Po usunięciu z organizmu, tkanka neuronalna jest bardzo podatna na wpływ warunków środowiskowych, co prowadzi do ostatecznej degradacji tkanki po 6 - 8 godzinach. Dzięki unikalnej metodzie inkubacji, która ściśle monitoruje i reguluje zewnątrzkomórkowe środowisko tkanki, żywotność tkanek może być znacznie przedłużona przez >24 godziny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostre preparaty tkanki nerwowej, wycinki mózgu i całe retinal, zwykle mogą być utrzymywane tylko przez 6 - 8 godzin po sekcji. Ogranicza to czas eksperymentu i zwiększa liczbę zwierząt, które są wykorzystywane w jednym badaniu. To ograniczenie dotyczy w szczególności protokołów, takich jak obrazowanie wapnia, które wymagają długotrwałej wstępnej inkubacji z barwnikami nakładanymi w kąpieli. Wykładniczy wzrost bakterii w ciągu 3 - 4 godzin po pokrojeniu jest ściśle skorelowany z pogorszeniem zdrowia tkanek. W pracy opisano metodę ograniczania namnażania się bakterii w ostrych preparatach w celu utrzymania żywotności tkanki neuronalnej przez dłuższy czas (>24 godziny) bez konieczności stosowania antybiotyków, sterylnych procedur lub pożywek do hodowli tkankowych zawierających czynniki wzrostu. Poprzez cykliczne przepuszczanie płynu zewnątrzkomórkowego przez promieniowanie UV i utrzymywanie tkanki w niestandardowej komorze trzymania w temperaturze 15 - 16 °C, tkanka nie wykazuje różnicy we właściwościach elektrofizjologicznych ani sygnalizacji wapniowej przez wewnątrzkomórkowe barwniki wapniowe w >24 godziny po rozwarstwieniu. Metody te nie tylko wydłużą czas eksperymentu dla osób wykorzystujących ostrą tkankę neuronalną, ale także zmniejszą liczbę zwierząt wymaganych do osiągnięcia celów eksperymentalnych i ustanowią złoty standard dla ostrej inkubacji tkanki neuronalnej.
Wprowadzenie
Elektrofizjologia i obrazowanie funkcjonalne (wapń, barwniki wrażliwe na napięcie) to dwie najczęściej używane techniki eksperymentalne w neurobiologii. Preparaty do wycinków mózgu i cała masa siatkówki, które zostaną tutaj zbadane, zapewniają środki do badania właściwości elektrofizjologicznych i połączeń synaptycznych bez zanieczyszczenia środkami znieczulającymi lub zwiotczającymi mięśnie. Wycinki mózgu i cała siatkówka zachowują swoją integralność strukturalną, w przeciwieństwie do kultur lub homogenatów komórkowych, co pozwala na badanie określonych obwodów i sieci mózgowych1. Zapisy z izolowanej tkanki mają przewagę nad zapisami in vivo, ponieważ eliminowane są ruchy związane z biciem serca i oddychaniem. Co więcej, bezpośrednia wizualizacja pozwala na celowanie w określone klasy komórek i lokalne zastosowanie narzędzi farmakologicznych 2,3.
Zapisy patch-clamp i ładowanie barwnikiem wapniowym w całym siatkówce jest skomplikowane ze względu na istnienie wewnętrznej błony ograniczającej (ILM), która zakrywa warstwę komórek zwojowych siatkówki (RGC) i uniemożliwia bezpośredni dostęp do komórek. Zazwyczaj membrana ta jest zeskrobywana szklaną pipetą, aby umożliwić bezpośrednie nałożenie pipety krosowej i utworzenie gigaomowej uszczelki na pojedynczej komórce. Ponadto, barwniki wapniowe stosowane w kąpieli nie przenikają przez ILM i muszą być albo wstrzykiwane pod tę membranę4, transportowane wstecznie po wstrzyknięciu do nerwu wzrokowego5, albo elektroporowane przez tissue6. Ponadto, przy użyciu modelu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki u gryzoni, myszy rd/rd, ILM jest grubszy i bardziej nieprzepuszczalny. W tym przypadku używamy techniki usuwania ILM za pomocą trawienia enzymatycznego7, aby umożliwić zarówno wszechobecne ładowanie barwnikiem wapniowym, jak i bezpośredni dostęp do komórek zwojowych siatkówki w celu nagrań patch-clamps8.
