Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

19.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55390

⸱

5 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy model ludzkiej bariery krew-mózg, umożliwiający badanie transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Streszczenie

Wynaczynienie limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest kluczowe dla nadzoru immunologicznego. Związane z chorobą zmiany wynaczynienia limfocytów mogą powodować zmiany patofizjologiczne w OUN. Dlatego badanie migracji limfocytów do OUN jest ważne dla zrozumienia zapalnych chorób OUN i opracowania nowych podejść terapeutycznych. W tym artykule przedstawiamy model in vitro ludzkiej bariery krew-mózg do badania wynaczynienia limfocytów. Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (HBMEC) są zlewnie hodowane na porowatej wkładce transwell z politereftalanu etylenu, aby naśladować śródbłonek bariery krew-mózg. Funkcja bariery jest potwierdzona za pomocą immunohistochemii zonula occludens, pomiarów przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) oraz analizy przenikania niebieskiego Evansa. Model ten umożliwia badanie diapedezy rzadkich podzbiorów limfocytów, takich jak CD56,jasneCD16dim/- komórki NK. Ponadto można badać wpływ innych komórek, cytokin i chemokin, zmian związanych z chorobą i różnych schematów leczenia na zdolność migracyjną limfocytów. Na koniec można przeanalizować wpływ bodźców zapalnych, a także różnych schematów leczenia na barierę śródbłonkową.

Wprowadzenie

Migracja limfocytów z krwi do tkanek jest kluczowa dla nadzoru immunologicznego. Sekwencja specyficznych oddziaływań molekularnych zapewnia specyficzne dla miejsca wynaczynienie do jelita cienkiego, skóry, węzłów chłonnych, ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i innych tkanek1. Zmiany w migracji limfocytów są zaangażowane w patofizjologię wielu szeroko rozpowszechnionych chorób2. Migracja do OUN uprzywilejowanego immunologicznie jest ściśle regulowana i w związku z tym zmiany w tym procesie są zaangażowane w choroby związane z OUN, takie jak zapalenie mózgu i rdzenia3, zapalenie nerwu wzrokowego, udar mózgu i stwardnienie rozsiane (SM)2,4,5,6,7. Dlatego ważne jest, aby badać wynaczynienie limfocytów, aby lepiej zrozumieć patofizjologię choroby i opracować narzędzia do łagodzenia obciążenia chorobowego8,9,10,11,12.

Limfocyty migrują do OUN różnymi drogami. Opisano wynaczynienie przez żyłki pozakapilarne do przestrzeni podpajęczynówkowej przez barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy w obrębie splotu naczyniówkowego i przez barierę krew-mózg1,13,14,15. Migracja przez barierę krew-mózg odbywa się w wyniku interakcji limfocytów z komórkami śródbłonka14. W przeciwieństwie do komórek śródbłonka na obrzeżach, komórki śródbłonka OUN wyrażają duże ilości cząsteczek o ścisłym połączeniu, ściśle ograniczając w ten sposób ilość komórek i białek zdolnych do przekraczania bariery krew-mózg16. Stan zapalny powoduje rozluźnienie połączeń ścisłych i indukuje ekspresję cząsteczek adhezyjnych; w ten sposób zwiększając migrację limfocytów do OUN 1,17,18.

Wynaczynienie przez barierę krew-mózg jest procesem wieloetapowym. Limfocyty łączą się z komórkami śródbłonka, a następnie toczą się wzdłuż śródbłonka w procesie, w którym pośredniczą głównie selektyny1,15. Następnie, interakcje między chemokinami wydzielanymi przez śródbłonek a odpowiednimi receptorami chemokiny wyrażonymi na limfocytach indukują zmiany konformacyjne integryn, promując w ten sposób mocne przyleganie do komórek śródbłonka1. Wreszcie, limfocyty albo pełzają wzdłuż bariery śródbłonka przed przepływem krwi przed transmigracją do przestrzeni okołonaczyniowej, albo zatrzymują się natychmiast i bezpośrednio transmigrują w miejscu mocnego zrostu1,19,20. Wszystkie te etapy wynaczynienia limfocytów mogą być analizowane in vitro przy użyciu różnych technik21. Mikroskopia filmów poklatkowych służy do badania początkowego tetheringu i zwijania15. Testy adhezji dostarczają szczegółowych informacji na temat mocnego zatrzymania barier śródbłonkowych22. Testy transmigracji, jak pokazano tutaj, umożliwiają analizę transmigracji komórek odpornościowych21,23,24,25,26,27,28,29.

