Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

16K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55436

⸱

11 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Graduate Program, The University of Western Ontario, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, The University of Western Ontario, 3Department of Chemical Engineering, Queen's University, 4Department of Chemical & Biochemical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Western Ontario

W tym artykule

Podsumowanie

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Streszczenie

Funkcja komórki jest pośredniczona przez interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), która ma złożony skład i architekturę specyficzną dla tkanki. Niniejszy artykuł koncentruje się na metodach wytwarzania porowatych pianek i mikronośników pochodzących z ECM do stosowania jako biologicznie istotne podłoża w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne rusztowania i systemy dostarczania komórek w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Wykorzystując pozbawione komórek tkanki lub oczyszczony nierozpuszczalny kolagen jako materiał wyjściowy, techniki te można zastosować do syntezy szerokiej gamy biorusztowań specyficznych dla tkanek o dostosowywalnej geometrii. Podejście to obejmuje obróbkę mechaniczną i łagodne trawienie enzymatyczne w celu uzyskania zawiesiny ECM, która jest używana do wytwarzania trójwymiarowych pianek lub mikronośników poprzez kontrolowane procedury zamrażania i liofilizacji. Te czyste rusztowania pochodzące z ECM są wysoce porowate, a jednocześnie stabilne bez potrzeby stosowania chemicznych środków sieciujących lub innych dodatków, które mogą negatywnie wpływać na funkcjonowanie komórek. Właściwości rusztowania można do pewnego stopnia dostroić za pomocą różnych czynników, takich jak stężenie zawiesiny ECM, metody obróbki mechanicznej lub warunki syntezy. Ogólnie rzecz biorąc, rusztowania są wytrzymałe i łatwe w obsłudze i mogą być przetwarzane jako tkanki dla większości standardowych testów biologicznych, zapewniając wszechstronną i przyjazną dla użytkownika platformę do hodowli komórek 3D, która naśladuje natywną kompozycję ECM. Ogólnie rzecz biorąc, te proste metody wytwarzania niestandardowych pianek i mikronośników pochodzących z ECM mogą być interesujące zarówno dla biologów, jak i inżynierów biomedycznych jako specyficzne tkankowo platformy instruktażowe dla komórek do zastosowań in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) składa się ze złożonej trójwymiarowej sieci białek, glikoprotein i polisacharydów1. Choć dawniej uważano ją za strukturę pełniąca głównie rolę rusztowania, obecnie jest powszechnie wiadomo, że ECM zawiera zróżnicowany zestaw cząsteczek bioaktywnych o istotnych funkcjach2. Oddziaływania między komórkami a ECM mogą kierować przeżyciem, adhezją, migracją, proliferacją i różnicowaniem komórek3. Mimo że główne klasy makrocząsteczek ECM są zazwyczaj dobrze zachowane w różnych tkankach i gatunkach, każda tkanka posiada unikalny skład i architekturę macierzy4. W ogólnym ujęciu tkankowo specyficzna ECM tworzy instruktywne mikrośrodowisko, które pośredniczy w funkcjonowaniu organizmu na poziomach od subkomórkowego po poziom tkanki i organu5.

Ze względu na kluczową rolę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w pośredniczeniu funkcji komórkowych, rośnie zainteresowanie opracowywaniem biopolimerowych rusztowań pochodnych ECM do zastosowań w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. W szczególności metoda decelularyzacji była szeroko badana jako sposób pozyskiwania ECM z szerokiego zakresu tkanek w celu wykorzystania jej jako materiału rusztowującego do regeneracji tkanek i dostarczania komórek5,6,7. Decelularyzacja zazwyczaj obejmuje serię etapów obróbki mechanicznej, chemicznej i/lub biologicznej nakierowanych na usunięcie komórek i ich komponentów, przy jednoczesnym dążeniu do zminimalizowania zmian w strukturze 3D i składzie ECM8. Przegląd literatury pozwala zidentyfikować różnorodne protokoły decelularyzacji dla niemal każdej tkanki w organizmie7.

Choć tkanki zdecelularyzowane mogą być stosowane bezpośrednio jako implantowalne rusztowania lub podłoża do 3D hodowli komórkowych, infiltracja komórkowa może być ograniczona w tkankach o gęstej strukturze ECM9. Ponadto naturalna heterogeniczność ECM może powodować zmienność w adhezji i rozkładzie komórek w obrębie matryc zdecelularyzowanych, co potencjalnie mogłoby wpłynąć na odpowiedź komórkową10. Podsumowując, mimo że zastosowanie tkanek zdecelularyzowanych w ich nienaruszonej formie jest obiecujące w niektórych przypadkach, oferuje ono ograniczoną wszechstronność pod kątem dostrajania właściwości rusztowania, w tym kształtu, porowatości i sztywności, a także sposobu podania w aplikacjach in vivo.

