Artykuł metodologiczny

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55417

⸱

24 marca 2017

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Streszczenie

Identyfikacja epitopu antygenowego przez układ odpornościowy pozwala na zrozumienie ochronnego mechanizmu przeciwciał neutralizujących, które mogą ułatwić rozwój szczepionek i leków peptydowych. Skanowanie peptydowe to prosta i skuteczna metoda, która w prosty sposób mapuje liniowy epitop rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne (mAb). W tym miejscu autorzy przedstawiają metodologię oznaczania epitopów obejmującą seryjnie skrócone białka rekombinowane, konstrukcję syntetycznego peptydu i hybrydyzację kropkową w celu antygenowego rozpoznawania białka płaszcza wirusa martwicy nerwów przy użyciu neutralizującego mAb. Technika ta opiera się na hybrydyzacji kropkowo-plamowej syntetycznych peptydów i mAb na membranie z polifluorku winylidenu (PVDF). Minimalny region antygenowy białka płaszcza wirusowego rozpoznawanego przez mAb RG-M56 można zawęzić przez mapowanie peptydów krok po kroku na epitopie peptydu 6-merowego. Ponadto można przeprowadzić mutagenezę skaningową alaniny i substytucję reszt w celu scharakteryzowania znaczenia wiązania każdej reszty aminokwasowej tworzącej epitop. Stwierdzono, że reszty flankujące miejsce epitopu odgrywają kluczową rolę w regulacji konformacji peptydów. Zidentyfikowany peptyd epitopowy może być wykorzystany do tworzenia kryształów kompleksów peptyd-przeciwciało epitopu do badania dyfrakcji rentgenowskiej i konkurencji funkcjonalnej lub do terapii.

Wprowadzenie

W układzie odpornościowym rekombinacja segmentów V, D i J pozwala przeciwciałom na tworzenie ogromnych różnic w regionach determinujących komplementarność (CDR) do wiązania się z różnymi antygenami w celu ochrony gospodarza przed patogenną infekcją. Obrona neutralizująca przeciwciał przeciwko antygenom zależy od komplementarności przestrzennej między CDR przeciwciał a epitopami antygenów. W związku z tym zrozumienie tej interakcji molekularnej pomoże w projektowaniu szczepionek profilaktycznych i opracowywaniu terapeutycznych leków peptydowych. Jednak na tę interakcję neutralizacyjną może wpływać zarówno wiele domen antygenowych z jednego antygenu, jak i wiele CDR przeciwciał, co w konsekwencji sprawia, że proces oznaczania epitopów jest bardziej złożony. Na szczęście rozwój technologii hybrydoma, która łączy pojedyncze komórki wytwarzające przeciwciała z komórkami szpiczaka, pozwala na to, aby stale dzieląca się partia komórek wydzielała jedno specyficzne przeciwciało, znane jako przeciwciało monoklonalne (mAb)1. Komórki hybrydoma wytwarzają te czyste przeciwciała monoklonalne o wysokim powinowactwie, aby związać się z pojedynczą domeną antygenową określonego antygenu. Po ustaleniu relacji antygen-przeciwciało, można zastosować kilka podejść, w tym skanowanie peptydowe, w celu określenia epitopu antygenu za pomocą odpowiadającego mu mAb. Ostatnie osiągnięcia w technologii syntetycznych peptydów sprawiły, że technika skanowania peptydów jest bardziej dostępna i wygodniejsza do wykonania. Krótko mówiąc, zestaw nakładających się na siebie syntetycznych peptydów jest wytwarzany zgodnie z docelową sekwencją antygenu i jest powiązany z błoną podpartą ciałem stałym w celu hybrydyzacji mAb. Skanowanie peptydowe nie tylko oferuje prosty sposób mapowania regionu wiązania przeciwciała, ale także ułatwia mutagenezę aminokwasów (aa) poprzez skanowanie reszt lub substytucję w celu oceny interakcji wiązania między każdą resztą aa peptydu epitopowego a CDR przeciwciała.

