Artykuł metodologiczny

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

DOI:

10.3791/55381

⸱

7 września 2017

 ,  ,  , 
1Center for Translational Medicine Research and Development, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2Department of Orthopedic Surgery, Maastricht UMC+, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital RWTH, 4Research Laboratory for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekonstrukcja krytycznie dużych ubytków kostnych pozostaje poważnym problemem klinicznym z powodu słabej angiogenezy w rusztowaniach inżynierii tkankowej podczas naprawy, co powoduje brak wystarczającego dopływu krwi i powoduje martwicę nowych tkanek. Szybkie unaczynienie jest niezbędnym warunkiem przetrwania nowej tkanki i integracji z istniejącą tkanką gospodarza. Wytwarzanie naczyń krwionośnych de novo w rusztowaniach jest jednym z najważniejszych kroków w kierunku zwiększenia wydajności regeneracji kości, umożliwiając naprawę tkanki w przekształcenie jej w rusztowanie. Aby rozwiązać ten problem, stosuje się modyfikację genetyczną rusztowania biomateriałowego w celu przyspieszenia angiogenezy i osteogenezy. Jednak wizualizacja i śledzenie in vivo tworzenia się naczyń krwionośnych w czasie rzeczywistym i w trójwymiarowych (3D) rusztowaniach lub nowej tkance kostnej nadal stanowi przeszkodę dla inżynierii tkanki kostnej. Mikroskopia wielofotonowa (MPM) to nowatorska metoda obrazowania biologicznego, która może pozyskiwać dane wolumetryczne ze struktur biologicznych w sposób wysokorozdzielczy i minimalnie inwazyjny. Celem pracy była wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości kalwarycznej. Rusztowania PLGA/nHAp funkcjonalizowano w celu zapewnienia trwałego dostarczania genu czynnika wzrostu pdgf-b przenoszącego wektory lentiwirusowe (LV-pdgfb) w celu ułatwienia angiogenezy i poprawy regeneracji kości. W mysim modelu krytycznego ubytku kości z implantacją rusztowania obszary naczyń krwionośnych (BVA) w rusztowaniach PHp były znacznie wyższe niż w rusztowaniach PH. Dodatkowo ekspresja pdgf-b i genów związanych z angiogenezą, vWF i VEGFR2, odpowiednio wzrosła. Analiza mikrotomografii komputerowej wykazała, że tworzenie się nowych kości w grupie PHp znacznie się poprawiło w porównaniu z innymi grupami. Według naszej wiedzy jest to pierwszy raz, kiedy mikroskopia wielofotonowa została wykorzystana w inżynierii tkanki kostnej do zbadania angiogenezy w biodegradowalnym rusztowaniu 3D in vivo i w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kość jest wysoce unaczynioną tkanką, która kontynuuje przebudowę w ciągu życia osoby1. Szybka i skuteczna regeneracja kości dużych ubytków kostnych powstałych w wyniku urazu, braku zrostu, resekcji guza lub wad rozwojowych twarzoczaszki jest złożonym procesem fizjologicznym. Tradycyjne podejścia terapeutyczne stosowane do naprawy ubytków kostnych obejmują autoprzeszczep i implantację alloprzeszczepu, ale ich stosowanie wiąże się z kilkoma problemami i ograniczeniami, takimi jak ograniczona dostępność, znaczna zachorowalność na miejsce dawcze, wysokie ryzyko infekcji i odrzucenie immunologiczne gospodarza2,3. Jednak sztuczne przeszczepy kostne stanowią skuteczną alternatywę dla złagodzenia tych ograniczeń. Mogą być wykonane z materiałów biodegradowalnych, są łatwe do wytworzenia z odpowiednią wielkością porów i mogą być modyfikowane genetycznie4,5.