Aby obejść te ograniczenia, liczne grupy badawcze stosują dodatkowe metody przetwarzania w celu wytworzenia dostosowanych formatów rusztowań, wykorzystując tkanki zdecelularyzowane jako materiał bazowy. W najprostszej formie może to polegać na kriomieleniu zdecelularyzowanych tkanek w celu uzyskania wstrzykiwalnych, tkankowo specyficznych cząsteczek ECM11. Cząsteczki ECM te mogą być włączone jako komponent instrukcyjny dla komórek do rusztowań kompozytowych z innymi biomateriałami, takimi jak hydrożele sieciowane in situ12,13,14. Oprócz przetwarzania mechanicznego tkanki zdecelularyzowane mogą być poddawane trawieniu enzymatycznemu za pomocą enzymów proteolitycznych i/lub glikolitycznych w celu wytworzenia hydrożeli, pianek, mikronośników i powłok pochodzących z ECM15,16,17, a także do syntezy biotuszów do druku 3D18.

Oprócz zastosowań w inżynierii tkankowej, bioskafoldy pochodne z ECM wykazują ogromny potencjał w tworzeniu bardziej wiernych modeli in vitro do badań biologicznych. Istnieje znaczna potrzeba opracowania trójwymiarowych (3D) systemów hodowli komórkowych, które lepiej odtwarzają natywne mikrośrodowisko komórkowe19. Większość przeprowadzonych do tej pory badań nad hodowlami komórkowymi in vitro realizowana jest na polistyrenie do hodowli tkanek (TCPS), który ma niewielką korelację z biologicznie złożonym i dynamicznym środowiskiem komórkowym występującym w żywych tkankach20. Choć hodowla komórek na tych uproszczonych, sztywnych podłożach 2D jest wygodna do badania oddziaływań komórkowych w kontrolowanym środowisku, zmienia ona adhezję i morfologię komórek, a także oddziaływania komórka-komórka oraz komórka-ECM21,22. Adaptacje komórkowe obserwowane na 2D TCPS mogą wpływać na wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne regulujące różnorodne funkcje komórek, w tym przeżycie, proliferację, migrację i różnicowanie, co budzi pytania o zasadność stosowania badań 2D w modelowaniu systemów in vivo23. Coraz częściej dostrzega się, że zachowanie komórek może się znacznie różnić w systemach 2D versus 3D24, a sygnalizacja biochemiczna i biomechaniczna z ECM są kluczowymi mediatorami funkcji komórkowych25. Wiele zespołów badawczych próbowało przezwyciężyć ograniczenia uznanych systemów 2D poprzez powlekanie TCPS komponentami ECM, takimi jak kolagen, laminina i fibronektyna. Chociaż strategie te mogą poprawić adhezję komórek i mogą modyfikować odpowiedzi komórkowe, modele te pozostają ograniczone przez swoją konfigurację 2D, która nie naśladuje złożonej organizacji przestrzennej ani biochemii natywnej ECM26,27.

Nasze laboratorium bioinżynieryjne interesuje się opracowywaniem biopolimerowych rusztowań pochodzących z macierzy pozakomórkowej (ECM) jako podłoży do trójwymiarowych (3-D) hodowli komórkowych oraz zastosowań w inżynierii tkankowej. W szczególności zapoczątkowaliśmy wykorzystanie zdecelularyzowanej tkanki tłuszczowej (DAT) jako platformy rusztowaniowej do regeneracji tkanki tłuszczowej28. Ponadto opracowaliśmy metody syntezy trójwymiarowych mikroprzenośników i pianek porowatych przy użyciu DAT trawionej enzymem proteolitycznym pepsyną lub enzymem glikolitycznym α-amylazą29,30,31. Co istotne, wykazaliśmy we wszystkich tych formatach rusztowań, że ECM pochodząca z tkanki tłuszczowej zapewnia indukcyjne mikrośrodowisko dla różnicowania adipogennego ludzkich komórek macierzystych/stromalnych pochodzenia tłuszczowego (ASCs) w hodowli. Niedawno rozszerzyliśmy nasze metody wytwarzania w celu generowania trójwymiarowych pianek porowatych ze zdecelularyzowanej lewej komory serca (DLV) świni trawionej α-amylazą (metody decelularyzacji zaadaptowane od Wainwright et al.32) i wykazaliśmy, że stanowią one wspierającą platformę dla indukcji wczesnej ekspresji markerów kardiomiogennych w ludzkich ASCs pochodzących z tłuszczu osierdziowego31.

