Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

20.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55372

⸱

14 kwietnia 2017

 , 
1Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, 2Institute for Biochemistry I, Medical School of University of Cologne

W tym artykule

Podsumowanie

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Streszczenie

Ograniczona dostępność odpowiednich modeli in vitro, które mogą wiarygodnie reprezentować złożony rozwój ludzkiego mózgu, jest znaczącym wąskim gardłem, które ogranicza przełożenie podstawowych badań nad mózgiem na zastosowanie kliniczne. Podczas gdy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zastąpiły etycznie wątpliwe ludzkie embrionalne komórki macierzyste, badania różnicowania neuronów oparte na iPSC pozostają opisowe na poziomie komórkowym, ale nie dostarczają odpowiednio szczegółów, które można uzyskać ze złożonej, trójwymiarowej ludzkiej tkanki mózgowej.

Ta luka jest teraz wypełniona dzięki zastosowaniu pochodzących z iPSC, trójwymiarowych organoidów mózgowych, "Mózgi w naczyniu", które modelują wiele cech złożonego rozwoju ludzkiego mózgu. W tym miejscu opisano metodę generowania 3D organoidów mózgowych pochodzących z iPSC. Organoidy mogą pomóc w modelowaniu autosomalnej recesywnej pierwotnej małogłowia (MCPH), rzadkiego zaburzenia neurorozwojowego u człowieka. Powszechnie akceptowanym wyjaśnieniem wad rozwojowych mózgu w MCPH jest wyczerpanie puli nerwowych komórek macierzystych we wczesnych stadiach rozwoju ludzkiego mózgu, wada rozwojowa, która jest trudna do odtworzenia lub udowodnienia in vitro.

Aby zbadać MCPH, wygenerowaliśmy iPSC z fibroblastów pochodzących od pacjentów, które posiadają mutację w białku centrosomalnym CPAP. Analizując strefę komorową organoidów mózgowych 3D z małogłowiem, wykazaliśmy przedwczesne różnicowanie neuronalnych komórek progenitorowych. Te organoidy mózgowe 3D są potężnym systemem in vitro, który będzie odgrywał zasadniczą rolę w modelowaniu wrodzonych zaburzeń mózgu wywołanych przez neurotoksyczne chemikalia, neurotroficzne infekcje wirusowe lub dziedziczne mutacje genetyczne.

Wprowadzenie

Zaburzenia neurorozwojowe człowieka, takie jak małogłowie, mogą być słabo zbadane na modelach zwierzęcych ze względu na fakt, że ludzkie mózgi mają wydłużoną powierzchnię korową, co jest unikalną cechą różniącą się od zwierząt innych niż ludzie.

Ten aspekt sprawia, że rozwój ludzkiego mózgu jest złożonym procesem, który nie może być wystarczająco zbadany w systemie hodowli komórkowych in vitro 2D. Nowe techniki hodowli 3D umożliwiają generowanie organoidów podobnych do tkanek z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Różnicowanie in vitro pluripotencjalnych komórek macierzystych w hodowli zawiesinowej 3D pozwala na tworzenie różnych typów komórek w odpowiednim czasie i w sposób specyficzny dla regionu, dając początek zorganizowanej, warstwowej tkance1,2,3. Dzięki laboratoriom, które były pionierami technologii hodowli 3D i zdemistyfikowały złożoność tworzenia narządów, zaczynając od komórek macierzystych, opracowaliśmy solidną metodę generowania organoidów mózgowych, aby nakreślić wczesne zdarzenia rozwoju ludzkiego mózgu i modelować mikrocefalię in vitro1,2,3. Warto zauważyć, że zaadaptowaliśmy oryginalną metodę opracowaną przez Lancastera i wsp. do generowania organoidów mózgowych1. Metoda ta została zmodyfikowana zgodnie z naszymi wymaganiami eksperymentalnymi.