Obecnie, różne rusztowania inżynierii tkankowej są wykorzystywane do rozwoju kości z inżynierii tkankowej6,7. Aby skuteczniej indukować naprawę i regenerację kości, pojawiły się zmodyfikowane biomateriały w połączeniu z czynnikami wzrostu, które osiągnęły dobre wyniki8,9. Niestety, krótki okres półtrwania, łatwa do utraty aktywność i suprafizjologiczne dawkowanie czynników wzrostu dla skuteczności terapeutycznej ograniczają ich zastosowanie kliniczne10. Aby przezwyciężyć te problemy, wykazano, że dostarczanie genów czynnika wzrostu zamiast czynników wzrostu jest skutecznym podejściem do utrzymania bioaktywności w leczeniu wad i chorób kostnych11,12. Wektory wirusowe są obiecującymi narzędziami do regeneracji tkanek ze względu na ich wysoką skuteczność wyrażania13.

Wśród czynników wzrostu, w tym badaniu wybrano płytkowy czynnik wzrostu (PDGF-BB), ponieważ jest on nie tylko mitogenem i chemoatraktantem dla komórek mezenchymalnych i osteogennych, ale także stymulantem angiogenezy14,15. Wcześniejsze badania przedkliniczne i kliniczne wykazały, że PDGF-BB może bezpiecznie i skutecznie wspomagać naprawę kości w ubytkach kostnych przyzębia16,17. Ostatnie badania wykazały, że PDGF-BB stymuluje angiogenezę poprzez motywowanie migracji i proliferacji komórek śródbłonka in vivo18,19. Co więcej, PDGF-BB może również sprawić, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) będą zdolne do różnicowania się w komórki śródbłonka20, co dodatkowo podkreśla potencjalną rolę MSCs w neowaskularyzacji. Dlatego indukowanie de novo tworzenia naczyń krwionośnych w rusztowaniach za pomocą PDGF-BB jest ważnym krokiem w naprawie tkanki wyrosłej w rusztowania w inżynierii tkanki kostnej.

Gojenie wad kostnych to dynamiczny proces morfogenetyczny tkanek, który wymaga skoordynowanej osteogenezy i angiogenezy na pozycjach naprawczych21. Neoangiogeneza w wszczepionych rusztowaniach inżynierii tkankowej jest niezbędnym warunkiem wstępnym do zaopatrywania komórek w składniki odżywcze i tlen do wzrostu i przetrwania oraz do usuwania odpadów metabolicznych. Powszechnie stosowane metody obrazowania, w tym rentgenowska mikrotomografia komputerowa (microCT), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM), optyczna koherentna tomografia (OCT) i konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa, są stosowane zamiast badania histologicznego w celu uzyskania informacji o angiogenezie22,23. Jednak metody te napotykają różne przeszkody w wizualizacji i pomiarze neowaskulatury w rusztowaniach 3D w inżynierii tkanki kostnej. Mikroskopia wielofotonowa (MPM) jest stosunkowo nowatorską techniką obrazowania biologicznego, która ma wyraźną zaletę jednoczesnej wizualizacji komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej i otaczających sieci naczyniowych in vivo. Posiada wrodzoną zdolność trójwymiarowego obrazowania do głębokiej penetracji tkanek i powoduje niskie fotouszkodzenia. W związku z tym w ciągu ostatniej dekady MPM zyskał dużą uwagę w badaniach biomedycznych24, w tym w neurobiologii, immunologii i dynamice komórek macierzystych. Jest jednak prawie nie stosowany w badaniach ortopedycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami była zgodna z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych prowincji Guangdong. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone pod nadzorem i zgodą Komisji Etyki ds. Badań nad Zwierzętami, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences.

1. Produkcja lentiwirusów (LV)

  1. Sklonuj cDNA pdgf-b do lentiwirusowego wektora ekspresyjnego (pLenti6/5-eGFP lub LV-eGFP) w niestandardowym miejscu wielokrotnego klonowania za promotorem wirusa cytomegalii, używając miejsc restrykcyjnych Spe I i Sal I, aby skonstruować plazmid pLenti6/5-PDGFB-eGFP (LV-pdgfb)25.
  2. Wytwarzanie cząstek lentiwirusa (LV-pdgfb) z komórek HEK-293FT poprzez kotransfekcję z plazmidami pakującymi wirusa (pLP1, pLP2 i pVSV-G) przy użyciu standardowej metody fosforanu wapnia z chlorochiną (stężenie końcowe: 25 μM)25.
  3. Po 48 godzinach transfekcji zebrać i przefiltrować 500 ml supernatantu zawierającego wirusa za pomocą filtra (0,45 μm). Następnie należy zagęścić cząsteczki wirusa przez ultrawirowanie w temperaturze 89 000 x g przez 2 godziny. Zawiesić ponownie w 200 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Aby określić miano lentiwirusa, należy inkubować HEK293T komórek z seryjnie rozcieńczanym roztworem lentiwirusa przez 24 godziny i obliczyć miano lentiwirusa, jak opisano wcześniej25.

