Artykuł metodologiczny

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

DOI:

10.3791/55390

⸱

5 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy model ludzkiej bariery krew-mózg, umożliwiający badanie transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wynaczynienie limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest kluczowe dla nadzoru immunologicznego. Związane z chorobą zmiany wynaczynienia limfocytów mogą powodować zmiany patofizjologiczne w OUN. Dlatego badanie migracji limfocytów do OUN jest ważne dla zrozumienia zapalnych chorób OUN i opracowania nowych podejść terapeutycznych. W tym artykule przedstawiamy model in vitro ludzkiej bariery krew-mózg do badania wynaczynienia limfocytów. Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (HBMEC) są zlewnie hodowane na porowatej wkładce transwell z politereftalanu etylenu, aby naśladować śródbłonek bariery krew-mózg. Funkcja bariery jest potwierdzona za pomocą immunohistochemii zonula occludens, pomiarów przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) oraz analizy przenikania niebieskiego Evansa. Model ten umożliwia badanie diapedezy rzadkich podzbiorów limfocytów, takich jak CD56,jasneCD16dim/- komórki NK. Ponadto można badać wpływ innych komórek, cytokin i chemokin, zmian związanych z chorobą i różnych schematów leczenia na zdolność migracyjną limfocytów. Na koniec można przeanalizować wpływ bodźców zapalnych, a także różnych schematów leczenia na barierę śródbłonkową.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja limfocytów z krwi do tkanek jest kluczowa dla nadzoru immunologicznego. Sekwencja specyficznych oddziaływań molekularnych zapewnia specyficzne dla miejsca wynaczynienie do jelita cienkiego, skóry, węzłów chłonnych, ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i innych tkanek1. Zmiany w migracji limfocytów są zaangażowane w patofizjologię wielu szeroko rozpowszechnionych chorób2. Migracja do OUN uprzywilejowanego immunologicznie jest ściśle regulowana i w związku z tym zmiany w tym procesie są zaangażowane w choroby związane z OUN, takie jak zapalenie mózgu i rdzenia3, zapalenie nerwu wzrokowego, udar mózgu i stwardnienie rozsiane (SM)2,4,5,6,7. Dlatego ważne jest, aby badać wynaczynienie limfocytów, aby lepiej zrozumieć patofizjologię choroby i opracować narzędzia do łagodzenia obciążenia chorobowego8,9,10,11,12.

Limfocyty migrują do OUN różnymi drogami. Opisano wynaczynienie przez żyłki pozakapilarne do przestrzeni podpajęczynówkowej przez barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy w obrębie splotu naczyniówkowego i przez barierę krew-mózg1,13,14,15. Migracja przez barierę krew-mózg odbywa się w wyniku interakcji limfocytów z komórkami śródbłonka14. W przeciwieństwie do komórek śródbłonka na obrzeżach, komórki śródbłonka OUN wyrażają duże ilości cząsteczek o ścisłym połączeniu, ściśle ograniczając w ten sposób ilość komórek i białek zdolnych do przekraczania bariery krew-mózg16. Stan zapalny powoduje rozluźnienie połączeń ścisłych i indukuje ekspresję cząsteczek adhezyjnych; w ten sposób zwiększając migrację limfocytów do OUN 1,17,18.

Wynaczynienie przez barierę krew-mózg jest procesem wieloetapowym. Limfocyty łączą się z komórkami śródbłonka, a następnie toczą się wzdłuż śródbłonka w procesie, w którym pośredniczą głównie selektyny1,15. Następnie, interakcje między chemokinami wydzielanymi przez śródbłonek a odpowiednimi receptorami chemokiny wyrażonymi na limfocytach indukują zmiany konformacyjne integryn, promując w ten sposób mocne przyleganie do komórek śródbłonka1. Wreszcie, limfocyty albo pełzają wzdłuż bariery śródbłonka przed przepływem krwi przed transmigracją do przestrzeni okołonaczyniowej, albo zatrzymują się natychmiast i bezpośrednio transmigrują w miejscu mocnego zrostu1,19,20. Wszystkie te etapy wynaczynienia limfocytów mogą być analizowane in vitro przy użyciu różnych technik21. Mikroskopia filmów poklatkowych służy do badania początkowego tetheringu i zwijania15. Testy adhezji dostarczają szczegółowych informacji na temat mocnego zatrzymania barier śródbłonkowych22. Testy transmigracji, jak pokazano tutaj, umożliwiają analizę transmigracji komórek odpornościowych21,23,24,25,26,27,28,29.