Udane nagrania zarówno z wycinków mózgu, jak i całego siatkówki zależą od sekcji i inkubacji żywotnej tkanki neuronalnej. Zazwyczaj tkanka jest pobierana rano w dniu eksperymentu i inkubowana w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF) do momentu wykorzystania jej do nagrań. Zwykle tkanka pozostaje żywotna przez 6 - 8 godzin, ze znaczną degradacją po tym oknie czasowym. Jednak zarówno wycinki mózgu, jak i preparaty całych siatkówk zwykle wytwarzają więcej tkanki, niż można zarejestrować w tym krótkim czasie. W związku z tym tkanka jest często wyrzucana pod koniec dnia, a sekcja jest ponownie zakończona w kolejnych dniach. Oznacza to, że wykorzystywane jest inne zwierzę i powtarzane jest ~2 godziny ustawiania i preparowania/barwienia. Poniższy protokół opisuje metodę przedłużania życia tkanki neuronalnej o ponad 24 godziny, co oznacza, że wykorzystuje się mniej zwierząt i dostępnych jest więcej czasu na eksperymenty. Żywotność tkanek oceniano poprzez rejestrację właściwości elektrofizjologicznych i dynamiki wapnia, a właściwości te były nie do odróżnienia między <4 godzinami a >24 godzinami po sekcji.
Te wyniki wskazują, że nie tylko właściwości pojedynczej komórki są nienaruszone i funkcjonalne po długotrwałej inkubacji, ale aktywność sieci, oceniana za pomocą obrazowania wapniowego i zapisów elektrofizjologicznych, pozostaje niezmieniona >24 godziny po sekcji. Co więcej, wykazaliśmy, że barwniki wapniowe mogą pozostawać w komórkach przez dłuższy czas, nie powodując żadnych szkodliwych skutków. Zastosowanie tego protokołu pokazuje, że aktywność funkcjonalna neuronów w ostrej tkance neuronalnej może być utrzymywana przez długi czas, gdy środowisko zewnętrzne jest wysoce regulowane. Co więcej, ponieważ żywotność tkanek różni się znacznie w zależności od laboratoriów ze względu na różne protokoły inkubacji, metoda ta ustanawia złoty standard dla idealnych parametrów, które należy zastosować w celu zmniejszenia zmienności stanu zdrowia ostrej tkanki neuronalnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższy protokół opisuje przygotowanie tkanki neuronalnej myszy C57BL/6 i C3H/He (zwyrodniałej siatkówki), ale podobne techniki można zastosować do innych gatunków. Wszystkie zwierzęta były zdrowe i traktowane w standardowych warunkach temperatury, wilgotności, 12-godzinnego cyklu światło/ciemność, swobodny dostęp do pożywienia i wody oraz bez zamierzonych bodźców stresowych. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z komisją ds. opieki nad zwierzętami i etyki Uniwersytetu Western Sydney oraz zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i pielęgnacji zwierząt (Animal Research Authority #A9452, #A10396 i #A8967).
1. Przygotowanie plastra mózgu
- Znieczulić zwierzę przez wdychanie izofluranu (5%) i odciąć głowę za pomocą gilotyny dla gryzoni. Usuń mózg szybko, jak opisano wcześniej9 i umieść go w lodowatym roztworze fizjologicznym (aCSF) zawierającym (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 dekstroza i nasycone karbogenem (95% mieszaniny O2/5% CO2; 310 mOsm; pH 7,4).
- Wytnij plastry mózgu w obszarze zainteresowania o grubości 300 μm za pomocą wibrującego mikrotomu.
- Przenieś plastry do specjalnie zbudowanego systemu inkubacji, który ściśle monitoruje i kontroluje poziom pH (pH 7,2 - 7,4), przepływ karbogenu i temperaturę, jak opisano wcześniej10,11.
- Ustaw początkową temperaturę komory na 35 °C na 15 - 30 minut, a następnie powoli zmniejszaj do 15 - 16 °C, jak pokazano na rysunku 1C. Następnie inkubuj plastry w systemie inkubacji, aż będą potrzebne, do elektrofizjologii lub obrazowania.