2. Produkcja drukowanych w 3D rusztowań PLGA/nHAp i immobilizacji LV

  1. Rozpuścić 20 g materiału PLGA (poliD,L-laktyd-ko-glikolid) w 20 ml 1,4-dioksanu, aby uzyskać jednorodny roztwór. Dodać 2 g nanosized HAp (nano-hydroksyapatyd) w proszku (nHAp) do roztworu; stosunek PLGA: nHAp powinien wynosić 10:1 (w/w).
  2. Wymieszany roztwór mieszać energicznie (prędkość mieszania: 1 500 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 16 godzin za pomocą mieszadła magnetycznego, aby uzyskać jednolitą pastę. Wytwórz go w porowatych rusztowaniach PLGA/nHAp za pomocą niskotemperaturowej drukarki 3D ze skomputeryzowaną dyszą, która osadza pastę warstwa po warstwie, od dołu do góry, zgodnie z wcześniej zaprojektowanym modelem26; Rozmiary porów rusztowań wahają się od 200 do 400 μm.
  3. Suszenie próżniowe liofilizacji rusztowań przez 48 godzin, aby jak najdokładniej usunąć rozpuszczalnik. Namocz rusztowania w 75% roztworze etanolu na 1 godzinę w celu sterylizacji i liofilizuj, aby uzyskać neutralne, aseptyczne rusztowania.
    UWAGA: Głównymi parametrami liofilizacji próżniowej są temperatura skraplania (°C) i stopień próżni (Pa). W próżni o stopniu 45 Pa rusztowania PLGA/nHAp liofilizowano próżniowo w temperaturze -78 °C przez 48 godzin w celu dokładnego usunięcia rozpuszczalnika.
  4. Dodać 10 μl cząstek LV (4,5 x 105) do każdego rusztowania PLGA/nHAp (4 mm x 4 mm x 2 mm) i inkubować rusztowania przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze, aby umożliwić adsorpcję.
  5. Po unieruchomieniu należy dwukrotnie przepłukać rusztowania PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek LV. Rusztowania pokryte cząstkami LV należy zamrozić w ciekłym azocie, ponownie liofilizować i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Kinetyka in vitro uwalniania cząstek LV z rusztowań i test aktywności transdukcji LV

  1. Inkubować rusztowania 3D (4 mm x 4 mm x 2 mm) przenoszące białko LV-zielonej fluorescencji (LV-eGFP, 4,5 x 105 cząstek LV) w 1 ml kompletnego DMEM w 2,0 ml fiolkach kriogenicznych w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 5 dni.
  2. Pobieraj 1 ml próbki co 12 godzin od 12 godzin do 120 godzin po inkubacji i zamień pożywkę. W każdym punkcie czasowym dodać 1 ml świeżej pożywki zamiast 1 ml pożywki inkubacyjnej.
  3. Użyj zebranych pożywek do transdukcji HEK293T komórek przez koinkubację przez 48 godzin. Zmierz liczbę bioaktywnych cząstek LV, określając liczbę komórek HEK293T GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej27.
    1. Przed transdukcją HEK293T komórek należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać HEK293T komórki PBS. Dodać zebrane podłoża zawierające lentiwirusa uwolnionego z rusztowań do studzienki (1 ml/basenik) i hodować z HEK293T komórkami przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.

