Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia półwysokoprzepustowego testu migracji komórek na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek. Protokół ten jest szybką, prostą i ekonomiczną metodą tworzenia spójnych ran zadrapań na monowarstwie komórki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Urządzenie do wykonywania migracji komórek/gojenia ran w płytce 96-dołkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test migracji komórek/zranień jest powszechnie stosowaną metodą do badania migracji komórek i innych procesów biologicznych, takich jak angiogeneza i przerzuty nowotworowe. W tym teście komórki są hodowane w celu utworzenia zlewającej się monowarstwy, a mechaniczna rana jest tworzona przez drapanie urządzeniem. Następnie tempo migracji komórek w kierunku ogołoconego obszaru można monitorować za pomocą obrazowania. Nasz 8-kanałowy wóz mechaniczny został zaprojektowany tak, aby rozwiązać większość problemów związanych z testem migracji komórek. Po pierwsze, nasz wózek można łatwo sterylizować w autoklawie lub za pomocą zwykłych środków dezynfekujących. Po drugie, indywidualne regulowane szpilki umożliwiają równomierny kontakt z płytką do hodowli komórkowej, dzięki czemu można tworzyć ostre i powtarzalne rany. Po trzecie, pręty prowadzące po obu stronach rowka zapewniają stałą pozycję nawijania w każdym dołku. Użycie jednorazowych plastikowych końcówek do pipet do nawijania może dodatkowo zapewnić lepszą obsługę koła, a także zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe. Podsumowując, nasz system do hodowli komórek może zapewnić naukowcom przyjazne dla użytkownika i powtarzalne urządzenie do wykonywania testu migracji komórek przy użyciu standardowej 96-dołkowej płytki hodowlanej.
Wprowadzenie
Migracja komórek odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych, takich jak embriogeneza, neurogeneza, angiogeneza, gojenie się ran, naprawa błony śluzowej, przejścia nabłonkowo-mezenchymalne w warunkach normalnego rozwoju i choroby1. Jest to skomplikowany proces, który obejmuje koordynację wielu zdarzeń między- i wewnątrzkomórkowych, w tym interakcji cząsteczek sygnałowych, polaryzacji komórek, reorganizacji cytoszkieletu, przebudowy macierzy, wysunięcia błony i dynamicznej modulacji adhezji komórka-komórka2. Badając migrację komórek, można określić odkrycie i walidację substancji chemicznych lub biomolekuł prowadzących do ruchu komórki i powiązanych z nim szlaków biochemicznych. Ten podstawowy proces może być z korzyścią wykorzystany jako wskaźnik zastępczy dla różnych zastosowań, takich jak leczenie chorób i celowanie w leki.
Test zranienia jest jednym z testów migracji komórek3. W tym przypadku pojedyncza próbka komórek zostanie częściowo usunięta za pomocą środków mechanicznych, aby wytworzyć ogołocony obszar, w którym komórki będą migrować, aby pokryć ten obszar. Procent odzysku w określonym punkcie czasowym będzie monitorowany. W przypadku pracy z dużą liczbą próbek problematyczne mogą być takie kwestie, jak koszt eksperymentu i zanieczyszczenie krzyżowe w próbkach. Chociaż dostępnych jest wiele komercyjnych narzędzi i testów do badania migracji komórek4,5,6, wiele z nich wymagało drogiego i wyrafinowanego sprzętu, a ulepszenia są nadal potrzebne. Z tych powodów opracowano 8-kanałową mechaniczną komórkę ogniwową (ilustracja 1).
Nasz 8-kanałowy mechaniczny system ogniw zawiera kilka unikalnych funkcji w rozwiązywaniu wyżej wymienionych problemów. Zapewnia elastyczność w wykonywaniu testów migracji/zranień komórek w formacie 96-dołkowej płytki hodowlanej. Regulowana konstrukcja prowadnicy zapewnia, że obszar zarysowania znajduje się w centralnym położeniu każdej studzienki. Wysokość prętów prowadzących można również regulować, aby podkładka miała zastosowanie do różnych marek płytek hodowlanych. Wreszcie, regulowana konstrukcja trzpienia do nawijania umożliwia równomierny kontakt końcówek pipet z powierzchnią płytki hodowlanej, aby uzyskać jednoczesne i powtarzalne nawijanie7,8.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wprowadzenie do elementów urządzenia do wywoływania ran (Rysunek 1)
- Przygotować uchwyt pinów, mocując piny do zadawania ran w równych odstępach. Przytrzymać końcówki pipety i dostosować ich wysokość, przesuwając regulowane piny w górę i w dół.
- Zamocować regulowaną prowadnicę na płytkach hodowlanych z 96 dołkami różnych marek i upewnić się, że obszar zadawania ran znajduje się w ustalonej pozycji.
- Utrwalić regulowany pin do zadawania ran, dokręcając śrubę imbusową. Zamocować prowadnicę w odpowiedniej pozycji, dokręcając śruby z łbem cylindrycznym z gniazdem imbusowym na obu końcach.
2. Ustawianie szerokości uchwytu pinów (Rysunek 2)
- Poluzuj śruby z łbem imbusowym za pomocą klucza imbusowego M5.
- Włóż odpowiednią liczbę pierścieni regulacyjnych po obu stronach uchwytu pinów, tak aby prowadnice idealnie pasowały do szerokości 96-dołkowej płytki hodowlanej.
UWAGA: Płytki Corning i Iwaki wymagają 1 pary dużych pierścieni i 1 pary małych pierścieni. Płytki Falcon i Nunc wymagają 1 pary dużych pierścieni. - Dokręć śruby z łbem imbusowym, aby przymocować prowadnicę.