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje metody syntezy nie sieciowanych chemicznie porowatych pianek 3D oraz mikronośników pochodnych z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) trawionej α-amylazą, przeznaczonych do stosowania jako biologicznie złożone podłoża do hodowli komórkowych 3D in vitro oraz jako biomateriały do regeneracji tkanek. Teoretycznie każdy rodzaj ECM zawierający kolagen o wysokiej masie cząsteczkowej może służyć jako materiał wyjściowy dla tych technik. Aby zademonstrować elastyczność tego podejścia, metody te zastosowano w celu wytworzenia tkankowo specyficznych bioszkieletów, wykorzystując jako reprezentatywne przykłady ludzką tkankę DAT, świńską zdecelularyzowaną tkankę skórną (DDT)8 oraz świńską DLV. Rysunek 1 przedstawia wizualny przegląd procesu produkcji pianek i mikronośników pochodnych z ECM.

figure-introduction-1
Rysunek 1. Przegląd metody produkcji pianek i mikronośników pochodzących z tkankowo-specyficznej ECM. 1. Tkanki decelularyzowane, przygotowane zgodnie z ustalonymi protokołami decelularyzacji, mogą być wykorzystane do wytwarzania tkankowo-specyficznych bioscaffoldów pochodnych z ECM. Przedstawiono obrazy makroskopowe uwodnionego ludzkiego DAT (przygotowanego zgodnie z opisem w Flynn 201028), świńskiego DDT (przygotowanego zgodnie z opisem w Reing, J. E., et al. 20108) oraz świńskiego DLV (przygotowanego zgodnie z opisem w Wainwright et al. 201032), jako reprezentatywne przykłady źródeł ECM, które mogą służyć jako materiały wyjściowe. Paski skali reprezentują 3 cm. 2. Tkanki decelularyzowane są liofilizowane, a następnie 3. mechanicznie rozdrabniane. Paski skali reprezentują 1 cm. 4. Rozdrobniona ECM może zostać następnie poddana kriotrakesji (cryomilled), co jest opcjonalne przy produkcji pianek, ale wymagane przy syntezie mikronośników. Pasek skali reprezentuje 3 mm. 5. Rozdrobniona lub kriotraksowana ECM jest następnie trawiona α-amylazą i homogenizowana w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny ECM. Pasek skali reprezentuje 1 cm. 6a) W celu produkcji pianki zawiesinę ECM przenosi się do formy o zdefiniowanym kształcie, zamraża i liofilizuje, aby wytworzyć porowaty scaffold 3D o określonej geometrii. Pasek skali reprezentuje 1 cm. 6b) W celu produkcji mikronośników zawiesinę kriotraksowanej ECM poddaje się elektrosprayowi, aby wytworzyć oddzielne sferyczne mikronośniki. Pasek skali reprezentuje 2 mm. 7. Pianki i mikronośniki mogą być następnie stopniowo rehydratowane i zasiewiane komórkami. Przedstawiono reprezentatywne obrazy ludzkich ASC (żywe komórki = kolor zielony) zasianych na piance DAT (lewo) i mikronośniku DAT (prawo). Paski skali reprezentują 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przetwarzanie tkanki decelularyzowanej