4. Ocena in vitro migracji MSC (BMSC) pochodzących ze szpiku kostnego

  1. Przed testem migracji przygotuj BMSC wyrażające białko fluorescencyjne pomidora (BMSCS-T) i białko PDGF-BB (BMSC-P)28.
  2. Przeprowadzić test migracji BMSC z komorą Boydena przy użyciu 24-dołkowej płytki i filtrów poliwęglanowych o wielkości porów 8 μm.
    1. Umieścić 0,5 ml BMSC (5 x 104) transfekowanych LV wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego pomidora (BMSCS-T) w górnych komorach. Umieścić 0,5 ml BMSC (2 x 105) transfekowanych białkiem PDGF-BB (BMSC-P) z ekspresją LV w dolnych komorach.
  3. Włącz sześć grup do tego eksperymentu i dodaj 500 μl do dolnej komory każdej studzienki.
    A. Ślepa kontrola, tylko pożywka bez surowicy
    B. Kontrola FBS, pożywka uzupełniona 10% FBS
    C. Kontrola PDGF-BB, 4 ng/mL PDGF-BB w podłożu bez surowicy
    D. Grupa zasysająca PDGF-BB, przeciwciało poliklonalne PDGF-BB (4 ng/ml) i anty-PDGF-BB (4 ng/ml) w pożywce wolnej od surowicy
    E. Grupa BMSC, 2 x 105 BMSC w podłożu bez surowicy
    F. Grupa BMSCs-P, 2 x 105 BMSCs-P w pożywce wolnej od surowicy.
  4. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze. Następnie usuń migrowane komórki po stronie dolnej komory i zbierz je w celu ilościowego określenia liczby BMSC-T za pomocą cytometrii przepływowej.
    1. Usunąć migrowane komórki po stronie dolnej komory za pomocą skrobaka do komórek i ponownie zawiesić migrowane komórki za pomocą 2 ml PBS. Określ ilościowo liczbę migrowanych BMSC-T za pomocą cytometrii przepływowej29.

5. Opracowanie modelu krytycznego uszkodzenia kości łykciowej u myszy i przeszczep rusztowania

UWAGA: Samce myszy BALB/c (w wieku 7 tygodni) zostały zakupione w Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Guangdong, Chiny).

  1. Zapisz łącznie 42 samce myszy do eksperymentu z ubytkiem kości kalwarycznej. Losowo podziel myszy na trzy grupy, po czternaście w każdej grupie, które otrzymują następujące leczenie: Grupa A, bez implantów; Grupa B, wszczepione rusztowania PH (PLGA/nHAp); oraz wszczepione rusztowania PHp grupy C (PLGA/nHAp/LV-pdgfb).
  2. Znieczulić zwierzęta dootrzewnowym podaniem pentobarbitalu sodu (50 mg/kg). Usuń sierść pastą do depilacji i oczyść skórę głowy 75% roztworem alkoholu przed wykonaniem pierwszego nacięcia. Zamocuj głowę każdej myszy za pomocą instrumentu stereotaktycznego, aby utrzymać ją nieruchomo podczas operacji.
  3. Wykonaj wstępne nacięcie skalpelem, a następnie powiększ je nożyczkami, aby utworzyć 1-centymetrowe liniowe nacięcie skóry. Zeskrob okostną z kości czaszki, aby odsłonić powierzchnię kości czaszki za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.
  4. Użyj zadzioru trepanacyjnego, aby utworzyć defekt o średnicy krytycznej 4 mm po lewej stronie kalwarii30. Przeszczep rusztowanie w miejsce ubytku kostnego.
    UWAGA: Krytyczne defekty wielkości (CSD) były pierwotnie definiowane jako "najmniejsza rana śródkostna w określonej kości i gatunku zwierzęcia, która nie zagoi się samoistnie w ciągu życia zwierzęcia". W tym eksperymencie wada o średnicy 4 mm jest ubytkiem kości o krytycznym rozmiarze, zgodnie z poprzednim badaniem31,32.
  5. Użyj kleszczyków okulistycznych, aby delikatnie przesunąć okostną do tyłu, aby pokryć pole operacyjne. Zszyj naciętą skórę trzema szwami na cm.
  6. Wykonaj opiekę pooperacyjną. Podawać przeciwbólową buprenorfinę (0,1 mg/kg) w celu złagodzenia bólu. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej, aż zwierzę się obudzi. Następnie należy nakarmić zwierzęta pokarmem i wodą oraz rejestrować ich aktywność każdego dnia aż do końca testu. Uwaga: Analgezja może być podana przed zabiegiem w zależności od wytycznych lokalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami.