Korzystając z modelu ludzkiej bariery krew-mózg in vitro, mogliśmy ostatnio pokazać, że wyższa zdolność migracyjna jasnych komórek CD16CD16 dim/- NK w porównaniu do ich odpowiednikówCD56 dimCD16+ została odzwierciedlona przez dominację tego podzbioru komórek NK w przedziale dokanałowym21. W związku z tym nasza konfiguracja eksperymentalna wydaje się być odpowiednia do naśladowania sytuacji in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu człowieka (HBMEC)

  1. Powlekanie kolb do hodowli komórkowej
    1. Aby przygotować roztwór fibronektyny, dodać 10 mL PBS do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL. Dodać 150 µL fibronektyny i dokładnie wymieszać.
    2. Aby pokryć dno kolby do hodowli komórkowej T-25, dodać 2 mL roztworu fibronektyny. Inkubować kolbę przez co najmniej 3 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Kolby powleczone fibronektyną można przechowywać przez 2 tygodnie w 37 °C / 5% CO2.
  2. Wysiew i hodowla komórek HBMEC
    1. Odssać roztwór fibronektyny z dna kolby do hodowli komórkowej. Dodać 7,2 x 104 HBMEC/cm² zawieszonych w 6 mL medium ECM-b (= medium ECM-b uzupełnione o 5% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1% suplementu wzrostu komórek śródbłonka). Inkubować w 37 °C / 5% CO2. Codziennie kontrolować wzrost komórek za pomocą mikroskopu.
    2. Wymieniać medium co 3 dni. Zebrać lub pasażować komórki, gdy HBMEC osiągną około 80% konfluencji. Komórek HBMEC należy używać między 1. a 15. pasażem, aby uniknąć utraty właściwości fizjologicznych.
  3. Zbiór komórek HBMEC
    1. Przygotować roztwór accutase, mieszając accutase (1x) z PBS w stosunku 1:1. Przechowywać roztwór accutase w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
    2. Przenieść medium ECM-b z kolby do hodowli komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL. Przemyć HBMEC, dodając 5 mL PBS na dno kolby do hodowli komórkowej. Odssać PBS i powtórzyć etap przemywania jeszcze dwa razy.
    3. Dodać 2 mL podgrzanego roztworu accutase. Inkubować w 37 °C przez 2 min. Następnie resuspendować HBMEC, kilkukrotnie energicznie opukując kolbę do hodowli komórkowej. Odłączenie komórek kontrolować za pomocą mikroskopu.
    4. Medium ECM-b, wcześniej przechowywane w probówce 15 mL, dodać z powrotem do kolby do hodowli komórkowej, gdy tylko HBMEC zaczną się odłączać. Wielokrotnie płukać dno kolby, aż większość komórek HBMEC zostanie resuspendowana.
    5. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL. Wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Odrzucić nadsącz i resuspendować komórki w 1 mL medium ECM-b. Policzyć komórki i rozcieńczyć zawiesinę, aby uzyskać końcowe stężenie 3 x 105 HBMEC na mL medium ECM-b.