  1. Decelularyzacja i liofilizacja
    1. Przeprowadź decelularyzację interesujących tkanek zgodnie z uznanym protokołem.
      UWAGA: Rusztowania w niniejszym badaniu zostały przygotowane zgodnie z opublikowanymi protokołami decelularyzacji dla ludzkiego DAT28, świńskiego DDT8 oraz świńskiego DLV32. Do wytwarzania pianek i mikronośników można również użyć komercyjnie dostępnego, nierozpuszczalnego kolagenu, np. kolagenu pochodzącego z ścięgna bydlęcego, który z sukcesem stosowano w zakresie stężeń 10 - 50 mg/mL. Można wykorzystać inne źródła nierozpuszczalnego kolagenu, jednak mogą one wymagać optymalizacji w celu określenia zakresu stężeń, który zapewni stabilność rusztowań.
    2. Przenieś nawodnioną, decelularyzowaną tkankę lub oczyszczony kolagen pęsetą do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL i dodaj wystarczającą ilość podwójnie destylowanej wody (ddH2O), aby zanurzyć tkankę, do maksymalnej objętości całkowitej 35 mL.
    3. Zamroź próbkę przez noc w temperaturze -80 °C, ustawiając probówkę wirówkową poziomo podczas mrożenia, aby zmaksymalizować powierzchnię sublimacji podczas późniejszej liofilizacji.
    4. Zdejmij nakrętkę z probówki wirówkowej i przenieś zamrożoną próbkę do naczynia liofilizacyjnego.
    5. Liofilizuj próbkę w laboratoryjnej liofilizatorze przez 48 - 72 h lub do całkowitego wysuszenia.
      UWAGA: Czas suszenia może się różnić w zależności od liofilizatora i decelularyzowanych tkanek.
    6. Drobno posiekaj liofilizowane ECM na małe kawałki (~ 1 - 2 mm3) za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych.
    7. Przechowuj posiekane ECM w eksykatorze do czasu dalszego przetwarzania.
      UWAGA: Zaleca się natychmiastowe wykorzystanie posiekanego ECM, aby zapobiec absorpcji wilgoci z otoczenia.
  2. Kriomielenie (opcjonalne przy wytwarzaniu pianek)
    1. Wypełnij 25 mL stalową komorę mielącą systemu laboratoryjnej młynka kulowego posiekanym, liofilizowanym ECM i dodaj dwie 10 mm stalowe kule mielące.
    2. Zamknij napełnioną komorę mielącą i całkowicie zanurz ją w ciekłym azocie na 3 min.
    3. Miel zamrożoną próbkę przez 3 min przy 30 Hz (1 800 rpm).
    4. Powtarzaj kroki 1.2.2 i 1.2.3, aż ECM zostanie zmielone na drobny proszek.
      UWAGA: Liczba powtórzeń tych kroków może się różnić w zależności od źródła ECM. Na przykład DAT zazwyczaj wymaga 3 cykli mielenia w celu uzyskania drobnego proszku.
    5. Przenieś proszek za pomocą szpatułki do szklanej fiolki, szczelnie zamknij i przechowuj w eksykatorze.
  3. Przygotowanie zawiesiny ECM
    1. Odważ 250 mg posiekanego (dla pianek) lub kriomielonego (dla pianek lub mikronośników) ECM i przenieś go do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL. W celu przygotowania posiekanego ECM i kriomielonego ECM odnieś się odpowiednio do kroku 1.1.6 oraz sekcji 1.2.
      UWAGA: Niniejszy protokół służy do przygotowania zawiesiny ECM o stężeniu 50 mg/mL, co jest zalecane dla ludzkiego DAT, świńskiego DDT i świńskiego DLV. W zależności od konkretnego źródła ECM można uzyskać jednorodne zawiesiny przy wyższych lub niższych stężeniach początkowych.
    2. Do probówki wirówkowej dodaj 5 mL buforu 0,22 M NaH2PO4 (pH 5,4) i zaznacz poziom cieczy na probówce.
    3. Przygotuj roztwór stokowy α-amylazy, dodając 7,5 mg α-amylazy do 1 mL buforu 0,22 M NaH2PO4 (pH 5,4). Do próbki dodaj 100 μL roztworu stokowego α-amylazy (0,75 mg α-amylazy; 0,3% w/w suchej tkanki). Dodaj 0,22 M NaH2PO4, aby uzyskać objętość końcową 10 mL.
    4. Mieszaj zawiesinę w sposób ciągły przy 300 rpm przez 72 h w temperaturze pokojowej.
    5. Wirowarkuj zawiesinę przy 1 500 x g przez 10 min. Ostrożnie zbierz i odrzuć nadsącz, nie naruszając osadu z trawionego ECM. Resuspenduj materiał z osadu w 10 mL 5% NaCl rozcieńczonego w ddH2O.
    6. Powtórz krok 1.3.5, aby łącznie przeprowadzić dwa płukania 5% NaCl w ddH2O.
    7. Odrzuć nadsącz i resuspenduj materiał z osadu w 10 mL ddH2O.
    8. Mieszaj zawiesinę w sposób ciągły przy 300 rpm przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    9. Wirowarkuj zawiesinę przy 1 500 x g przez 10 min. Ostrożnie zbierz i odrzuć nadsącz, nie naruszając osadu z trawionego ECM.
    10. Dodaj kwas octowy 0,2 M do poziomu 5 mL zaznaczonego w kroku 1.3.2.
    11. Mieszaj zawiesinę w sposób ciągły przy 120 rpm przez noc  w 37 °C.
    12. Homogenizuj zawiesinę ECM w temperaturze pokojowej w dziesięciosekundowych odstępach czasu, używając homogenizatora ręcznego z ząbkowaną sondą o szerokości 10 mm, aż do całkowitego znikania widocznych fragmentów. Pomiędzy interwałami homogenizacji umieszczaj zawiesinę w zlewce z zimną wodą, aby zapobiec przegrzaniu.
      UWAGA: W zależności od źródła ECM może być wymagane dalsze rozcieńczenie w kwasie octowym 0,2 M w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny. Nadmierne chłodzenie zawiesiny ECM może prowadzić do zwiększenia lepkości, co może utrudnić efektywną homogenizację. W przypadku zauważenia wzrostu lepkości, próbkę można ponownie podgrzać do 37 °C i poddać dalszemu przetwarzaniu.
    13. Przechowuj w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca przed wytwarzaniem pianek lub mikronośników.