6. Obrazowanie in vivo angiogenezy w obrębie ubytku kostnego z MPM

UWAGA: Sprzężony z FITC 250 kD dekstran (10 mg/mL) w soli fizjologicznej został dożylnie wstrzyknięty myszom w celu uzyskania obrazów nowych naczyń krwionośnych o wysokim SNR (stosunek sygnału do szumu) zgodnie z poprzednim badaniem33. Należy pamiętać, że jest to procedura przetrwania.

  1. Zmontuj system mikroskopii wielofotonowej (MPM) do obrazowania dwufotonowej fluorescencji wzbudzonej (TPEF) i sygnału generacji drugiej harmonicznej (SHG).
  2. Znieczulić zwierzęta dootrzewnowym wstrzyknięciem pentobarbitalu sodu (50 mg/kg) i unieruchomić zwierzęta na płycie grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C przez cały czas trwania doświadczeń. Użyj 3,0% izofluranu w 100% tlenie, aby utrzymać zadowalające znieczulenie i analgezję podczas procesu obrazowania. Dootrzewnowo wstrzyknąć sól fizjologiczną (200 μl/zwierzę), aby zapobiec odwodnieniu przed obrazowaniem.
  3. Dostosuj femtosekundowy laser Ti-Sapphire do długości fali 860 nm. Utwórz obszar próbkowania o wymiarach 512 x 512 μm, skanując parę luster galvo i używając soczewki obiektywowej NA1.0 zanurzonej w wodzie, aby skupić wiązkę wzbudzenia w próbce i zebrać wstecznie rozproszony sygnał TPEF/SHG.
    UWAGA: Obrazowanie zostało przeprowadzone na domowym systemie obrazowania pod mikroskopem wielofotonowym (MPM). Podczas obrazowania femtosekundowy laser Ti-Sapphire został dostrojony do 860 nm jako optymalnej długości fali wzbudzenia. Wiązka laserowa została zeskanowana rastrowo na próbce za pomocą pary luster galwanometrycznych. Po przejściu przez zwierciadło dichroiczne o długości fali 685 nm, wiązka została skupiona na próbce przez obiektyw 20X NA1.0. Indukowane sygnały TPEF i SHG zostały zebrane przez ten sam cel. Sygnały zostały oddzielone od lasera wzbudzającego przez wspomniane wyżej zwierciadło dichroiczne i oczyszczone przez filtr krótkoprzepustowy 680 nm. Sygnały TPEF i SHG zostały zebrane przez wiązkę światłowodów i przewodzone do spektrografu. Detektor na spektrografie był liniowym układem lamp fotopowielaczy (PMT). Połączenie spektrografu i liniowych PMT dało możliwość rejestrowania sygnału w 16 kolejnych pasmach spektralnych, od 400 nm do 600 nm, w odstępach 12,5 nm. W związku z tym sygnały TPEF i SHG zostały wykryte w tym samym czasie i rozdzielone w domenach spektralnych. Ponadto do obrazowania 3D zastosowano silnik osiowy do kontrolowania głębokości obrazowania. Obszar każdego obrazu został ustawiony na 512 x 512 μm, a przedział głębokości został ustawiony na 2 μm (grupa kontrolna, 5 μm). Warto zauważyć, że 5 miejsc na każdym defektu zostało zobrazowanych w celu zebrania statystycznie istotnych danych, a wybrane miejsca obrazowania zostały rozmieszczone równomiernie i losowo wzdłuż defektu.
  4. Przeskanuj 5 miejsc na każdej wadze, aby zebrać statystycznie istotne dane do pomiaru formowania się naczynia.
    1. Używaj miejsc skanowania równomiernie i losowo rozmieszczonych wzdłuż defektu. W przypadku grupy kontrolnej pole widzenia (FOV) powinno obejmować zarówno pierwotny obszar kości, jak i krawędź ubytku, ale w przypadku grup PH i PHp należy mieć pole widzenia na wszczepionym rusztowaniu.
    2. Wykonaj 1-centymetrowe liniowe nacięcie skóry za pomocą skalpela i zszyj otwartą skórę do mocowania, aby odsłonić miejsce przeszczepu. Za pomocą strzykawki umieść kroplę wody między soczewką zanurzającą a przeszczepami, aby utworzyć szklankę wodną.
  5. Rejestruj stosy obrazów co 12 s przez 2 godziny obrazowania. Wyświetlaj i analizuj dane wolumetryczne za pomocą niestandardowego programu MATLAB i określaj ilościowo obszary naczyń krwionośnych za pomocą oprogramowania ImageJ34,35.