UWAGA: Jeśli plastry mają być używane do obrazowania wapnia, wykonaj poniższe czynności przed schłodzeniem tkanki poniżej RT.
2. Przygotowanie całej siatkówki i usunięcie wewnętrznej błony ograniczającej
- Przygotuj całe cewki siatkówki w normalnych warunkach oświetlenia laboratoryjnego lub w słabym świetle czerwonym/podczerwonym.
- Poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i natychmiast wyłuszczyć oczy. Wykonaj małe nacięcie wzdłuż ora serrata i umieść w pożywce Amesa lub CSF zawierającym (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glukozy, 0,5 L-glutaminy i nasącz karbogenem (mieszanina 95% O2/5% CO2; ~300 mOsm; pH 7,4), w temperaturze pokojowej.
- Natychmiast usuń rogówkę, soczewkę i ciało szkliste, przecinając wzdłuż ora serrata małymi nożyczkami i usuwając soczewkę i ciało szkliste za pomocą kleszczy. Umieścić tkankę w systemie inkubacji w RT.
UWAGA: Tkanka siatkówki może być przechowywana w muszli ocznej, po powolnym obniżeniu temperatury do 15 - 16 °C, przez >24 godziny w systemie inkubacji, aż będzie potrzebna. - Aby usunąć ILM, przenieś muszlę oczną zawierającą siatkówkę do małego szklanego słoika zawierającego 30 U/ml papainy, 1 mM L-cystyny, 0,5 mM EDTA i 0,005% DNazy w roztworze soli Earl's Balanced (BSS) w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Nałóż 95% O2/5% CO2 na roztwór przez pokrywkę, ale nie bąbelkuj. W przypadku stosowania tkanek pochodzących od młodych zwierząt (<6 tygodni) roztwór należy rozcieńczyć do połowy mocy.
- Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, umieszczając tkankę w roztworze ovomukoid (10 mg/ml) i BSA (10 mg/ml) na 10 minut w Earl's BSS. Przed przeniesieniem do systemu inkubacji dokładnie umyć tkankę płynem mózgowo-rdzeniowym i obniżyć temperaturę do 15 - 16 °C.
- Utrzymuj tkankę siatkówki w muszli ocznej, aż będzie potrzebna. W celu przeniesienia do mikroskopu odizoluj siatkówkę od muszli ocznej i pokrój na 4 części żyletką. Jeśli wymagana jest cała siatkówka, wykonaj cztery małe nacięcia na obrzeżach siatkówki, aby mogła leżeć płasko.
UWAGA: W przypadku eksperymentów obrazowych, przed przeniesieniem do systemu inkubacji należy obciążyć barwnikami wapniowymi, patrz poniżej.
3. Utrzymanie tkanki w inkubatorze
- Umieść tkankę w głównej komorze zawierającej sondy do pomiarów pH i temperatury (rysunek 1A, B).
- Cyrkuluj CSF przez drugą komorę (komorę UVC, zbudowaną zgodnie z wcześniejszym opisem12) odizolowaną od głównej komory i wystawioną na działanie światła UVC o mocy 1,1 W (254 nm, lampa UV sterylizatora 5W/2P) w celu wypromieniowania bakterii unoszących się w roztworze (Rysunek 1A). Kontroluj czas światła UVC za pomocą programowalnego timera za pomocą losowej funkcji, która włącza się w godzinach wahających się od 15 do 26 minut co 15 - 30 minut, aby uniknąć nadmiernego nagrzewania się aCSF.
- Ustaw natężenie przepływu w komorze UVC na 12 ml/min, jak wcześniej raportowano12. Przykryj komorę UVC folią aluminiową, aby zapobiec świeceniu UVC na zewnątrz komory, które może uszkodzić tkankę neuronalną.
UWAGA: W przypadku tkanki siatkówki przystosowanej do ciemności nałóż niestandardową osłonę na główną komorę, aby wykluczyć światło. - Za pomocą pompy perystaltycznej należy przeprowadzić cyrkulację roztworu (aCSF) przez dwie komory oraz termoelektrycznej chłodnicy z zimną płytą Peltiera w celu schłodzenia lub ogrzania komory głównej do żądanych temperatur w zakresie 0 - 50 °C. Aby uzyskać optymalną inkubację tkanek, należy stosować temperaturę 15 - 16 °C dla długoterminowej żywotności.