2. Wytwarzanie pianki pochodzącej z ECM

  1. Inkubować zawiesinę ECM z kroku 1.3.13 (posiekaną lub mieloną kriogenicznie) w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu przy 120 rpm, aż zawiesina się ogrzeje.
  2. Rozcieńczyć zawiesinę ECM w 0,2 M kwasie octowym do pożądanego stężenia.
    UWAGA: W zależności od źródła ECM można przygotować stabilne pianki w zakresie 10 - 100 mg/mL, przy czym zalecany zakres dla DAT, DDT i DLV wynosi 15 - 50 mg/mL. Zazwyczaj pianki wytwarzane przy wyższych stężeniach będą nieco mniej porowate, ale bardziej stabilne w hodowli i łatwiejsze w obsłudze.
  3. Używając strzykawki 3 mL z igłą 18 G, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków w zawiesinie ECM, wypełnić wybraną formę zawiesiną ECM. Aby wytworzyć pianki DAT, DDT i DLV, nanieść 400 μL zawiesiny ECM o stężeniu 35 mg/mL do 48-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
    UWAGA: Kształt wybranej formy oraz objętość zawiesiny ECM określą geometrię otrzymanej pianki.
  4. Przykryć i zamrozić formy przez noc, umieszczając je w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C.
    UWAGA: Temperatura zamrażania może wpływać na porowatość pianek. Przewiduje się powstanie większych porów, gdy próbki są mrożone w -20 °C w porównaniu do -80 °C, co wynika z tworzenia się większych kryształów lodu33. Aby uzyskać pianki o jednorodnej strukturze porowatej, należy upewnić się, że forma nie styka się z powierzchnią przewodzącą, aby zapobiec chłodzeniu kierunkowemu.
  5. Umieścić formy zawierające zamrożone próbki w kolbie liofilizatora. Podłączyć kolbę do laboratoryjnego liofilizatora i suszyć przez 24 h.
    UWAGA: Ważne jest, aby próbka pozostała zamrożona przed liofilizacją.
  6. Przechowywać liofilizowane pianki w deskrypatorze do czasu użycia.

3. Wytwarzanie mikronośników pochodzących z ECM poprzez elektrorozpylanie

UWAGA: Przegląd układu do elektrosprayingu przedstawiono na Rysunku 2.

  1. Inkubować zawiesinę ECM poddaną kriomieleniu z kroku 1.3.13 w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu z prędkością 100 rpm przez noc (O/N).
    UWAGA: ECM poddane kriomieleniu jest wykorzystywane do wytwarzania mikronośników pochodzących z ECM, aby zapewnić większą jednorodność zawiesiny i zapobiec zapychaniu się podczas elektrozrozania.
  2. Nabrać 3 mL zawiesiny ECM do strzykawki 3 mL z przyłączem Luer lock i przymocować zestaw do infuzji z „skrzydełkami” do otworu strzykawki.
    UWAGA: Można stosować igły o różnych średnicach (G), mając na uwadze, że wybór ten może wpłynąć na rozmiar i kształt otrzymanych mikronośników. Do wytwarzania mikronośników DAT, DDT i DLV należy użyć igły 25 G.
  3. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej. Przymocować igłę do statywu i ustawić jej końcówkę pionowo w odległości 4 – 6 cm od górnej krawędzi niskiej kolby Dewara (zalecany zakres objętości 250 – 500 mL).
  4. Przymocować elektrodę z klipsem krokodylkiem do końcówki igły i podłączyć ją do bieguna dodatniego wysokonapięciowego zasilacza.
  5. Złożyć pasek folii aluminiowej (12 x 5 cm) na krawędzi kolby próżniowej.
  6. Przymocować drugą elektrodę z klipsem krokodylkiem do zewnętrznej krawędzi folii i podłączyć ją do zacisku uziemienia zasilacza.
  7. Napełnić kolbę Dewara ciekłym azotem do poziomu około 1 cm od górnej krawędzi, tak aby ¾ folii było zanurzone.
    UWAGA: Ważne jest, aby kolba Dewara była stale napełniona ciekłym azotem. Powierzchnia ciekłego azotu musi znajdować się nie mniej niż 2 cm poniżej górnej krawędzi kolby podczas procesu elektrozrozania. W celu utrzymania stałego poziomu podczas elektrozrozania wymagane jest ciągłe uzupełnianie ciekłego azotu.
  8. Ustawić pompę strzykawkową na szybkość infuzji 30 mL/h.
    UWAGA: Zmiana szybkości infuzji może zmienić kształt i średnicę mikronośników, jednak zalecany zakres to 25 – 35 mL/h. Choć zależy to w dużym stopniu od lepkości zawiesiny, szybkości przepływu poniżej 25 mL/h mogą prowadzić do powstawania większych mikronośników. Przy bardzo niskich szybkościach przepływu rozmiar i kształt mikronośników mogą stać się mniej jednorodne. Przy szybkościach infuzji powyżej 35 mL/h jednorodność kropli generowanych poprzez elektrozrozanie może zostać zaburzona, co doprowadzi do powstania niekulistych mikronośników o szerszym rozkładzie wielkości34.
  9. Przyłożyć napięcie 20 kV i włączyć pompę strzykawkową, aby rozpocząć elektrozrozanie.
    UWAGA: Napięcie można zmieniać w celu dostrojenia rozmiaru mikronośników; ma ono zazwyczaj większy wpływ na średnicę niż szybkość infuzji. Zalecany zakres napięcia to 15 – 25 kV. Wraz ze wzrostem napięcia spodziewany jest spadek średnicy mikronośników35.
  10. Po zakończeniu infuzji ostrożnie odlać nadmiar ciekłego azotu z kolby Dewara, pozostawiając mikronośniki w zawiesinie w ok. 25 mL ciekłego azotu, aby pozostały zamrożone.
  11. Niezwłocznie przenieść mikronośniki wraz z ciekłym azotem do probówki wirówkowej 50 mL, wlewając je jednym płynnym ruchem. Pozostałe w kolbie Dewara zamrożone mikronośniki zebrać za pomocą scoopuli i dodać do probówki wirówkowej.
    UWAGA: W zależności od rozmiaru kolby Dewara, mikronośniki w ciekłym azocie można początkowo przelać do naczynia średniej wielkości, a następnie niezwłocznie przenieść do probówki wirówkowej 50 mL.
  12. Przykryć probówkę wirówkową zawierającą mikronośniki w ciekłym azocie folią aluminiową z niewielkimi otworami w przygotowaniu do liofilizacji.
  13. Umieścić przykryte probówki wirówkowe w kolbie liofilizatora. Natychmiast podłączyć kolbę do liofilizatora i suszyć próbki przez noc (O/N).
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby mikronośniki pozostawały w zawiesinie w ciekłym azocie, tak aby nie rozmroziły się przed tym krokiem, ponieważ rozmrażanie może doprowadzić do zapadnięcia się i/lub agregacji. Mikronośniki DAT, DDT i DLV wytworzone w stężeniu 35 mg/mL przy zastosowaniu opisanych wyżej warunków elektrozrozania będą zazwyczaj miały średnicę w stanie uwodnionym w zakresie 350 – 500 μm. Rozkład wielkości może się różnić w zależności od źródła ECM.
  14. Przechowywać liofilizowane mikronośniki w eksykatorze do momentu użycia.