7. Analiza ekspresji genów pdgf-b i genów związanych z angiogenezą metodą RT-qPCR

UWAGA: PCR został przeprowadzony zgodnie ze zwykłymi krokami: 95 °C przez 30 s, 40 cykli po 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s. Krzywe topnienia po PCR potwierdziły specyficzność amplifikacji pojedynczego celu, a zmiana fałdowania interesującego genu w stosunku do β-aktyny została określona. Reakcja dla każdej próbki została przetestowana trzykrotnie.

  1. Zbierz wszczepione rusztowania i tkanki od myszy eksperymentalnych po 2, 4 i 8 tygodniach od operacji36; próbki grupy kontrolnej (n = 4), pobrane w tych samych punktach czasowych, powinny pochodzić z sąsiedniej tkanki kostnej.
    UWAGA: W każdym punkcie czasowym (2, 4 i 8 tygodni) myszy były poddawane eutanazji za pomocą wdychania CO2 . Rozwarstwić kalwarię, a następnie usunąć i zebrać wszczepione rusztowania z kalwarii.
  2. Użyj komercyjnego odczynnika, aby wyekstrahować całkowite RNA z każdej próbki zgodnie z protokołem producenta. Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji, aby dokonać odwrotnej transkrypcji RNA na cDNA zgodnie z protokołem producenta.
  3. Przeprowadzić ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu SYBR Green Detection System; startery są wymienione w Tabeli 1.
powiedział:
Elementarz(5'–3')
GenNaprzódOdwrócony
PDGFB powiedział:CATCCGCTCCTTTGATGATCTTGTGCTCGGGTCATGTTCAAGT
vWF (Sieć wirwirowa)CTCTTTGGGGACGACTTCATCTCCCGAGAATGGAGAAGGAAC
VEGFR2GAAATGACACTGGAGCCTACA AGTCCATGCTGGTCACTAACAGAA G
β-aktynaGTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGGGCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT

Tabela 1: Zestawy Pimera.