Tutaj, niniejsze badanie opisuje protokół skutecznej identyfikacji liniowego epitopu białka płaszcza wirusa żółtej frakcji nerwowej (YGNNV) za pomocą neutralizującego mAb2,3,4. Protokół obejmuje przygotowanie mAb, konstrukcję i ekspresję seryjnie skróconych białek rekombinowanych, syntetyczny projekt nakładających się peptydów, hybrydyzację kropka-blot, skanowanie alaniny i mutagenezę substytucyjną. Biorąc pod uwagę wysoki koszt syntezy peptydów, etap seryjnego obcinania rekombinowanych białek pożądanego białka docelowego został zmodyfikowany, a region antygenowy został zawężony do około 100 do 200 reszt aa przed przeprowadzeniem analizy dot-blot z syntetyczną matrycą peptydów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie przeciwciała monoklonalnego

  1. Hodowla mysich komórek hybrydoma monoklonalnego RG-M56 2 w podłożu bez surowicy w kolbach 175T w temperaturze 37 ºC z dodatkiem 5% CO2 . Zebrać supernatant, gdy kolor podłoża zmieni kolor na żółty po pięciu dniach inkubacji.
    UWAGA: Komórki hybrydoma hodowano w pożywce bez surowicy, aby uniknąć zanieczyszczenia przeciwciałami płodową surowicą bydlęcą.
  2. Odwirować supernatant w temperaturze 4 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić osad z resztek komórek.
  3. Dodaj 2 ml białka G agarozy (dostarczanej w postaci 50% zawiesiny) do kolumny o pojemności 5 ml i zrównoważ z 10 objętościami żywicy (10 ml) lodowatego PBS.
  4. Załadować 200 ml supernatantu przeciwciała (krok 1.2) na kolumnę i odrzucić przepustowość.
  5. Dodaj 10 ml lodowatego PBS do kolumny, aby ją umyć. Powtórz dwa razy.
  6. Dodaj 10 ml 50 mM glicyny o pH 2,7 do kolumny, aby wymyć przeciwciało związane z białkiem G. Zebrać 900 μl frakcji w probówce mikrowirówki zawierającej 100 μl 10x buforu neutralizującego (1 M Tris, 1,5 M NaCl i 1 mM EDTA, pH 8,0).
  7. Oczyszczone przeciwciało należy przechowywać w 50% glicerolu z 0,03% NaN3 w temperaturze -20 ºC.

