uszczelnienie GΩ między szklaną pipetą a membraną komórkową.
   9. Krótkim, ostrym impulsem ssania przerwij błonę komórkową, umożliwiając pipecie kontakt z wewnątrzkomórkową zawartością komórki.
   10. Przełącz tryb wzmacniacza na całe ogniwo i obniż filtr Bessela i wzmocnienie wyjściowe odpowiednio do 1 - 5 kHz i 0.5α.
   11. Rejestruj aktualną odpowiedź na stężenia nasycenia agonisty kanału za pomocą ramp napięcia lub protokołu bez przerw.
   12. Ponieważ wydajność ekspresji zmienia się między różnymi białkami, powtórz zapisy, używając różnych czasów trwania indukcji.
3. Określanie idealnego czasu indukcji dla nagrań jednokanałowych⁴.
   1. Przygotować roztwór (mM) 150 Na-glukonianu, 15 NaCl, 5 EGTA i 10 HEPES, dostosowany do pH 7,4 za pomocą NaOH, jako roztwór pipetowany. Do roztworu do kąpieli należy użyć roztworu z kroku 6.2.1.
   2. Powtórz procedurę z całą komórką przy użyciu szklanych pipet o średnicy wewnętrznej 0,86 mm, wypolerowanych ogniowo do rezystancji 10 - 12 MΩ i ustaw potencjał utrzymywania na -40 mV.
   3. Utwórz uszczelnienie na membranie, jak opisano wcześniej, i rozerwij membranę.
   4. Za pomocą mikromanipulatora podnieść pipetę z plastrem membranowym z dala od komórki.
   5. Umieścić system perfuzyjny bezpośrednio obok pipety zawierającej plaster membranowy.
   6. Zmniejsz filtr Bessela i wzmocnienie wyjściowe odpowiednio do 2 - 5 kHz i 10α.
   7. Perfuzja nasyca stężenia agonisty na łatkę błony, oceniając, czy plaster zawiera jeden lub więcej kanałów zgodnie z odpowiedzią.
   8. Przeanalizuj liczbę pomyślnie zarejestrowanych łat jednokanałowych w stosunku do czasu indukcji zastosowanego do komórek. Dostosuj czas indukcji zgodnie z pożądanymi wynikami.

Wyniki

Aby szybko stworzyć indukowalny model ekspresji, wykorzystaliśmy komórki HEK293, które wyrażają białko represorowe tetracykliny (TR) (np. T-REx-293) oraz wektory, które zawierają sekwencje operatora tetracykliny (TetO) między promotorem CMV a miejscem wielokrotnego klonowania (np. pcDNA4/TO). Po transfekcji do komórek TREx-293 ekspresja interesującego genu w pcDNA4 / TO jest hamowana, ponieważ TR wiąże się z TetO. Dodanie doksycykliny do pożywki zapobiega interakcji TR-T...

Dyskusja

Transfekcja jest szeroko stosowanym protokołem do ekspresji białek i badań, z wieloma różnymi wariantami w celu poprawy spójności i stabilności ekspresji. Odczynniki do transfekcji przejściowej oferują prosty, łatwy w użyciu protokół, w którym komórka i białko będące przedmiotem zainteresowania mogą być analizowane w ciągu kilku godzin do nocy od momentu transfekcji. Niestety, takie podejście może być nieprzewidywalne, gdy tryb analizy wymaga stałego poziomu ekspresji białek, takich jak zapisy jednokanałowe w elektrofizj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pcDNA&handel; 4/TO Wektor ekspresji ssaków	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA&handel; 5/TO Wektor ekspresji ssaków	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Zestaw do szybkiego oczyszczania PCR	Invitrogen	K310001
Swift™   Termocykler MaxPro	Esco	n.d
Enzymy restrykcyjne	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agaroza	Lonza	50004
PureLink Szybki zestaw do ekstrakcji żelu	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 Ligaza DNA	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemicznie kompetentnych E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicylina (sód), złoto klasy USP	Bio	A-301-5
Trypton do mikrobiologii	Merck	6.19305E+13
Ekstrakt drożdżowy	BD na całym świecie	212750
SIF6000R Inkubowany shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin® plazmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Zasilacz	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast&handel; B1A Mini żelowy system elektroforezy	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 linia komórkowa	Invitrogen	R710-07
DMEM (1x), płynny (o wysokiej zawartości glukozy)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Bufor	NEB	B7204S
pcDNA&handel; 6/TR  Wektor ekspresji ssaków	ThermoScientific Fisher	V102520
Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, zatwierdzona przez UE, pochodząca z Ameryki Południowej	Gibco	10270106
HEPES (1 M)	Przemysł biologiczny	03-025-1B
Roztwór penicyliny-streptomycyny	Przemysł biologiczny	03-031-1B
L-alanylo-L-glutamina (stabilna Glutamina) (200 mM)	Przemysł biologiczny	03-022-1B
Heracell™ 150i Inkubator CO2	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II	ThermoScientific Fisher	51025411
Chlorowodorek blastycydyny S	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) Modyfikowana, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Gibco	25300054
Hemacytometr metalizowany w kratkę Neubauera	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Zredukowana surowica Medium	Gibco	31985070
TransIT®- Odczynnik do transfekcji LT1	Mirus	MIR 2300
szklane szkiełka nakrywkowe, grubość #1, średnica 12 mm okrągłe	szkło Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poli-D-lizyna (PDL)	Corning	354210
Woda, klasa kultury komórkowej	Przemysł biologiczny	03-055-1A
Hyklalat doksycykliny	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Kapsaicyna	Tocris	462
Olympus IX70 Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	b.a
Lambda DG-4 Przełącznik długości fali	Sutter Instruments	n.a
EXi Kamera do mikroskopii fluorescencyjnej niebieskiej	QImaging	n.a
Oprogramowanie do obrazowania współczynnika fluorescencji MetaFluor	Urządzenia molekularne	n.a
Cienkościenne rurki borokrzemianowe	Instrumenty Sutter	B150-110-7,5HP
Standardowe rurki borokrzemianowe	Instrumenty Sutter	B150-86-7,5HP
Bezwodny dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	276855
P1000 ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
System perfuzji ValveBank	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Niskoszumowy system akwizycji danych	Molecular Devices	b.a
Axopatch 200B Wzmacniacz	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Oprogramowanie	Urządzenia molekularne	b.a
mikromanipulator	Sutter Instruments	MP-225