Celem badania przeprowadzonego przez Gabriela i wsp. było przeanalizowanie komórkowych i molekularnych mechanizmów utrzymania nerwowych komórek macierzystych podczas rozwoju mózgu. W tym celu przeprowadzono badanie mechanistyczne, analizując neuronalne komórki progenitorowe (NPC) w organoidach mózgowych 3D pochodzących od pacjenta z małogłowiem4. Ten pacjent był nosicielem mutacji w CPAP, konserwatywnym białku centrosomalnym wymaganym do biogenezy centrosomów5. Powszechnie akceptowaną hipotezą jest to, że małogłowie jest wynikiem wyczerpania puli NPC, a to może być spowodowane albo śmiercią komórki, albo przedwczesnym różnicowaniem1,6,7,8,9.

Analizując strefy komorowe (VZ) organoidów mózgowych mikrocefalii, wykazano, że znaczna liczba NPC ulega asymetrycznemu podziałowi komórek, w przeciwieństwie do organoidów mózgowych pochodzących od zdrowego dawcy4. Szeroko zakrojone analizy mikroskopowe i biochemiczne mikrocefalicznych organoidów mózgowych ujawniły nieoczekiwaną rolę CPAP w terminowym demontażu rzęsek4. W szczególności zmutowany CPAP jest związany z opóźnionym rozpadem rzęsek i opóźnionym ponownym wejściem w cykl komórkowy, co prowadzi do przedwczesnego różnicowania NPCs4. Wyniki te sugerują rolę rzęsek w małogłowie i ich udział w neurogenezie i kontroli wielkości mózgu10.

Pierwsza część tego protokołu to opis trzyetapowej metody generowania jednorodnych organoidów mózgowych. Jak wspomniano wcześniej, oryginalny protokół Lancaster został zaadaptowany i zmodyfikowany zgodnie z naszym celem1. Po pierwsze, ludzkie iPSC są hodowane w określonych warunkach wolnych od karmnika na matrycy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Ten krok pozwala uniknąć zmian w zależnych od karmiciela pluripotencjalnych kulturach komórek macierzystych. W tym protokole indukcja różnicowania neuronalnego w celu utworzenia nabłonka nerwowego rozpoczyna się bezpośrednio od iPSC. Pomijając etap tworzenia ciała zarodkowego (EB), różnicowanie neuronalne przebiega w bardziej kontrolowany i ukierunkowany sposób. Takie podejście ogranicza spontaniczne i nieukierunkowane tworzenie się innych warstw rozrodczych, takich jak mezoderma i endoderma. Dzięki zastosowaniu tego protokołu, neurosfery zawierające rozety nerwowe mogą zostać pobrane w 5 dniu w celu osadzenia matrycy EHS i hodowli zawiesiny stacjonarnej. Pożywka organoidowa używana w trzecim etapie naszego protokołu jest uzupełniana o dorsomorfinę i SB431542. Dorsomorfina jest małocząsteczkowym inhibitorem białka morfogennego kości (BMP) i hamuje SB431542 szlak sygnałowy TGFβ/aktywina/węzłowy. Połączenie tych czynników może promować różnicowanie neuronów skuteczniej niż sam kwas retinowy11,12,13,14.

Łącznie, te modyfikacje umożliwiają powtarzalne generowanie organoidów mózgowych, z minimalnymi różnicami między organoidami. Co ważne, metoda ta została zastosowana do solidnego generowania mikrocefalicznych organoidów mózgowych z iPSC pacjentów, które przenoszą mutacje w genach wpływających na centrosomy i dynamikę cyklu komórkowego.