4. Ładowanie barwnika wapniowego
- Wybierz barwniki wapniowe w oparciu o preferencje indywidualnego badacza. Tutaj używamy Fura-2AM, Fluo-8AM lub Fluo-4AM. Jednak metodę tę można zastosować również do innych barwników: rozpuścić barwniki wapniowe w DMSO do roztworu 1 mM i 1% kopolimerów blokowych (np. kwasu pluronowego-127) do końcowej objętości 50 μL i sonikować przez 10 min.
- Dodać roztwór do aCSF do końcowego stężenia 10 μM, 0,01% kopolimerów blokowych dla plasterków mózgu i 20 μM (siatkówka), 0,02% kopolimerów blokowych dla siatkówki. W siatkówkach (leczonych papainą) i wycinkach mózgu młodych zwierząt załadować do kąpieli na 45 minut w temperaturze 37 °C (Fura-2 AM) lub w temperaturze RT (Fluo-4 AM; Fluo-8 rano).
- W przypadku dorosłych zwierząt (>12 tygodni) pipetować barwniki (50 μl) bezpośrednio na wycinki mózgu i utrzymywać przez 75 minut, aby umożliwić lepszą penetrację barwnika do głębokich warstw.
- Aby zapewnić odpowiednie natlenienie zanurzonego plastra podczas inkubacji barwnika, należy przygotować szklaną komorę załadowczą z zamkniętą pokrywką (okrągły słoik o średnicy 2,5 cm, wysokości 3,5 cm) z barwnikami wapniowymi rozcieńczonymi w 2,5 ml aCSF. Natleniać w sposób ciągły 95% O2/5% CO2 . Nie bąbelkuj.
- Po załadowaniu barwnikiem przemyć tkankę płynem CSF i przenieść do systemu inkubacji, powoli zmniejszać temperaturę do 15 - 16 °C aż do użycia eksperymentalnego.
5. Zapisy elektrofizjologiczne i obrazowanie
- Umieścić tkankę w zanurzonej komorze rejestracyjnej pod mikroskopem i perfuzjonować natlenionym aCSF z szybkością przepływu 4 - 5 ml / min w temperaturze RT (~ 22 °C) lub fizjologicznej (~ 35 °C). Przytrzymaj tkankę na miejscu za pomocą specjalnie wykonanej "harfy", wykonanej z nylonowych lub złotych nici rozciągniętych i przyklejonych do kawałka złotego lub platynowego drutu w kształcie litery U.
- Dla elektrofizjologii:
- Przygotuj pipety rejestrujące ze szkła borokrzemianowego 1,5 mm (1,19 mm ID) za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać rezystancję końcową 5-6 MΩ.
- Napełnij pipetę 3 - 4 μl roztworu wewnętrznego, jak opisano wcześniej13 i zwizualizuj komórki w podczerwieni z kontrastem różnicowym zakłóceń (IR-DIC) za pomocą kamery CCD. Roztwór wewnątrzkomórkowy powinien być starannie dostosowany do każdego eksperymentu, aby osiągnąć wyniki eksperymentalne.
- Umieść pipetę, utrzymując nadciśnienie przyłożone przez port ssący na uchwycie pipety, na membranie komórki za pomocą mikromanipulatora. Ponieważ ILM został usunięty z siatkówki, nie jest wymagane wcześniejsze skrobanie błony. Gdy pipeta znajdzie się na kuwecie, zastosuj delikatne podciśnienie do pipety, aby uzyskać gigaomowe uszczelnienie. Następnie rozerwij błonę komórkową za pomocą krótkiego podciśnienia.
- Wykonaj zapisy cęgów prądowych lub napięciowych całego ogniwa przy użyciu standardowych technik, w zależności od potrzeb.
- Obrazowanie wapnia:
- Do obrazowania ratiometrycznego Fura-2 należy użyć ultraszybkiego przełącznika długości fali, aby zapewnić długości fal wzbudzenia 340 nm i 380 nm. Przepuszczaj światło emitowane z poszczególnych komórek przez filtr emisyjny 510 ±20 nm i rejestruj je za pomocą szybkiej kamery cyfrowej o wysokiej czułości.