Korzystając z modelu ludzkiej bariery krew-mózg in vitro, mogliśmy ostatnio pokazać, że wyższa zdolność migracyjna jasnych komórek CD16CD16 dim/- NK w porównaniu do ich odpowiednikówCD56 dimCD16+ została odzwierciedlona przez dominację tego podzbioru komórek NK w przedziale dokanałowym21. W związku z tym nasza konfiguracja eksperymentalna wydaje się być odpowiednia do naśladowania sytuacji in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (HBMEC)

  1. Powlekanie kolb do hodowli komórkowych
    1. Aby przygotować roztwór fibronektyny, dodaj 10 ml PBS do 15 ml probówki wirówkowej. Dodaj 150 μl fibronektyny i dobrze wymieszaj.
    2. Aby przykryć dno kolby do hodowli komórek T-25, dodać 2 ml roztworu fibronektyny. Inkubować kolbę do hodowli komórkowych przez co najmniej 3 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Kolby pokryte fibronektyną można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze 37 °C / 5% CO2 .
  2. Wysiew i hodowla komórkowa HBMEC
    1. Odessać roztwór fibronektyny z dna kolby do hodowli komórkowych. Dodać 7,2 x 104 HBMEC/cm² zawieszone w 6 ml pożywki ECM-b (= ECM-b uzupełnione 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną i 1% suplementem na wzrost komórek śródbłonka). Inkubować w temperaturze 37 °C / 5% CO2 . Codziennie sprawdzaj wzrost komórek za pomocą mikroskopu.
    2. Zmieniaj podłoże co 3 dni. Zbierz lub podziel komórki, gdy HBMEC osiągnie około 80% konfluencji. HBMEC należy stosować między pasażem 1 a 15, aby uniknąć utraty właściwości fizjologicznych.
  3. Żniwa HBMEC.
    1. Przygotować roztwór akutazy, mieszając akutazę (1x) z PBS w stosunku 1:1. Przechowywać roztwór akutazy w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej do czasu dalszego użycia.
    2. Przenieść pożywkę ECM-b z kolby do hodowli komórkowych do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przemyć HBMEC, dodając 5 ml PBS na dno kolby do hodowli komórkowych. Odessać PBS i powtórzyć krok prania jeszcze dwa razy.
    3. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanego roztworu akutazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Następnie HBMEC są ponownie zawieszane poprzez kilkukrotne mocne stuknięcie w kolbę do hodowli komórkowych. Odwarstwienie komórek jest kontrolowane za pomocą mikroskopu
    4. Pożywkę ECM-b, przechowywaną uprzednio w probówce o pojemności 15 ml, dodaje się z powrotem do kolby do hodowli komórkowych, gdy tylko HBMEC zacznie się odłączać. Kilkakrotnie płukać dno kolby, aż większość HBMEC zostanie ponownie zawieszona.
    5. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki ECM-b. Zliczyć komórki i rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby uzyskać końcowe stężenie 3 x10,5 HBMEC na ml pożywki ECM-b.