figure-protocol-1
Rycina 2. Przegląd aparatury do elektrosprayingu wykorzystywanej do wytwarzania mikronośników. A: Zdjęcie przedstawiające układ kluczowego sprzętu do elektrosprayingu, w tym pompy strzykawkowej i zasilacza wysokiego napięcia, a także położenie igły względem naczynia Dewar z ciekłym azotem. B: Schemat elektrosprayingu, zawierający zalecane zakresy napięcia, szybkości infuzji oraz odległości. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Przygotowanie pianek i mikronośników do hodowli komórkowej

  1. Rehydratacja
    1. Przenieść liofilizowane pianki za pomocą pęsety do probówki wirnikowej o pojemności 50 mL zawierającej nadmiar etanolu absolutnego (~ 99,9%) (stosunek etanolu do pianek ok. 5:1). W analogiczny sposób resuspendować liofilizowane mikronośniki w nadmiarze etanolu absolutnego w oryginalnej probówce wirnikowej użytej do ich zebrania. Za pomocą pipety serologicznej przefiltrować mikronośniki przez stalowe sito o określonej wielkości oczek do nowej probówki wirnikowej 50 mL, aby usunąć agregaty i wyselekcjonować pożądane zakresy wielkości.
      UWAGA: Jeśli pianki zostały wykonane w płytkach TCPS, można je rehydratować bezpośrednio w tych naczyniach.
    2. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 h lub do momentu, aż pianki lub mikronośniki opadną pod wpływem grawitacji na dno probówki wirnikowej. Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając sterylnych odczynników i właściwej techniki aseptycznej.
    3. Usunąć etanol absolutny za pomocą pipety serologicznej i dodać do rusztowań nadmiar (stosunek 5:1) 95% etanolu rozcieńczonego sterylnym solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS). Inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 h lub do momentu, aż rusztowania pochodne ECM opadną na dno naczynia do rehydratacji.
    4. Stopniowo rehydratować rusztowania poprzez serię stężeń etanolu (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 i 0%, rozcieńczone sterylnym PBS). Na każdym etapie inkubować w temperaturze 4 °C, aż rusztowania opadną na dno naczynia, przed wymianą roztworu. Odgazować rusztowania pod lekką próżnią, jeśli zaobserwowano tworzenie się pęcherzyków wewnątrz rusztowań.
    5. Wymienić sterylny PBS w ramach dwóch dodatkowych płukań, aby usunąć resztki etanolu.
    6. Przechowywać w 100% sterylnym PBS w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia hodowli komórkowej. Użyć rusztowań w ciągu 1–2 tygodni po rehydratacji.
  2. Przygotowanie do zasiewu komórek
    1. W dniu poprzedzającym zasiew przenieść pianki za pomocą pęsety do płytek wielodołkowych traktowanych do hodowli komórek lub wkładów transwell i dodać odpowiednią ilość pożywki do hodowli komórkowej (wybranej na podstawie interesującego nas typu komórek), aby całkowicie zanurzyć rusztowania (np. 2,5 mL/rusztowanie w płytce 12-dołkowej). Podobnie pozwolić mikronośnikom opaść pod wpływem grawitacji w probówce wirnikowej, ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając mikronośników, i dodać pożywkę do hodowli komórkowej, aby uzyskać stosunek pożywki do mikronośników 5:1.
      UWAGA: Do zasiewu ludzkich komórek ASC należy użyć pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) oraz mieszaniny odżywczej Ham's F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
    2. Wymienić pożywkę do hodowli komórkowej w ramach jednego płukania.
    3. Równoważyć rusztowania przez noc w pożywce do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C. Rusztowania będą gotowe do zasiewu komórek następnego dnia.
      UWAGA: Pianki można zasiewać statycznie we wkładach do hodowli komórkowej lub płytkach wielodołkowych do hodowli tkanek29, lub dynamicznie przy użyciu laboratoryjnego wytrząsarki36. W zależności od źródła ECM, metod przetwarzania i stężenia zawiesiny, zasiew dynamiczny może zwiększyć początkową adhezję, proliferację i infiltrację komórek. Mikronośniki można zasiewać dynamicznie przy użyciu systemu hodowli w bioreaktorze z mieszadłem (spinner culture system)11.