Druga część tego protokołu zawiera instrukcje dotyczące przygotowania organoidów mózgowych do analizy i interpretacji wad komórkowych w małogłowie. Obejmuje to utrwalanie, kriosekcję, barwienie immunofluorescencyjne i konfokalną analizę mikroskopową. Protokół ten dostarczy czytelnikowi szczegółowego opisu oczekiwanych wyników oraz wskazówek dotyczących interpretacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generacja organoidów mózgowych (23 dni)

  1. Rozpoczęcie neuroektodermy (5 dni)
    UWAGA: Przed rozpoczęciem różnicowania należy wziąć pod uwagę następujące punkty. Metoda przeprogramowania (oparta na lentiwirusie, wirusie sendai, episomalnym lub mikroRNA itp.) w celu uzyskania ludzkich iPSC powinna być w idealnym przypadku taka sama dla wszystkich linii iPSC pacjenta i grupy kontrolnej. Dostępne są różne zestawy i instrukcje przeprogramowania oparte na opublikowanych protokołach15,16,17,18. Jakość ludzkich linii iPSC jest kluczem do osiągnięcia optymalnego zróżnicowania. Monitoruj morfologię kolonii i komórek za pomocą mikroskopu i weryfikuj pluripotencję, testując ekspresję markerów, takich jak Oct3/4, Nanog lub TRA-1-60.
    1. Hodowla ludzkich iPSC w warunkach wolnych od karmienia w pożywce A na szalce pokrytej matrycą Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).
      UWAGA: Hodować ludzkie iPSC bez karmienia i surowicy, aby utrzymać określone warunki hodowli i uniknąć dodatkowego etapu usuwania mysich embrionalnych komórek żywicielskich (MEF) przed rozpoczęciem różnicowania. Optymalna liczba pasaży dla ludzkich iPSC, aby rozpocząć różnicowanie, waha się od przejścia 15 po przeprogramowaniu do przejścia 70 ogółem. Podczas pasażowania należy odłączyć kolonie hiPSC w miarę agregacji komórek za pomocą odpowiedniego roztworu do odrywania komórek o niskim naprężeniu mechanicznym i pipety serologicznej o pojemności 2 ml w celu przeniesienia agregatów do nowego naczynia. Należy unikać dysocjacji na pojedyncze komórki, ponieważ może to wywołać różnicowanie i apoptozę w większości linii iPSC. Doniesiono, że długotrwałe, pojedyncze komórki mogą zwiększyć zmiany genomowe w ludzkich iPSC19,20. Należy unikać procedur oddzielania komórek, które wymagają etapu wirowania w celu usunięcia roztworu oddzielającego, ponieważ zmniejsza to ogólną żywotność iPSC. Należy regularnie badać wszystkie kultury pod kątem zanieczyszczeń mikrobiologicznych, w szczególności mykoplazmy, ponieważ może to wpłynąć na jakość iPSC i ich zdolność do różnicowania.
      1. Pokryj naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm matrycą EHS zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Rozmrozić podwielokrotność 1 x 106 ludzkich iPSC. Zasiać iPSC w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej pokrytym matrycą EHS i zawierającym 5 ml pożywki A (patrz tabela materiałów). Zmieniaj pożywkę codziennie i pasaż po 5 do 7 dniach, gdy komórki osiągną ~80% konfluencji.
        UWAGA: Przynajmniej raz przed rozpoczęciem różnicowania należy przejść przez rozmrożone iPSC przy 80% konfluencji przy użyciu standardowych metod, takich jak oderwanie kolonii bez enzymów21. Krótko mówiąc, usuń pożywkę iPSC, umyj komórki wstępnie podgrzanym w temperaturze 37 °C zmodyfikowanym podłożem Eagle's Medium: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco i inkubuj iPSC zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu odczynnika A (patrz tabela materiałów). Nie przekraczaj zalecanego czasu inkubacji, aby uniknąć dysocjacji na pojedyncze komórki. Ludzkie komórki iPS powinny być oderwane i unoszące się w powietrzu jako agregaty, a nie jako pojedyncze komórki. Następnie można je przenieść do nowych naczyń pokrytych matrycą EHS; na przykład agregaty iPSC z jednej czaszy 60 mm mogą być dystrybuowane do 4 nowych szalek 60 mm.
      3. Sprawdź obecność mykoplazmy za pomocą zestawu do wykrywania mykoplazmy zgodnie z instrukcjami producenta. Należy stosować wyłącznie iPSC wolne od mykoplazmy, ponieważ mykoplazma może zmieniać zdolność różnicowania iPSC.
    2. Zdysocjuj iPSC (80% konfluentu) i przygotuj zawiesinę jednokomórkową za pomocą odczynnika B.
      1. Umyj iPSC raz za pomocą wstępnie ogrzanego (37 °C) DMEM/F12.
      2. Dodać wstępnie podgrzany odczynnik B (np. 1 ml w naczyniu o średnicy 60 mm) i inkubować iPSC przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
      3. Przesuń 20 razy opuszkiem palca po boku i na dole naczynia, aby odłączyć iPSC. Sprawdź, czy komórki nie oderwały się pod mikroskopem.
      4. Odpipetować zawiesinę komórek w górę i w dół w naczyniu 5 razy za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml.
      5. Dodać 3 ml pożywki A, aby rozcieńczyć 1 ml odczynnika B i zebrać zawiesinę komórek w 15 ml probówce wirówkowej.
      6. Delikatnie odwirowywać iPSC (500 x g) przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
      7. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki B i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
        UWAGA: Należy pamiętać, że do ponownego zawieszenia należy używać wyłącznie podłoża B. Unikaj stosowania pożywki A, ponieważ zawiera ona zbyt wysokie stężenie bFGF, co może hamować różnicowanie.
    3. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 4,5 x 105 komórek na ml w pożywce B uzupełnionej inhibitorem kinazy białkowej związanej z 10 μM rho (Y-27632).
    4. Dodać 100 μl na studzienkę do nieprzylegającej, 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
      UWAGA: Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w zawiesinie, potrząsając probówką za każdym razem przed wyjęciem porcji 100 μl. Ważne jest, aby każda studzienka zawierała równoważną liczbę komórek, aby uzyskać neurosfery jednorodne pod względem wielkości i kształtu (okrągłe, określone powierzchnie).
    5. Delikatnie odwirować płytkę z komórkami o sile 500 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    6. Zmieniaj pożywkę codziennie, usuwając 50 μl i dodając 50 μl świeżej pożywki B do każdej studzienki przez następne 5 dni.