- Dla pojedynczej długości fali wzbudzenia Fluo-4 należy przefiltrować światło wzbudzenia przez filtr pasmowy 460 - 490 nm i wyemitować światło przez filtr pasmowo-przepustowy 515 - 550 nm. Aby uzyskać najszybsze i najbardziej czułe nagrywanie, użyj szybkiej kamery cyfrowej, takiej jak. Uzyskaj obrazy zgodnie z wymaganiami.
- Zmierz zmiany fluorescencji w funkcji czasu albo dla pojedynczej długości fali (Fluo-4), albo przy użyciu metody stosunku długości fali (Fura-2), jak opisano wcześniej8,14.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ścisła regulacja obciążenia bakteryjnego oraz temperatury aCSF podczas inkubacji jest niezbędna dla zachowania żywotności tkanki neuronalnej. Można to zoptymalizować poprzez naświetlanie światłem UVC i utrzymywanie temperatury aCSF w zakresie 15 - 16 °C (Rysunek 1). Ponadto karta parametrów aCSF (APS; Rysunek 1C) zapewnia eksperymentatorowi zapis warunków środowiskowych (pH i temp.), stanowiąc tym samym złoty standard parametrów podczas inkubacji tkanki n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule opisano metodę inkubacji mającą na celu przedłużenie żywotności ostrej tkanki neuronalnej do obrazowania i eksperymentów elektrofizjologicznych, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do realizacji celów eksperymentalnych. Dwa główne procesy regulują degradację tkanki neuronalnej w czasie: i) zwiększony poziom bakterii i towarzyszący mu wzrost uwalnianej endotoksyny bakteryjnej oraz ii) ekscytotoksyczność, która następuje po traumatycznej procedurze krojenia10. Ponieważ o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Yossi Buskila i Paul Breen deklarują, że są współwłaścicielami PAYO Scientific Pty Ltd, firmy specjalizującej się w budowie systemów inkubacji dla ostrej tkanki nerwowej. Wszyscy pozostali autorzy nie zgłaszają żadnych interesów finansowych ani potencjalnych konfliktów interesów związanych z obecnym badaniem.
Podziękowania
Dziękujemy Colinowi Symonsowi i Jamesowi Wrightowi za pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte grantem zalążkowym (WSU) dla Y.B. oraz biurem innowacji na Western Sydney University. M.C. jest wspierany przez stypendium ARC (DECRA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Chlorek potasu | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-metylo-D-glukamina | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glukoza | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Fosforan sodu jednozasadowy | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Chlorek magnezu | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Chlorek wapnia | Sigma Aldrich | 223506 | |
| System dysocjacji papainy | Worthington | ||
| Dimetylosulfotlenek bezwodny | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Niska absorbancja UV* | Technologie życia | P-6867 | 20% roztwór w DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Mikrotom z ostrzem wibracyjnym | Leica Biosystem | VT1200 S | wyposażony w Leica' s Vibrocheck&handel; urządzenie pomiarowe |
| Stół antywibracyjny | Kinetic Systems Vibraplane | Wibrator 9100/9200 | |
| Mikroskop pionowy stolikowy | Olympus | BX51WI | |
| Obiektyw mikroskopowy | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Mikroskop Obiektyw | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Kamera | Andor | Ixon + | |
| Szybki przełącznik długości fal | Instrument | Sutter Lambda DG-4 | |
| Wzmacniacz z zaciskiem krosowym | Urządzenia molekularne | MultiClamp 700B | |
| System akwizycji danych | Urządzenia molekularne | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Ściągacz mikroelektrod | Sutter Instrument Co | P-97 | Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego |
| Komora nagrywająca/perfuzyjna | Warner Instruments | RC-40LP | Niskoprofilowe otwarte komory kąpielowe |
| Oprogramowanie Urządzenia molekularne | pClamp 10.2 | ||
| Oprogramowanie do obrazowania komórek na żywo Andor iQ | Andor | Andor iQ3 | |
| Payo Scientific BR26021976 | www.braincubator.com.au | ||
| Termoelektryczna chłodnica z zimną płytą Peltiera | TE Technology | CP-121 | |
| Regulator temperatury | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
Bibliografia
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396(2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588(2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