2. Budowa i ekspresja seryjnie ściętych białek rekombinowanych

  1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR: 5 μL 10x buforu Pfu, 0,2 mM każdego dNTP, 0,2 μM startera do przodu3, 0,2 μM starter odwrotny3, 2 mM MgSO4, 1 ng pET20b-1A593 plazmidowego DNA i 2,5 U (jednostka) polimerazy Pfu DNA; dodać ddH2O do końcowej objętości 50 μL.
    1. Badać próbki w automatycznym termocyklerze, stosując następujące parametry: cykl 1 (94 ºC przez 5 minut); cykle 2-36 (94 ºC przez 30 s, 63 ºC przez 30 s i 72 ºC przez 60 s); i cykl 37 (72 ºC przez 7 min).
  2. Ekstrahuj produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą zestawu do oczyszczania PCR5, aby ułatwić następujące trawienie enzymem restrykcyjnym.
  3. Trawić fragmenty DNA amplifikowane PCR enzymami restrykcyjnymi NdeI i Xho I i XhoI i ligować każdy z tych fragmentów DNA do wektora pET-20b(+) rozszczepionego enzymem NdeI i XhoI. Przekształć konstrukty w komórki kompetentne Escherichia coli DH-5α6.
    1. Przygotować mieszaninę wytrawiającą w buforze do wytrawiania (20 mM tris-octanu, 10 mM Mg(CH3COO)2, 50 mM KCH3COO i 1 mM DTT, pH 7,9) z 1 μg DNA amplifikowanego PCR lub wektora pET-20b(+) DNA i 2 U enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI w końcowej objętości 20 μL.
    2. Delikatnie wymieszaj mieszankę wytrawiającą i szybko odwiruj. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w suchej kąpieli, aby zapewnić całkowite przecięcie miejsc ograniczenia.
    3. Ekstrahuj fragmenty DNA trawione przez enzym restrykcyjny za pomocą zestawu do oczyszczania PCR5, aby ułatwić następującą budowę plazmidu.
    4. Przygotować mieszaninę ligacyjną w buforze do ligacji (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP i 5 mM DTT, pH 7,5) ze 100 ng wstępnie strawionego DNA amplifikowanego PCR, 10 ng wstępnie strawionego DNA wektora pET-20b(+) i 5 U ligazy DNA T4 w końcowej objętości 10 μl.
    5. Delikatnie wymieszaj mieszaninę ligacyjną i szybko odwiruj. Inkubować w temperaturze 16 °C przez 18 godzin w łaźni wodnej.
    6. Umieścić 10 μl próbek ligacji w 100 μl komórek kompetentnych dla DH-5α i delikatnie wymieszać przed umieszczeniem probówki mikrowirówki na lodzie na 30 minut. Umieścić probówkę mikrowirówki w suchej kąpieli w temperaturze 42 ºC na 90 s, aby wywołać szok cieplny7. Natychmiast przenieś probówkę na lód na 2 minuty.
    7. Do probówki dodać 900 μl bulionu Luria-Bertani (LB) (1% tryptonu Bacto, 0,5% ekstraktu drożdżowego Bacto i 0,5% NaCl, pH 7,0). Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 150 obr./min, wytrząsając przez 45 min. Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
    8. Zawiesić osad z 50 μl bulionu LB i rozprowadzić każdą przemianę na wstępnie podgrzanych płytkach LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
    9. Zbierz pojedynczą kolonię za pomocą końcówki o pojemności 200 μl i umieść ją w 3 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w luźno zamkniętej probówce o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 150 obr./min, wytrząsając przez 12 godzin.
    10. Wyekstrahuj plazmid DNA8 z każdej kultury i zsekwencjonuj go za pomocą starterów promotora T7 i terminatora T7, aby potwierdzić sekwencję9.
  4. Po potwierdzeniu sekwencji przekształć 10 ng DNA z tych plazmidów pET-20b(+) o różnej długości genu białka płaszcza YGNNV w szczep BL-21 (DE3) E. coli za pomocą metody szoku cieplnego7. Wykonaj kroki 2.3.6-2.3.8, aby wykonać transformację.
  5. Przenieś pojedynczą kolonię z każdej przekształconej komórki E. coli BL-21 do 3 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w luźno zamkniętej probówce o pojemności 15 ml. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 150 obr./min.
  6. Schłodzić kulturę do 25 °C, gdy OD600 w kulturze wynosi około 0,6 i dodać IPTG do końcowego stężenia 0,4 mM w celu wywołania ekspresji rekombinowanego białka. Inkubować kulturę przez dodatkowe 4 godziny w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem 200 obr./min.
  7. Przenieść 1 ml kultury do probówki mikrowirówkowej. Osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 12 000 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant.
  8. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu denaturacyjnego (8 M mocznika, 20 mM fosforanu sodu i 0,5 M NaCl, pH 7,4), pipetując w górę iw dół za pomocą mikropipety. Mieszać przez energiczne wirowanie.
    UWAGA: Roztwory próbek powinny być teraz półprzezroczyste, lekko lepkie i gotowe do testu hybrydyzacji kropkowej.