2. Osadzanie neurosfer w matrycy EHS (4 dni)

  1. Przygotuj pożywkę neurosferyczną, mieszając następujące elementy: mieszanina 1:1 DMEM/F12 i pożywki C (v/v), 1:200 (v/v) suplement 1, 1:100 (v/v) suplement 2 bez (w/o) witaminy A, 1:100 L-glutaminy, 0,05 mM aminokwasów endogennych (MEM), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1,6 g/l insuliny i 0,05 mM β-merkaptoetanolu.
  2. Zebrać neurosfery za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl za pomocą końcówki o średnicy ~2 mm, uprzednio przeciętej sterylnymi nożyczkami.
  3. Umieść neurosfery w odległości około 5 mm od siebie na folii parafinowej (3 x 3 cm2) w pustym naczyniu o średnicy 100 mm i ostrożnie usuń jak najwięcej pozostałego podłoża.
  4. Dodaj kroplę (7 μl) matrycy EHS na każdą pojedynczą neurosferę.
  5. Inkubuj krople matrycy EHS z neurosferami przez 15 minut w inkubatorze.
  6. Ostrożnie umyj neurosfery z filmu parafinowego, przepłukując je podłożem neurosfery. Do przepłukania należy użyć mikropipety o pojemności 1 ml i nowej szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 10 ml pożywki neurosferycznej.
  7. Inkubuj neurosfery przez następne 4 dni i dodaj 2 ml świeżej pożywki neurosferycznej w dniu 2,
    UWAGA: Upewnij się, że półki w inkubatorze są płaskie, aby neurosfery osadzone w matrycy EHS nie zlepiały się ze sobą po jednej stronie naczynia.