2. Przygotowanie wkładów do hodowli komórkowych

  1. Powlekanie wkładów do hodowli komórkowej
    Ważna uwaga: Należy unikać dotykania membrany wkładów do hodowli komórkowej.
    1. Do każdego wkładu do hodowli komórkowej (Rysunek 1A) oraz do jednego dołka 96-dołkowej płytki z płaskim dnem (dołek kontroli optycznej) należy dodać 100 µL roztworu fibronektyny (patrz 1.1.1). Inkubować przez co najmniej 3 h w temperaturze 37 °C. Po inkubacji odessać roztwór fibronektyny.
    2. Do wkładów do hodowli komórkowej oraz do dołka kontroli optycznej dodać 100 µL zawiesiny HBMEC. Do dolnej komory wkładów do hodowli komórkowej dodać 600 µl pożywki ECM-b. Inkubować przez 3–4 dni w temperaturze 37 °C / 5% CO2 aż do uzyskania integralności bariery (Rysunek 1B); wzrost komórek HBMEC w dołku kontroli optycznej należy weryfikować za pomocą oceny mikroskopowej. Uwaga: Nie zaleca się hodowli komórek powyżej czterech dni.
    3. Opcjonalnie: Aby zasymulować warunki zapalne, należy odessać pożywkę z dolnej komory i zastąpić ją pożywką ECM-b uzupełnioną o 500 U/mL IFN-γ/TNF-α na 24 h przed testem migracji.

3. Kontrola jakości z użyciem błękitu Evansa w dniu przeprowadzenia testu transmigracji

  1. Przygotowanie roztworu błękitu ewansa
    1. Aby przygotować mieszaninę PBS/B27, wymieszać 10 mL PBS z 200 µl suplementu B27 w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL. Roztwór zapasowy błękitu ewansa (20 mg/mL PBS) rozcieńczyć w stosunku 1:1 000 za pomocą PBS/B27.
  2. Analiza przepuszczalności błękitu ewansa
    1. Odessać medium z dolnej komory, a następnie z górnej komory wkładki do hodowli komórkowej zawierającej konfluencyjną monowarstwę HBMEC. Do wkładki do hodowli komórkowej dodać 100 µL roztworu błękitu ewansa.
    2. Do dolnej komory dodać 600 µL PBS/B27 i inkubować przez 60 min w temperaturze 37 °C / 5% CO2. Ostrożnie wyjąć wkładkę do hodowli komórkowej za pomocą pęsety.
  3. Pomiar błękitu ewansa
    1. Usunąć PBS/B27 z dolnej komory i przenieść po 100 µL do dwóch studzienek czarnej polistyrenowej płytki 96-dołkowej o płaskim dnie. Włożyć płytkę do czytnika płytek Tecan Infinite M200 Pro i wyznaczyć optymalną pozycję z.
    2. Zmierzyć wzbudzenie błękitu ewansa przy użyciu odpowiednich ustawień (na przykład: wzbudzenie: 620 nm, emisja: 680 nm, szerokość pasma wzbudzenia: 9 nm, szerokość pasma emisji: 20 nm, wzmocnienie 175x, 25 błysków, czas całkowania: 20 µs).
    3. Aby określić funkcje barierowe HBMEC, porównać uzyskane dane z krzywą wzorcową przedstawiającą przenikanie błękitu ewansa przez HBMEC w różnych punktach czasowych po wysianiu komórek (Rycina 1B, prawa).

4. Test migracji

  1. Przygotowanie mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC).
    1. Do probówki wirówki o pojemności 15 mL dodać 10 mL RPMI oraz 200 µL suplementu B27. Policzyć PBMC i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min. Resuspendować PBMC do końcowego stężenia 5 x 106 komórek/mL RPMI/B27.
  2. Przygotowanie testu migracji
    1. Odssać medium z dolnej, a następnie z górnej komory wkładów do hodowli komórkowych zawierających konfluencyjne monowarstwy HBMEC (Rycina 1A). Dla każdego dawcy dodać 100 µL zawiesiny PBMC do wkładów do hodowli komórkowych oraz do jednego dołka płytki 24-dołkowej (kontrola in vitro).
    2. Dodać 600 µL RPMI/B27 do dolnej komory wkładów do hodowli komórkowych oraz 500 µL do PBMC w kontroli in vitro i inkubować przez 6 h w 37 °C / 5% CO2.
  3. Zbiór zmigrowanych PBMC
    1. Wyjąć wkład do hodowli komórkowej za pomocą pęsety i ostrożnie wypłukać dno 400 µL PBS, nie dotykając membrany. Wyrzucić wkład do hodowli komórkowej.
    2. Do dolnej komory wkładu do hodowli komórkowej oraz do kontroli in vitro dodać 20 µL fluorosfer do liczenia przepływowego (około 1 000 kulek/µL) i dobrze wymieszać. Przenieść 1 mL otrzymanej zawiesiny PBMC do probówek do cytometrii przepływowej.