2. Przygotowanie wkładek do hodowli komórkowych

  1. Powlekanie wkładek do hodowli komórkowych
    Ważna uwaga: Unikaj dotykania błony wkładek do hodowli komórkowych.
    1. Dodać 100 μl roztworu fibronektyny (patrz 1.1.1) do każdej wkładki do hodowli komórkowej (ryc. 1A) i do jednego dołka 96-dołkowej płytki z płaskim dnem (studzienka kontroli optycznej). Inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji odessać roztwór fibronektyny.
    2. Dodać 100 μl zawiesiny HBMEC do wkładek do hodowli komórkowych i studzienki kontroli optycznej. Dodać 600 μl pożywki ECM-b do dolnej komory wkładek do hodowli komórkowych. Inkubować przez 3 - 4 dni w temperaturze 37 °C / 5% CO2 aż do osiągnięcia integralności bariery (rysunek 1B), sprawdzić wzrost komórek za pomocą mikroskopowej oceny HBMEC w studzience kontroli optycznej. Uwaga: Nie zaleca się wzrostu komórek dłużej niż cztery dni.
    3. Opcjonalnie: Aby naśladować stany zapalne, należy odessać pożywkę z dolnej komory i zastąpić ją pożywką ECM-b uzupełnioną 500 U/ml IFN-γ/TNF-α 24 godziny przed testem migracji.

3. Kontrola jakości z Evans Blue w dniu testu transmigracyjnego

  1. Przygotowanie roztworu niebieskiego Evansa
    1. Aby przygotować roztwór PBS/B27, zmieszać 10 ml PBS z 200 μl suplementu B27 za pomocą 15 ml probówki wirówkowej. Rozcieńczyć roztwór podstawowy niebieskiego Evansa (20 mg/ml PBS) w stosunku 1:1 000 za pomocą PBS/B27.
  2. Test przepuszczalności niebieskiej Evansa
    1. Odessać pożywkę z dolnej komory, a następnie z górnej komory jednej wkładki do hodowli komórkowej zawierającej zlewającą się monowarstwę HBMEC. Dodać 100 μl niebieskiego roztworu Evansa do wkładki do hodowli komórkowej.
    2. Dodać 600 μl PBS/B27 do dolnej komory i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C / 5% CO2 . Ostrożnie wyjmij wkładkę do hodowli komórkowej za pomocą kleszczy.
  3. Niebieski pomiar Evansa
    1. Wyjąć PBS/B27 z dolnej komory i przenieść po 100 μl do dwóch dołków czarnej 96-dołkowej płaskiej płytki dennej z polistyrolu. Włóż płytkę do czytnika płytek Tecan Infinite M200 Pro i określ optymalne położenie z.
    2. Zmierz wzbudzenie niebieskiego Evansa za pomocą odpowiednich ustawień (na przykład: wzbudzenie: 620 nm, emisja: 680 nm, szerokość pasma wzbudzenia: 9 nm, szerokość pasma emisji: 20 nm, 175-krotne wzmocnienie, 25 błysków, czas całkowania: 20 μs).
    3. Aby określić funkcje bariery HBMEC, porównaj uzyskane dane ze standardową krzywą przedstawiającą przenikanie niebieskiego Evansa przez HBMEC w różnych punktach czasowych po wysiewie komórek (Rysunek 1B, po prawej).

4. Test migracji

  1. Przygotowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).
    1. Dodaj 10 ml RPMI do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 200 μl suplementu B27. Liczyć PBMC i odwirować komórki w stężeniu 300 x g przez 5 min. Ponownie zawiesić PBMC do końcowego stężenia 5 x 106 komórek/ml RPMI/B27.
  2. Przygotowanie testu migracji
    1. Odessać pożywkę z dolnego komory, a następnie górną komorę wkładek do hodowli komórkowych zawierających zbiegające się monowarstwy HBMEC (ryc. 1A). Na dawcę dodać po 100 μl zawiesiny PBMC do wkładek do hodowli komórkowych, a także do jednego dołka na 24-dołkowej płytce na (kontrola in vitro).
    2. Dodać 600 μl RPMI/B27 do dolnej komory wkładek do hodowli komórkowych i 500 μl do PBMC kontroli in vitro i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C / 5% CO2 .
  3. Odławianie migrowanych PBMC
    1. Wyjmij wkładkę do hodowli komórkowej za pomocą kleszczy i ostrożnie spłucz dno 400 μl PBS, nie dotykając membrany. Wyrzuć wkładkę do hodowli komórkowej.
    2. Dodać 20 μl fluorosfer o dużym przepływie (około 1 000 kulek/μl) do dolnej komory wkładki do hodowli komórkowej, a także do kontroli in vitro i dobrze wymieszać. Przenieść 1 ml otrzymanej zawiesiny PBMC do probówek do cytometrii przepływowej.