3. Organoidy w hodowli zawiesiny rotacyjnej (14 dni)

  1. Przygotować pożywkę z organoidów mózgowych, mieszając następujące elementy: mieszanina 1:1 DMEM/F12 i pożywki C (v/v), 1:200 (v/v) suplement 1, 1:100 (v/v) suplement 2 bez witaminy A, 1:100 L-glutamina, 0,05 mM MEM, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1,6 g/l insuliny, 0,5 μM dorsomorfina, 5 μM SB431542, i 0,05 mM β-merkaptoetanolu.
  2. Dodaj 100 ml pożywki z organoidów mózgowych do każdej kolby z kołpakami przez jej boczne ramiona i umieść je w inkubatorze w celu wstępnego ogrzania przez co najmniej 20 minut.
  3. Ustaw program mieszania przy 25 obr./min, zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Przed przeniesieniem neurosfer osadzonych w matrycy EHS do kolb obrotowych upewnij się, że wszystkie są oddzielone. Jeśli dwie lub więcej jest połączonych za pomocą matrycy EHS, rozdziel je, przecinając macierz łączącą skalpelem.
  4. Ostrożnie przenieść neurosfery osadzone w matrycy EHS do kolb obrotowych zawierających 100 ml pożywki organoidowej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml. Użyj bocznych ramion kolby obrotowej, aby przenieść neurosfery do kolby.
  5. Umieścić kolby przędzalnicze na magnetycznej platformie mieszającej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 ; jest to dzień 0 hodowli organoidów.
  6. Zmieniaj podłoże raz w tygodniu (lub częściej, gdy następuje zmiana koloru), usuwając połowę podłoża i dodając taką samą ilość świeżego podłoża.
    UWAGA: Wyjmując kolby obrotowe z inkubatora, należy odczekać 3-5 minut, aby organoidy opadły na dno kolby. Usunąć pożywkę, umieszczając szklaną końcówkę pipety (podłączoną do pompy) na powierzchni cieczy; Ostrożnie zassać pożywkę przez jeden boczny otwór/ramię kolby. Te manipulacje muszą być wykonywane pod maską laminarną.

4. Analiza organoidów mózgowych

  1. Utrwalanie organoidów
    1. Zebrać organoidy w 14 dniu hodowli w kolbie wirowej za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml (naciętej ~5 mm). Umieść je wszystkie w naczyniu o średnicy 60 mm i umyj je raz 5 ml ciepłego DMEM/F12 przez 3 minuty.
    2. Przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml z 500 μl ciepłego 4% paraformaldehydu (PFA).
      Ostrzeżenie: Podczas obchodzenia się z utrwalaczem PFA należy nosić ochronę skóry i oczu oraz pracować pod kapturem ochronnym.
    3. Umieść każdy organoid osobno w każdej probówce i mocuj je przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Nie mocuj organoidów dłużej niż 60 minut. Aby przesunąć organoidy, użyj pętli do zaszczepiania lub innego wygodnego urządzenia.
    4. Usunąć PFA i przemyć utrwalone organoidy dwukrotnie przez 10 minut każdy 1 ml PBS.
    5. Przechowywać organoidy w 1 ml PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 7 dni, do czasu dalszego użycia.
  2. Osadzanie organoidów do kriosekcji
    1. Usunąć PBS i dodać 1 ml 30% sacharozy do destylowanego roztworu wodnego na probówkę, aby odwodnić organoidy przed ich kriozamrożeniem; po dodaniu roztworu sacharozy organoidy powinny unosić się na powierzchni. Przechowywać organoidy przez noc w roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C; Następnego dnia organoidy powinny opaść na dno probówki.
      UWAGA: W razie potrzeby organoidy można przechowywać do 3-5 dni w temperaturze 4 °C w roztworze sacharozy.
    2. Wypełnij formę do próbek winylu 400 μl związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i użyj pętli inokulacyjnej, aby umieścić organoid w środku formy. Oznacz krawędź formy nazwą próbki.
    3. Zamrozić pleśń zawierającą organoidy w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.
    4. Szklane szkiełka kriodynamiczne pokryć 0,1% roztworem poli-l-lizyny (PLL) w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej i pozostawić szkiełka do wyschnięcia na 3 godziny. Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C i przed użyciem ogrzać je do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Powlekanie PLL jest ważnym krokiem, ponieważ zapobiegnie odpływaniu plasterków organoidu. Zebrać i przechowywać roztwór PLL w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Przed ponownym użyciem przefiltruj go strzykawką 0,22 μm i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej.
    5. Podziel kriomrożone organoidy na plastry o grubości 20-50 μm na szkiełkach kriodynamicznych pokrytych PLL22. Pozostaw szkiełka z sekcjami do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowywać skrawki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.