3. Regulacja prowadnic (Rysunek 3)
- Na piny do raniania nałóż sterylne plastikowe końcówki do pipet o pojemności 10-µL.
- Poluzuj śruby z łbem sześciokątnym za pomocą klucza imbusowego M5.
- Trzymając urządzenie do raniania, zanurz piny w jednej kolumnie 96-dołkowej płytki hodowlanej.
- Reguluj wysokość prowadnic, aż wszystkie końcówki będą ledwo dotykać dna dołków.
- Dokręć śruby z łbem sześciokątnym. Upewnij się, że urządzenie do raniania idealnie pasuje do płytki hodowlanej, a piny są dobrze rozmieszczone na środku dołków.
4. Kalibracja pinów
- Trzymać urządzenie do zadawania ran prostopadle do płaskiej sterylnej powierzchni (np. szalki Petriego) i poluzować wszystkie śruby imbusowe za pomocą klucza imbusowego M3.
- Opuścić urządzenie, aż wszystkie końcówki równomiernie dotkną płaskiej sterylnej powierzchni.
- Ponownie dokręcić śruby imbusowe, aby zablokować piny w tej pozycji.
- Sprawdzić wyrównanie każdej końcówki, delikatnie opukując urządzenie o płaską sterylną powierzchnię.
5. Zadrapanie monowarstwy komórek (Rycina 4)
- Przesiać ludzkie naczyniowe komórki śródbłonka pępowiny na 96-dołkową płytkę hodowlaną pokrytą 0,1% żelatyną. Hodować komórki w Medium 19 uzupełnionym o 20% inaktywowanego ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 0,09 g/L heparyny. Utrzymywać komórki w inkubatorze z nawilżaniem, w atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 ºC przez noc przed użyciem. Przed wykonaniem zranienia komórki powinny osiągnąć 10% konfluencji.
- Umieścić końcówki do zraniania po lewej (lub prawej) stronie każdego dołka w tej samej kolumnie płytki hodowlanej. Przesunąć urządzenie do zraniania na drugą stronę dołka, upewniając się, że końcówki dotykają dna dołka.
- Powtórzyć czynność drapania (Krok 5.2) dla wszystkich kolumn.
- Po zranieniu usunąć pożywkę z każdego dołka i zastąpić ją świeżą pożywką zawierającą testowane związki.
6. Akwizycja danych i analiza obrazu
- Wykonaj obrazowanie całego dołka z mechaniczną raną w monowarstwie komórkowej, korzystając z mikroskopu o małym powiększeniu z kamerą cyfrową (np. obiektyw 10X) bezpośrednio po zranieniu (t=0 h).
- W razie potrzeby dodać związki testowe i inkubować przez wybrany czas. Po upływie żądanego czasu inkubacji (t=Δh) ponownie wykonać obraz całego dołka wraz z obszarem rany.
- Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/), zmierz obszar rany na obrazie, korzystając z narzędzia do rysowania obszarów dowolnego kształtu (freehand tool).
- Oblicz procent zamknięcia rany:
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ten 8-kanałowy mechaniczny urządzenie do zadawania ran służy do tworzenia zarysowań w monowarstwie komórek w celu przeprowadzenia testu migracji komórek. Jest to urządzenie przyjazne dla użytkownika, które pozwala na wykonanie testów zarysowań komórek w płytkach 96-dołkowych w czasie krótszym niż minuta, bez konieczności specjalistycznego szkolenia. Urządzenie to umożliwia tworzenie obszarów rany w monowarstwach komórek o jednolitej szerokości około 60 µm i z ostrymi krawędziami (...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasz moduł komórkowy ma kilka unikalnych cech w rozwiązywaniu problemów związanych z tradycyjnymi testami migracji komórek. 8-kanałowa komórka mechaniczna wykonana jest z wysokiej jakości stali nierdzewnej (Steel 304) o długiej żywotności, którą można sterylizować w autoklawie. Prawie wszystkie komercyjne marki 96-dołkowych płytek hodowlanych dostępnych na rynku mogą być używane z tą mechaniczną matrycą komórkową ze względu na regulowaną prowadnicę. Konstrukcja regulowanego drążka prowadzącego zapewnia również, że obszar...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Panu/Pani Tam Po Leung, Panu Wong Chi Kinowi oraz personelowi technicznemu Warsztatu Naukowego Uniwersytetu Baptystów w Hongkongu, za ich umiejętności techniczne i rady przy tworzeniu prototypu tego urządzenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej | Nunc | 167008 | Można również używać innych marek 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych |
| Końcówki do pipet P10 | Axygen | 301-03-051 | Krótka końcówka do pipet P10 jest łatwiejsza do stworzenia wyraźnej rany |
| Wounder | R& P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | Do hodowli komórkowych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej. Użyj odpowiedniej pożywki hodowlanej i warunków dla innych typów komórek. |
| Surowica bydlęca | płodu Gibco | 26140079 | Do hodowli komórkowych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej. Użyj odpowiedniej pożywki hodowlanej i warunków dla innego typu komórek. |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibco | 15140122 | Do hodowli komórkowych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej. Użyj odpowiedniej pożywki hodowlanej i warunków dla innych typów komórek. |
| Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń | Sigma | H3393 | Do hodowli komórkowych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej. Użyj odpowiedniej pożywki hodowlanej i warunków dla innych typów komórek. |
| Żelatyna ze skóry bydlęcej | Sigma | G9391 | Do hodowli komórkowej ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej. Użyj odpowiedniej pożywki hodowlanej i kondycji dla innego typu komórek. |
Bibliografia
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980(2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