3. Projektowanie i synteza nakładających się peptydów

  1. Zaprojektuj i zsyntetyzuj3 szeregowe 20-merowe peptydy, z których każdy nakłada się na swój następca o 10 reszt aa z regionu 195-338 aa białka płaszcza YGNNV, aby zawęzić region epitopu mAb RG-M56 za pomocą klombu punktowego.
  2. Zaprojektuj i zsyntetyzuj 3 trzy 8-merowe peptydy (195VNVSVLCR202, 197VSVLCRWS204 i 199VLCRWSVR206) z nałożeniem 6 reszt aa na następny syntetyczny peptyd, aby zawęzić region epitopu 195-206 aa za pomocą kropkowego blottingu.
  3. Zaprojektuj i zsyntetyzuj 3 peptydy 7-merowe (196NVSVLCR202 i 195VNVSVLC201), 6-merowe (195VNVSVL200, 196NVSVLC201 i 197VSVLCR202) oraz peptydy 5-merowe (195VNVSV199, 196NVSVL200, 197VSVLC201 i 198SVLCR202) z nakładaniem się odpowiednio 6, 5 i 4 reszt AA na sąsiednie peptydy, aby zminimalizować region epitopu przez plamienie kropkowe.

4. Hybrydyzacja punktowo-plamowa

  1. Rozpuścić każdy zsyntetyzowany peptyd w dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 10 mg/ml.
    UWAGA: Aby przezwyciężyć zróżnicowaną rozpuszczalność peptydów syntetycznych, wszystkie peptydy syntetyczne należy rozpuścić w DMSO. DMSO jest dobrym rozpuszczalnikiem do całkowitego rozpuszczenia peptydów hydrofobowych lub hydrofilowych.
  2. Namocz membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w metanolu przez 2 min.
    UWAGA: membrana PVDF jest do 100% odporna na DMSO; inni mogą tak nie być.
  3. Zrównoważyć membranę PVDF ze zmodyfikowanym buforem Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicyny i 0,1% SDS, pH 8,3) przez 2 minuty
    UWAGA: 10-20% (v/v) metanolu można dodać do zmodyfikowanego bufora Towbin w celu poprawy wyników transferu.
  4. Opłucz kawałek bibuły chromatograficznej zmodyfikowanym buforem Towbin. Umieścić membranę PVDF na bibule chromatograficznej. Poczekaj, aż zmodyfikowany bufor pojemnika holowniczego zniknie z powierzchni membrany PVDF, zanim przejdziesz do następnego kroku.
  5. Dodać 2 μl każdej próbki peptydu do membrany za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Wysuszyć membranę PVDF na bibule chromatograficznej na powietrzu przez 10 minut. Dodawaj każdą próbkę peptydu powoli i stopniowo do membrany, aby uniknąć zbyt dużej dyfuzji.
  6. Zablokuj membranę w buforze TBST (0,05% (v/v) Tween-20, 20 mM Tris i 150 mM NaCl, pH 7,4) z 5% mlekiem beztłuszczowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając.
  7. Dodać mAb RG-M56 w końcowym rozcieńczeniu 1:1,000 w buforze TBST z 5% mlekiem beztłuszczowym do membrany. Inkubować błonę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.
  8. Usunąć roztwór przeciwciał. Płukać membranę w buforze TBST przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Powtórz dwa razy.
  9. Dodać przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-mysie IgG, Fc, sprzężona fosfataza alkaliczna) w końcowym rozcieńczeniu 1:5 000 w buforze TBST z 5% mlekiem beztłuszczowym do membrany. Inkubować błonę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.
  10. Wyrzucić roztwór przeciwciała. Płukać membranę w buforze TBST przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Powtórz krok prania dwa razy.
  11. Rozwinąć membranę z roztworem substratu BCIP/NBT w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności. Zatrzymaj rozwój, myjąc membranę ddH2O, gdy pojawi się sygnał.
  12. Wysusz membranę na powietrzu i uchwyć obraz kropkowy za pomocą systemu obrazu.
  13. Zmierz intensywność każdej plamy punktowej za pomocą oprogramowania do analizy obrazu3.