5. Barwienie immunofluorescencyjne skrawków organoidów

UWAGA: Dla ogólnej charakterystyki organoidów zaleca się barwienie za pomocą nestyny, markera progenitorowego neuronu i TUJ1, markera panneuronalnego. Jako dodatkowe przykłady opisano barwienie immunofluorescencyjne fosfo-wimentyną (p-Vim), która oznacza mitotyczne wierzchołkowe promieniste komórki glejowe, oraz Arl13b, dla rzęski. Aby przetestować apoptozę, użyj testu końcowej deoksynukleotydylotransferazy (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL). Podczas inkubacji umieść szkiełka w plastikowym pudełku, aby chronić je przed kurzem, światłem i wysychaniem.

  1. Rozmrażać szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć szkiełka dwukrotnie 200 μl PBS-glicyny (0,225 g glicyny w PBS) przez 3 minuty, aby wygasić autofluorescencję wywołaną przez PFA.
  3. Przepuszczalność skrawków za pomocą 200 μl 0,5% Triton X100/0,1% tween w roztworze PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj je dwukrotnie 200 μl roztworu PBS-glicyny przez 3 minuty.
  5. Inkubować je z 200 μl 0,5% żelatyny rybnej/0,1% Triton X100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, aby zablokować niespecyficzne wiązanie antygenu.
    UWAGA: Jeśli wymagany jest test TUNEL, należy go wykonać zgodnie z protokołem producenta. Rozpocznij od testu TUNEL przed wykonaniem barwienia immunologicznego, ponieważ może on zakłócać działanie przeciwciał drugorzędowych i gasić fluorofory, gdy jest stosowany później.
  6. Rozcieńczyć przeciwciała w roztworze blokującym w następujących stężeniach: nestyna, 1:200; p-Vim, 1:500; TUJ1, 1:200; Arl13b, 1:20; i przeciwciała drugorzędowe 1:1,000.
  7. Inkubować z 200 μl pierwszego przeciwciała pierwszorzędowego (np. gniazdyny) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Przemyć 3 x 3 min 200 μl roztworu blokującego.
  9. Rozcieńczyć pierwsze (anty-mysie 488) przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:1,000 w roztworze blokującym i inkubować szkiełko w 200 μl przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Od teraz zawsze chroń zjeżdżalnie przed światłem.
  10. Przemyć 3 x 3 min 200 μl roztworu blokującego.
  11. Inkubować z 200 μl następnego przeciwciała pierwszorzędowego (np. TUJ1) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  12. Przemyć 3 x 3 min 200 μl roztworu blokującego.
  13. Dodać 200 μl następnego przeciwciała drugorzędowego (anty-królika 647) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
  14. Przemyć 3 x 3 minuty 200 μl roztworu blokującego.
  15. Dodać 200 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) o stężeniu 30 nM w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu barwienia jądrowego.
  16. Przemyć 2 x 3 minuty 200 μl roztworu blokującego.
  17. Przemyć 1 x 1 min 200 μl wody destylowanej i pozostawić sekcje do wyschnięcia na 10-20 minut, aż nie będzie już widoczna żadna widoczna kropla wody.
  18. Zamontuj sekcje za pomocą medium do zatapiania. Przechowywać je w temperaturze 4 °C przed światłem przez okres do kilku tygodni.
  19. Kontynuuj analizę mikroskopową, aby zobrazować przegląd organoidu, strefy komorowej, prymitywnej płytki korowej i innych obszarów zainteresowania.
  20. Użyj mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym 63X i filtrami fluorescencyjnymi, dobranymi zgodnie z zastosowanymi przeciwciałami drugorzędowymi oznaczonymi barwnikiem fluorescencyjnym1,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Generowanie organoidów mózgu wymaga co najmniej trzech tygodni ciągłego hodowania (Rysunek 1A). Aby uzyskać powtarzalne wyniki, zalecamy, aby badacz dokumentował każdy krok i, co ważne, unikał jakichkolwiek zmian w składnikach pożywki, punktach czasowych oraz sposobie postępowania z komórkami. Poniżej przedstawiamy podsumowanie tego, jak ocenić, czy osiągnięto kluczowe etapy niezbędne do uzyskania organoidów wystarczającej jakości pod koniec eksperymentu. Tworzenie się ne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