5. Cytometria przepływowa

  1. Przygotowanie próbki
    1. Odwirować PBMC przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować roztwór przeciwciała, dodając przeciwciała sprzężone z fluorochromem do 100 μl buforu cytometrii przepływowej (PBS/1% BSA/2 mM EDTA) na próbkę. Dla wyników przedstawionych poniżej użyto 1 μL CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP/Cy5.5, 1 μL CD56-PC7, 1 μL CD8-A700 i 1 μL CD16-A750 na próbkę.
    3. Ponownie zawiesić PBMC w 100 μl roztworu przeciwciała i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Dodać 250 μl buforu do cytometrii przepływowej i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
  2. Pobieranie próbek
    1. Ponownie zawiesić PBMC w wymaganej ilości (różni się w zależności od użytego cytometru przepływowego) bufora cytometrii przepływowej.
    2. Uzyskać barwiony PBMC za pomocą cytometru przepływowego z aktywnym detektorem o długości fali od 525 do 700 nm w celu wykrycia fluorosfer zliczających przepływ (wzbudzenie 488 nm, emisja 525 - 700 nm).
      (Poniższe kroki są przykładem, jeśli używany jest cytometr przepływowy Gallios obsługiwany za pomocą oprogramowania Kaluza G: (1) Uruchom komputer. (2) Gdy system operacyjny jest w pełni załadowany, uruchom cytometr przepływowy, naciskając przycisk "cytometr włączony". (3) Załaduj odpowiedni protokół akwizycji, naciskając przycisk "otwórz protokół". (4) Wybierz żądany protokół i wybierz "otwórz". (5) Zduplikować protokół dla każdej próbki poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy na protokół widoczny w wirtualnej karuzeli i lewym przyciskiem myszy na pole "duplikat". (6) Oznaczyć każdą próbkę w wykazie próbek. (7) Przenieś próbki do wskazanych pozycji karuzeli i rozpocznij akwizycję.)
  3. Analiza próbki
    1. Otwórz wynikowe dane cytometrii przepływowej za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Określ liczbę subpopulacji będących przedmiotem zainteresowania dla transmigrowanego PBMC, a także komórek ze studni kontrolnych in vitro i fluorosfer zliczających przepływ za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego.
      (Przykład strategii bramkowania podano w części wyników (Rysunek 1 C: Aby przeanalizować transmigrację podzbiorów komórek NK, najpierw wybierz limfocyty na wykresie kanału rozproszonego bocznego (SSC) w porównaniu z kanałem rozproszenia do przodu (FSC). Limfocyty są następnie wyświetlane na wykresie CD3 w porównaniu z CD56 i wybierane są komórki CD56 + CD3- NK. Aby rozróżnić podzbiory komórek NK, komórki NK są wyświetlane na wykresie CD56 w porównaniu z CD16 i wybierane sąjasnekomórki NK CD56CD16 dim/-, a takżeCD56 dimCD16 + NK. Ponadto, fluorosfery zliczające przepływ są wybierane z wykresu FSC w stosunku do SSC, a następnie wyświetlane na wykresie kanału o emisji między 525 a 700 nm w funkcji czasu w celu określenia ich liczby).
    2. Aby obliczyć całkowitą liczbę komórek w każdej próbce, znormalizuj wykrytą liczbę komórek za pomocą fluorosfer zliczających przepływ:
      figure-protocol-1
    3. Określić procent migrowanych komórek jako stosunek całkowitej liczby migrowanych komórek do całkowitej liczby komórek w kontroli in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazano reprezentatywne wyniki pokazujące transmigrację podzbiorów komórek NK i limfocytów T przy użyciu modelu bariery krew-mózg człowieka (Rysunek 1A). Integralność monowarstwy HBMEC potwierdzono poprzez barwienie cząsteczki ścisłego złącza ZO-1, pomiary transśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i przenikanie niebieskiego Evansa (Figura 1B). Po 3-4 dniach hodowli HBMEC wykazywał ekspresję cząsteczki o ścisłym połączeniu ZO-1 (ryc. 1B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy technikę badania transmigracji limfocytów przez barierę krew-mózg człowieka. Analiza in vitro migracji limfocytów do OUN jest ważna dla zbadania podstawowych procesów wynaczynienia limfocytów, potencjalnych zmian związanych z chorobą i nowych podejść terapeutycznych.