Wyniki

W niniejszym badaniu opracowano pianki i mikronośniki pochodne z ECM, wykorzystując ludzką DAT, świńską DDT oraz świńską DLV jako reprezentatywne przykłady wykazujące, że techniki te można zastosować do wytwarzania specyficznych dla tkanek bioszkieletów przy użyciu różnych tkanek decelularyzowanych jako źródeł ECM (Rysunek 1). W przypadku wytwarzania zarówno pianek, jak i mikronośników, zaadaptowano technikę Nishihary dotyczącą solubilizacji kolagenu za pomocą enzymu glikolitycznego α-amylase37, aby uzyskać lepką zawiesinę ECM z decelularyzowanych materiałów wyjściowych, która służy do syntezy bioszkieletów poprzez kontrolowane procedury zamrażania i liofilizacji.

Aby przygotować pianki, zdekularyzowane tkanki można poddać mechanicznemu rozdrobnieniu lub kriomieleniu w celu zwiększenia powierzchni przed trawieniem enzymatycznym. Po traktowaniu α-amylazą i homogenizacji, otrzymaną zawiesinę ECM dozuje się do formy o określonym kształcie, którą następnie zamraża i liofilizuje. Rusztowania te można stabilnie przechowywać w stanie suchym przez dłuższy czas. Przed zastosowaniem w badaniach hodowli komórkowych, liofilizowane rusztowania muszą zostać poddane kontrolowanemu procesowi rehydratacji, w wyniku którego powstają porowate i silnie uwodnione homogeniczne pianki pochodzące z czystego ECM (Rycina 3A). Jeśli pianki zostaną zrehydratowane zbyt szybko, gwałżczne pęcznienie może uszkodzić delikatne elementy strukturalne, co doprowadzi do utraty integralności i zapadnięcia się struktury. Co do zasady, po rehydratacji pianki zachowują kształt określony przez pierwotną formę i są stabilne bez konieczności chemicznego sieciowania. Rycina 3B przedstawia reprezentatywne obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (SEM) pianek DAT, DDT i DLV wykonanych z kriomielonego ECM o stężeniu 35 mg/mL i temperaturze zamrażania -80 °C.

figure-results-1
Rycina 3. Reprezentatywne obrazy pianek DAT, DDT i DLV wytworzonych z zawiesin ECM poddanych kriomieleniu przy stężeniu 35 mg/mL i zamrożonych w temperaturze -80 °C. A: Widok makroskopowy zmielonych pianek DAT, DDT i DLV zsyntetyzowanych w formie płytki hodowlanej z 48 dołkami po rehydratacji. Paski skali reprezentują 1 cm. B: Obrazy SEM pianek DAT, DDT i DLV wykazujące jednorodną porowatą ultrastrukturę. Paski skali reprezentują 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Kriomielone zawiesiny ECM można również wykorzystać do wytwarzania czystych mikronośników pochodzących z ECM za pomocą technik elektrosprayingu (Rysunek 2). Dla każdego źródła ECM można dostosować stężenie zawiesiny, rozmiar igły, szybkość infuzji oraz napięcie, aby uzyskać oddzielne sferyczne mikronośniki o średnicy od 350 do 500 μm po kontrolowanej rehydracji (Rysunek 4A). Choć mikronośniki mogą być przechowywane w stanie liofilizowanym, ze względu na łatwość manipulacji zaleca się ich dozowanie lub przesiewanie do pożądanego zakresu wielkości po ponownym zawieszeniu w etanolu. Obrazowanie SEM sugeruje, że ultrastruktura mikronośnika może się różnić w zależności od źródła tkanki zdecelularyzowanej (Rysunek 4B).