MCPH jest złożonym zaburzeniem neurorozwojowym człowieka, którego nie można podsumować w modelach zwierzęcych in vivo lub w prostych metodach hodowli komórek ludzkich in vitro. Objawy kliniczne MCPH zaczynają pojawiać się w pierwszym trymestrze ciąży, kiedy rozpoczyna się wczesna neurogeneza. Tak więc organoidy mózgowe 3D stanowią niezawodny system eksperymentalny do modelowania rozwoju MCPH. Ponadto organoidy 3D ludzkiego mózgu są idealnym podejściem, ponieważ i) pozwalają na adaptację spektrum próbek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Fritza Thyssena (Az.10.14.2.152). Jesteśmy wdzięczni zakładowi zatapiania tkanek i centralnemu obiektowi mikroskopowemu CMMC. Jesteśmy wdzięczni za rozmowy i wsparcie techniczne udzielone przez członków Laboratorium Biologii Centrosomów i Cytoszkieletów. Dziękujemy Li Ming Gooi za korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-mysie 488InvitrogenA-11001Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L), Alexa Fluor 488
Anty-królik 647InvitrogenA-21245Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) drugorzędowe, Alexa Fluor 647
Arl13bproteintech17711-1-APARL13B królicze przeciwciało poliklonalne 
System CELLSPINIBS Integra Bioscience183001
DAPISigma-Aldrich, US32670dichlorowodorek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu; wielu dostawców
DMEM/F-12Gibco, USA31331093Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle: Mieszanka składników odżywczych F-12 
DorsomorphinSigma-Aldrich, USP5499Związek C; wielu dostawców
Podłoże do zatapianiaAppliChemA9011, 0100Mowiol; podłoże do zatapiania; wielu dostawców
Macierz Engelbretha-Holma-Sroja (EHS)Corning354277Matrigel z kwalifikacją hESC; Ważne: Żelatyna rybna z kwalifikacją hESC
 Sigma-Aldrich, USG7765-250MLŻelatyna ze skóry ryb zimnowodnych; wielu dostawców; autoklaw po dodaniu do PBS w celu rozpuszczenia i sterylizacji, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
GlycineAppliChemA1067,1000Glicyna do biologii molekularnej; wielu dostawców 
Pętla do zaszczepiania z igłą, jednorazowa (1 &mikro; L)Sigma Aldrich, USBR452201-1000EAwielu dostawców 
InsulinaSigma-Aldrich, USAI3536-100MGwielu dostawców
L-glutaminaGibco, USA25030081L-glutamina (200 mM)
MediumA Technologie komórek macierzystych#05850mTeSR1 (pożywka hiPSC)
Średnia pożywka BTechnologie komórek macierzystych#05835Pożywka do indukcji neuronów (NIM); pożywka różnicowania neuronalnego
Średnia CGibco, Stany Zjednoczone21103049Neural Basal Medium MEM
Gibco, US11140035MEM roztwór aminokwasów endogennych (100x)
Zestaw do wykrywania MycoAlert MycoAlertLonza, Szwajcaria#LT07-218Zestaw do wykrywania mykoplazmy; wielu dostawców
NestinNovus biologicznyNBP1-92717Mysie przeciwciało monoklonalne Nestin (4D11)
Paraformaldehyd (PFA)AppliChemA3813, 05004% w PBS, roztwór do przechowywania w temperaturze -20 & deg; C; UWAGA: Nosić ochronę skóry i oczu oraz pracować pod kapturem 
Tabletki PBSGibco, USA18912014Zobacz producenta i ostrego; s instrukcje; wielu dostawców
Penicylina-Streptomycyna (10.000 U/mL)Gibco, USA15140122Wielu dostawców
Roztwór poli-L-lizyny (PLL)Sigma-Aldrich, USP8920-100MLWielu dostawców
pVimMBLD076-3SFosfo-wimentyna (Ser55)
Odczynnik mAb A Technologie komórek macierzystych# 05872Uwaga do Protokołu 1.1.1.2; ReLSR (Bezenzymatyczny odczynnik do selekcji i pasażowania ludzkich komórek ES i iPS); Proszę postępować zgodnie z Manufactorer´ s protokołu; dostępne alternatywne produkty od wielu dostawców Odczynnik
B Sigma-Aldrich, USA6964-100MLRoztwór Accutase jest roztworem enzymatycznym do dysocjacji pojedynczych komórek; wielu dostawców; Protokół 1.1.2 "Enzymatyczny roztwór dysocjacji komórek"  