Możliwych jest kilka modyfikacji modelu bariery krew-mózg. Na przykład komórki z górnego przedziału mogą być analizowane w celu zbadania składu populacji komórek niemigrowanych. Ponadto leczen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor (autorzy) zadeklarował następujące potencjalne konflikty interesów w odniesieniu do badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu: A.S.-M. i U.B. nie ujawniają żadnych informacji finansowych. T. S.-H. otrzymał od firmy Biogen koszty podróży i konferencji. N.S. otrzymał honoraria prelegentów i rad doradczych od firm Biogen i Novartis Pharma, a także zwrot kosztów podróży od firmy Biogen. H.W. otrzymał wynagrodzenie za zasiadanie w Naukowych Radach Doradczych/Komitetach Sterujących dla Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis i Sanofi-Genzyme. Otrzymał również honoraria prelegentów i wsparcie w podróżach od Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis i Sanofi-Genzyme. Jako konsultant otrzymał wynagrodzenie od firm Biogen, Merck Serono, Novartis i Sanofi-Genzyme. Firma H.W. otrzymała wsparcie badawcze od firm Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany i Sanofi US. C.C.G. otrzymało honoraria prelegentów i zwrot kosztów podróży za udział w spotkaniach od Genzyme, Novartis Pharma GmbH i Bayer Health Care.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało wsparte przez Collaborative Research Centre CRC TR128 "Inicjacja/Efektor kontra mechanizmy regulacyjne w stwardnieniu rozsianym-Postęp w kierunku walki z chorobą" (Projekt A9 do H.W. i C.C.G., projekt B1 do N.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBSGibco14190-094bez CaCl2 lub MgCl2
Fibronektyna 1 mg/mlSigmaF1141-5MGz osocza bydlęcego
Greiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
Penicylina/StreptomycynaScienCell1001-b
Suplement na wzrost komórek śródbłonkaScienCell1001-b
TranswellCorning3472przezroczysty, średnica 6,5 mm, 3,0 & Mikro; m Rozmiar porów
96-dołkowa płaska płyta dolnaCorning3596
Evans blueSigmaE2129-10Groztwór podstawowy: 1 g/50 ml PBS
B27Gibco17504-04450x skoncentrowany
Infinite M200ProTecan
96-dołkowa płaska płytka dolnaGreiner BioOne675086
48-dołkowaCorning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Liczba przepływów FluorosferyBeckman Coulter7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
Gallios 10-kolorowy cytometr przepływowyBeckman Coulter
Kaluza 1.5aBeckman Coulter
TNF-&alfa;Peprotech300-01A
IFN-γPeprotech300-02
CD3-PerCP/Cy5.5Biolegend300430klon UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692klon N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330klon 3G8
CD4-FITCBiolegend300506klon RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332klon B9.11
z kolby do hodowli komórek T-25

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24(2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160(2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzkie mikro naczyniowe kom rki r db onka m zgutransendoteliczny op r elektrycznyprzenikanie b kitu Ewansaanaliza cytometrycznakom rki NK CD56bright CD16diminterferon gamma TNF alfaizolacja frakcji naczyniowejtkanek oko onaczyniowychprzygotowanie wk adki do hodowli kom rkowej

Powiązane artykuły