5. Cytometria przepływowa

  1. Przygotowanie próbek
    1. Odwiruj PBMC przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotuj roztwór przeciwciał, dodając przeciwciała sprzężone z fluorochromami do 100 µL buforu do cytometrii przepływowej (PBS/1% BSA/2 mM EDTA) na próbkę. Dla wyników przedstawionych poniżej na próbkę zużyto 1 µL CD4-FITC, 1 µL CD3-PerCP/Cy5.5, 1 µL CD56-PC7, 1 µL CD8-A700 oraz 1 µL CD16-A750.
    3. Resuspenduj PBMC w 100 µL roztworu przeciwciał i inkubuj przez 30 min w temperaturze 4 °C.
    4. Dodaj 250 µL buforu do cytometrii przepływowej i odwiruj przy 300 x g przez 5 min.
  2. Nabywanie danych z próbek
    1. Resuspenduj PBMC w wymaganej ilości buforu do cytometrii przepływowej (zależnie od użytego cytometru przepływowego).
    2. Nabyj dane z barwionych PBMC, używając cytometru przepływowego z aktywnym detektorem w zakresie długości fali od 525 do 700 nm w celu wykrycia fluorosfer do zliczania komórek (wzbudzenie 488 nm, emisja 525 - 700 nm).
      (Kolejne kroki stanowią przykład w przypadku użycia cytometru przepływowego Gallios obsługiwanego oprogramowaniem Kaluza G: (1) Uruchom komputer. (2) Po pełnym załadowaniu systemu operacyjnego uruchom cytometr przepływowy, naciskając przycisk „cytometer on”. (3) Wczytaj odpowiedni protokół akwizycji, naciskając przycisk „open protocol”. (4) Wybierz wymagany protokół i kliknij „open”. (5) Powiel protokół dla każdej próbki, klikając prawym przyciskiem myszy na protokół widoczny w wirtualnym karuzeli, a następnie lewym przyciskiem na polu „duplicate”. (6) Opisz każdą próbkę na liście próbek. (7) Przenieś próbki na wskazane pozycje karuzeli i rozpocznij akwizycję.)
  3. Analiza próbek
    1. Otwórz uzyskane dane z cytometrii przepływowej, używając odpowiedniego oprogramowania. Określ liczbę interesujących podpopulacji dla PBMC, które migrowały, a także komórek z kontrolnych studni in vitro oraz fluorosfer do zliczania komórek, korzystając z odpowiedniego oprogramowania analitycznego.
      (Przykład strategii bramkowania podano w sekcji wyników (Rycina 1 C: Aby przeanalizować migrację subpopulacji komórek NK, najpierw wybierz limfocyty na wykresie rozproszenia bocznego (SSC) względem rozproszenia przedniego (FSC). Następnie limfocyty są wyświetlane na wykresie CD3 względem CD56 i wybierane są komórki NK CD56+CD3-. Aby rozróżnić subpopulacje komórek NK, komórki NK są wyświetlane na wykresie CD56 względem CD16 i wybierane są komórki NK CD56brightCD16dim/- oraz CD56dimCD16+. Dodatkowo, fluorosfery do zliczania komórek są wybierane z wykresu FSC względem SSC, a następnie wyświetlane na wykresie kanału z emisją między 525 a 700 nm względem czasu w celu określenia ich liczby.)
    2. Aby obliczyć całkowitą liczbę komórek dla każdej próbki, znormalizuj wykrytą liczbę komórek za pomocą fluorosfer do zliczania komórek:
      Wzór na ilościowe oznaczenie komórek; równanie dla zliczania komórek przy użyciu cytometrii przepływowej, referencja fluorosfery.
    3. Wyznacz procent zmigrowanych komórek jako stosunek całkowitej liczby komórek zmigrowanych do całkowitej liczby komórek w kontroli in vitro .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazujące transmigrację subpopulacji komórek NK i limfocytów T z wykorzystaniem ludzkiego modelu bariery krew-mózg (Rycina 1A). Integralność monowarstwy HBMEC została potwierdzona poprzez barwienie cząsteczki białek połączeń ścisłych ZO-1, pomiary transendotelialnej oporności elektrycznej (TEER) oraz przenikanie błękitu Evansa (Rycina 1B). Po 3 - 4 dniach hodowli HBMEC wykazywały ekspresję białka połączeń ścisłych ZO-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiamy technikę badania transmigracji limfocytów przez barierę krew-mózg człowieka. Analiza in vitro migracji limfocytów do OUN jest ważna dla zbadania podstawowych procesów wynaczynienia limfocytów, potencjalnych zmian związanych z chorobą i nowych podejść terapeutycznych.