Kriostat badawczy Leica CM3050 SLeica biosystemsCM3050 SWielu dostawców
SB431542Selleckchem.comS1067Wielu dostawców
Kolba obrotowa 250 mlIBS Integra Bioscience182026
sacharozaAppliChemA4734, 1000Wielu dostawców
Szkiełka mikroskopowe Superfrost ultra plusThermo scientific, USAJ3800AMNZPreparaty powinny być oznaczone znakiem "+" i naładowane dodatnio
: Suplement 1Gibco, suplement17502048N-2 (100x)
Suplement 2 bez witaminy AGibco, suplement12587010 B-27 w USA (50x), bez witaminy A; wielu dostawców
Tissue-Tek CryomoldSakura, NL4565Wielu dostawców
Związek Tissue-Tek OCTSakura, NL4583Wielu dostawców
Triton X-100AppliChemA1388,0500Wielu dostawców
TUJ1Sigma-Aldrich, UST2200β-Tubulin III (poliklonalna królika)
Test TUNELPromega, USG3250Ślepy zaułek Fluorometryczny system TUNEL; wielu dostawców
Tween 20 dla biologii molekularnejAppliChemA4974,0500Wielu dostawców
wodoodporny arkuszBEMIS company, inc.PM996Parafilm " M”; wielu dostawców
Y-27632 Selleckchem.comInhibitor S1049ROCK (Y-27632 2HCL); wielu dostawców
β-merkaptoetanolGibco, USA313500102-merkaptoetanol (50 mM); wielu dostawców
US

Bibliografia

  1. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
  2. Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
  3. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  4. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
  5. Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
  6. Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
  7. Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
  8. Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986(2014).
  9. Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
  10. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
  11. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
  12. Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
  13. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  14. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
  15. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  17. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  19. Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
  20. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307(2015).
  21. Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646(2014).
  22. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
  23. Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
  24. Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
  25. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
  26. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
  27. Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
  28. Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
  29. Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
  30. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
  31. Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759(2016).
  32. Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
  33. Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
  34. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
  35. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  36. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
  37. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  38. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

R nicowanie iPSCmodelowanie mikroencefaliianaliza progenitor w neuronalnychobrazowanie strefy komorowejprotok kriosekcjonowaniahodowla w kolbie typu spinnerbarwienie immunofluorescencyjneiPSC pochodz ce od pacjent w
Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.