5. Skanowanie i podstawianie alaniny

  1. Zaprojektuj i zsyntetyzuj 3 peptydy substytucji alaniny i metioniny. Zastąp każdą resztę aa alaniną dla 8-merowego peptydu 195VNVSVLCR202 i zsyntetyzuj peptydy 195ANVSVLCR202, 195VAVSVLCR202, 195VNASVLCR202, 195VNVAVLCR202, 195VNVSALCR202, 195VNVSVACR202, 195VNVSVLAR202 i 195VNVSVLCA202. Zamień resztę aa leucyny 200 na metioninę, aby utworzyć peptyd epitopu genotypu SJNNV 195VNVSVMCR202.
  2. Postępuj zgodnie z sekcją 4, aby wykonać skanowanie alaniny i mutagenezę punktową mutagenezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszego eksperymentu była identyfikacja epitopu za pomocą metody dot blot z użyciem przeciwciał mAb. Aby szybko i efektywnie zawęzić obszar antygenowy rozpoznawany przez mAb, pełnowymiarowe oraz seryjnie skrócone rekombinowane białka otoczki YGNNV z tagiem fuzyjnym 6xHis na C-końcu zostały wyekspresjonowane w systemie ekspresyjnym PET E. coli10 (Ryc. 1A). Uzyskane białka rekombinowane naniesiono na membranę PVDF, a do hybrydyzacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten oferuje szybką i prostą technikę identyfikacji epitopu liniowego rozpoznawanego przez mAb. Biorąc pod uwagę koszt syntezy peptydów i wydajność produkcji peptydów syntezujących, region antygenowy białka płaszcza wirusa został zmniejszony poprzez ekspresję seryjnie skróconych białek rekombinowanych przed analizą skanowania peptydów. W związku z tym niezawodny i wydajny system ekspresji pET E. coli został wykorzystany do produkcji tych seryjnie skróconych białek rekombinowanych, ponieważ rekombinowane ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów w związku z niniejszym raportem.

Podziękowania

Autorzy dziękują Pannie Ching-Chun Lin i Pannie Dianie Lin z Głównego Ośrodka Instytutu Biologii Komórkowej i Organizmów (ICOB) Academia Sinica za zaoferowanie swojej wiedzy na temat syntezy peptydów i sekwencjonowania DNA. Badanie to było wspierane przez Academia Sinica.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka hybrydowa SFMGibco12045-076
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbeccosa (PBS)Gibco21600-069
Polimeraza DNA Pfu Thermo Scientific EP0502 Łącznie z
T4 DNA LigazeRoche10799009001W tym
NdeI New England BiolabsR0111SW tym
XhoI New England BiolabsR0146SW tym
pET-20b(+) wektorNovagen, Merck Millipore69739
E. coli DH-5α kompetentna komórkaRBC BioscienceRH617
E. coli BL-21(DE3) kompetentna komórkaRBC BioscienceRH217
AmpicylinaAmresco0339-25G
Rosół LB Invitrongen12780-052
Izopropylotio-β-D-tiogalaktozyd (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
MetanolMerck Millipore106009
Polioksyetylenu 20 Monolaurynian sorbitanu (Tween-20)J.T.BakerX251-07
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
GlicynaAmresco0167-5KG
TrisAffymetrix, USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
GlicerolAmresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, FcJackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (polifluorek winylidenu, PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
Białko G Agaroza Szybki przepływMerck Millipore16-266
QIAquick PCR Zestaw oczyszczającyQiagen28106
UVP BioSpectrum 600 System obrazowaniaUVPn/a
Oprogramowanie do analizy VisionWorks LS Ver 6.8UVPn/a
Termocykler MyCyclerBioRad1709713
fragment przeciwciało

Bibliografia

  1. Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).
  2. Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
  3. Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).
  4. Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
  5. Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
  6. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24(2011).
  7. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  8. Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).
  9. Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
  10. Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
  11. Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
  12. Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  13. Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
  14. Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
  15. Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
  16. Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).
  17. Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
  18. Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hybrydyzacja dot blotbia ka sekwencyjnie przycinaneskanowanie alaninowewirus nekrozy nerwowejekspresja bia ek rekombinowanychmembrana PVDFmapowanie epitop w

Powiązane artykuły