8. Analiza mikrotomografii komputerowej regeneracji kości

  1. Eutanazja myszy za pomocą inhalacji CO2 po 8 tygodniach od operacji. W dobrze wentylowanym środowisku delikatnie umieść każdą mysz w czystej klatce dla myszy i wpompuj gaz CO2 do klatki, aby znieczulić myszy przed eutanazją.
  2. Wypreparuj czaszkę w celu zobrazowania mikrotomografią piersiową obszaru ubytku kostnego. W eksperymentach należy stosować następujące parametry skanowania: rozdzielczość 9 μm, filtr Al 0,5 mm, napięcie 50 kV i prąd 142 μA.
  3. Zrekonstruuj wszystkie dane obrazowe za pomocą komercyjnego oprogramowania dostarczonego przez firmę. Skalibruj skany za pomocą funkcji kalibracji oprogramowania CTAn.
    UWAGA: Umieść jednostkę Hounsfielda (HU) pod myszami podczas każdego skanowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cylindryczne porowate rusztowania PLGA/nHAp o wysokości 0,6 mm i średnicy 4 mm zostały wykonane na drukarce 3D. Morfologie rusztowań analizowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i mikrotomografii komputerowej. Rysunek 1A przedstawia fotografię wszczepionego rusztowania. Mikrotomografia komputerowa wykazała, że ponad 85% porów miało rozmiary od 200 do 400 μm (ryc. 1B). Obrazowanie SEM wykazało, że powierzchnia rusztowania miała przybliżoną mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kość jest silnie unaczynioną tkanką o wyjątkowej zdolności do ciągłego gojenia i przebudowy przez całe życie jednostki1. Poziom unaczynienia jest ważny dla osteogenezy i naprawy defektów. Niskie unaczynienie ogranicza szerokie zastosowanie kliniczne kości inżynierii tkankowej. Konstruowanie silnie unaczynionej kości inżynierii tkankowej zgodnie z teorią biomimetyki stało się narzędziem do naprawy ubytków kostnych o dużych segmentach. Różnego rodzaju rusztowania są z powodzeniem stosowane do napraw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Shenzhen Peacock Program, Chiny (nr 110811003586331), Shenzhen Basic Research Program (No. JCYJ20150401150223631, Nie. JCYJ20150401145529020 i nie. JCYJ20160331190714896), Specjalny Program Badań Publicznych i Budowania Potencjału w Guangdong (nr 2015A020212030), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81501893), Narodowy Główny Chiński Program Badań Podstawowych (2013CB945503) oraz Program Innowacji SIAT dla Doskonałych Młodych Naukowców (Y5G010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poli(D,L-laktyd-ko-glikolid) (PLGA)SigmaP1941Stosunek L/G 75:25, MW 66000-107000
Nanocząstki hydroksyapatytuSigma702153Średnia średnica < 200 nm
Sól difosforanu chlorochinySigmaC6628
250-kD dekstran sprzężony z FITCSigmaFD250S
1,4-dioksanlingfeng, Szanghajskie0,45 mikrona
Merck Millipore CorporationSLHV033RB
PDGF-BB CdnaSino Biological, IncMZ50801-G
Mysie przeciwciało poliklonalne anty-PDGF-BB  BioVision, Inc5489-30T
PDGF-BB rekombinowane białko4489-50
Roztwór do transfekcji fosforanu wapniaPromega CorporationE1200
L-DMEMHyklonSH30021.01
DPBSHyclonSH30028.01
Penicylina-Streptomycyna, płynThermo Fisher Scientific
FBSThermo Fisher Scientific10099-141
Transwell Corning3422
Samce myszy BALB/cCentrum dla zwierząt w laboratorium medycznym Guangdong 
Pentobarbital sodu Merck1063180500
mikroskopiędomowej roboty w Instytucie Zaawansowanej Technologii w Shenzhen do wykrywania dwufotonowej wzbudzonej fluorescencji (TPEF) i sygnału generacji drugiej harmonicznej (SHG).
izofluranKeyuan, Shandong401750169
odczynnik TRIzolInvitrogen15596018
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)TakaraRR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)TakaraRR036B
Hematoksylina i eozynaBeyotimeC0105
ParafinaLeica& nbsp;RM2235
Ultrawirówka OPtima L-100XPBeckman CoulterL-100XP
Drukarka niskotemperaturowa TsinghuaDomowej roboty na uniwersytecie Tsinghua
Instrument LightCycler 480 Roche5815916001
microCTBruker1176
oprogramowanie komercyjneBruker
Buprenorfina
filtry Stericup 15140122 wielofotonową Uniwersytet

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
  2. Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
  3. Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
  4. Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
  5. Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
  6. Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  7. Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
  8. Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
  9. Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
  10. Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
  11. Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
  12. Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
  13. Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
  14. Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
  15. Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
  16. Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
  17. Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
  18. Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
  19. Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
  20. Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
  21. Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
  22. Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
  23. Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
  24. Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
  25. Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348(2011).
  26. Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
  27. Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
  28. Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
  29. Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
  30. Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
  31. Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
  32. Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
  33. Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
  34. Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4(2015).
  35. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  36. Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
  37. Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
  38. Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
  39. Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
  40. Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multiphoton MicroscopyAngiogenesis VisualizationPLGA nHAp ScaffoldCalvarial Bone DefectLentiviral Vector DeliveryIn Vivo ImagingBlood Vessel AreaFlow Cytometry AnalysisMicroCT Bone FormationGenetic Scaffold Modification

Powiązane artykuły