Możliwych jest kilka modyfikacji modelu bariery krew-mózg. Na przykład komórki z górnego przedziału mogą być analizowane w celu zbadania składu populacji komórek niemigrowanych. Ponadto leczen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor (autorzy) zadeklarował następujące potencjalne konflikty interesów w odniesieniu do badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu: A.S.-M. i U.B. nie ujawniają żadnych informacji finansowych. T. S.-H. otrzymał od firmy Biogen koszty podróży i konferencji. N.S. otrzymał honoraria prelegentów i rad doradczych od firm Biogen i Novartis Pharma, a także zwrot kosztów podróży od firmy Biogen. H.W. otrzymał wynagrodzenie za zasiadanie w Naukowych Radach Doradczych/Komitetach Sterujących dla Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis i Sanofi-Genzyme. Otrzymał również honoraria prelegentów i wsparcie w podróżach od Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis i Sanofi-Genzyme. Jako konsultant otrzymał wynagrodzenie od firm Biogen, Merck Serono, Novartis i Sanofi-Genzyme. Firma H.W. otrzymała wsparcie badawcze od firm Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany i Sanofi US. C.C.G. otrzymało honoraria prelegentów i zwrot kosztów podróży za udział w spotkaniach od Genzyme, Novartis Pharma GmbH i Bayer Health Care.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte przez Collaborative Research Centre CRC TR128 "Inicjacja/Efektor kontra mechanizmy regulacyjne w stwardnieniu rozsianym-Postęp w kierunku walki z chorobą" (Projekt A9 do H.W. i C.C.G., projekt B1 do N.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBSGibco14190-094bez CaCl2 lub MgCl2
Fibronektyna 1 mg/mlSigmaF1141-5MGz osocza bydlęcego
Greiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
Penicylina/StreptomycynaScienCell1001-b
Suplement na wzrost komórek śródbłonkaScienCell1001-b
TranswellCorning3472przezroczysty, średnica 6,5 mm, 3,0 & Mikro; m Rozmiar porów
96-dołkowa płaska płyta dolnaCorning3596
Evans blueSigmaE2129-10Groztwór podstawowy: 1 g/50 ml PBS
B27Gibco17504-04450x skoncentrowany
Infinite M200ProTecan
96-dołkowa płaska płytka dolnaGreiner BioOne675086
48-dołkowaCorning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Liczba przepływów FluorosferyBeckman Coulter7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
Gallios 10-kolorowy cytometr przepływowyBeckman Coulter
Kaluza 1.5aBeckman Coulter
TNF-&alfa;Peprotech300-01A
IFN-γPeprotech300-02
CD3-PerCP/Cy5.5Biolegend300430klon UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692klon N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330klon 3G8
CD4-FITCBiolegend300506klon RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332klon B9.11
z kolby do hodowli komórek T-25

Bibliografia

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24(2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160(2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ludzkie mikro naczyniowe komórki śródbłonka mózgutransendoteliczny opór elektrycznyprzenikanie błękitu Ewansaanaliza cytometrycznakomórki NK CD56bright CD16diminterferon gamma TNF alfaizolacja frakcji naczyniowejtkanek okołonaczyniowychprzygotowanie wkładki do hodowli komórkowej
Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.