figure-results-2
Rysunek 4. Reprezentatywne obrazy mikronośników DAT, DDT i DLV wytworzonych z zawiesin ECM poddanych kriomieleniu przy stężeniu 35 mg/mL, szybkości infuzji 0,5 mL/min i przyłożonym napięciu 20 kV. A: Widok makroskopowy uwodnionych mikronośników DAT, DDT i DLV. Paski skali odpowiadają 4 mm. B: Obrazy SEM mikronośników DAT, DDT i DLV wykazujące, że ultrastruktura i rozmiar mogą różnić się w zależności od źródła ECM. Paski skali odpowiadają 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Właściwości mechaniczne rusztowań zależą od źródła ECM, zastosowanej metody przetwarzania (i.e. rozdrabnianie versus kriomielenie), stężenia zawiesiny ECM oraz temperatury zamrażania. Generalnie rusztowania są miękkie i podatne, przy czym moduły Younga w zakresie 1 - 5 kPa zgłoszono dla pianek DAT (50 & 100 mg/mL)29 i DLV (20 - 50 mg/mL)31, a < 1 kPa dla mikronośników. Pianki poddane kriomieleniu są zazwyczaj miększe niż pianki rozdrabniane ze względu na ich bardziej rozczłonkowaną strukturę. Do dokładnej charakterystyki właściwości ściskania niezbędne są specjalistyczne systemy testów mechanicznych wyposażone w wysokoczułe ogniwa obciążenia. Zazwyczaj pianki i mikronośniki wykazują niższe moduły niż natywne tkanki decelularyzowane ze względu na dodatkowe etapy przetwarzania w procesie wytwarzania, w tym trawienie enzymatyczne i homogenizację, a także na niekowalencyjny charakter sieciowania rusztowań. Może to być jednak zależne od analizowanej tkanki. Na przykład w poprzednich badaniach stwierdzono, że rozdrabniane pianki DAT wytwarzane przy wysokich stężeniach ECM (100 mg/mL) miały moduły zbliżone do natywnej tkanki tłuszczowej29.

Rehydratowane pianki i mikronosiacze pochodzące z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) mogą być zasiewiane komórkami w warunkach hodowli statycznej lub dynamicznej, aby zapewnić platformę wspomagającą wzrost komórek dla in vitro badania nad hodowlą komórkową i/lub in vivo dostarczanie komórek. Choć rusztowania zazwyczaj sprzyjają adhezji komórek, wydajność wysiewu będzie zależeć od źródła macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), geometrii i porowatości rusztowania oraz od badanego typu komórek. W związku z tym metody i gęstość wysiewu będą wymagały optymalizacji w zależności od określonych przez użytkownika warunków. W przypadku opisanych powyżej pianek zaleca się rozpoczęcie od stężenia komórek w zakresie 0,25 – 1 x 106 komórek/rusztowanie, z dynamicznym wysiewaniem na wytrząsarze orbitalnym w celu zwiększenia infiltracji komórek. W przypadku mikronośników sugerujemy początkową gęstość wysiewu w zakresie 25 000 – 50 000 komórek/mg mikronośników, przy czym wysiew powinien być przeprowadzony w warunkach dynamicznych w kolbie do hodowli z mieszadłem (spinner flask)11Obrazy przedstawione na dole Rycina 1 przedstawiają ludzkie ASC zasiane na piance DAT (po lewej) lub mikronośniku DAT (po prawej, uprzednio znakowanym barwnikiem reaktywnym z grupami aminowymi i wybarwionym na niebiesko)13), co zwizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej z użyciem fluorescencyjnego barwnika do oceny żywotności komórek (komórki żywe = zielone, komórki martwe = czerwone; paski skali oznaczają 100 µm). Do wizualizacji komórek wysianych na powierzchni pianek o grubości do 2 mm można wykorzystać mikroskopię konfokalną, jednak wizualizacja obszarów centralnych rusztowań jest ograniczona ze względu na ich nieprzezroczystość. Niemniej jednak pianki i mikronośniki można traktować jak tkanki i poddawać imprecji w parafinie lub kriosekcjonowaniu w celu przeprowadzenia analiz histologicznych i immunohistochemicznych, aby zwizualizować rozmieszczenie komórek oraz ekspresję markerów.

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, rusztowania pochodzące z tkanek pozbawionych komórek mogą bardziej zbliżyć się do złożonego składu 3D i struktury ECM w natywnym mikrośrodowisku komórkowym w porównaniu z syntetycznymi rusztowaniami lub standardowymi modelami hodowli opartymi na TCPS 2D. Jak wspomniano wcześniej, interakcje komórka-ECM są niezwykle ważne w pośredniczeniu w zachowaniu komórkowym zarówno w hodowli, jak i w organizmie1. Uznając, że biochemiczne, biofizyczne i biomechaniczne właściwości ECM są unikalne dla każdej tkanki, istnieje coraz więcej dowodów na poparcie uzasadnienia stosowania podejść specyficznych dla tkanek w projektowaniu biomateriałów dla inżynierii tkankowej, a także w opracowywaniu bardziej fizjologicznie istotnych modeli hodowli dla eksperymentów in vitro 20. Wykorzystując tkanki pozbawione komórek jako materiał wyjściowy, nasze metody mogą obejmować złożony skład specyficznego tkankowo ECM w bardziej konfigurowalnych formatach rusztowań. Podczas gdy etapy przetwarzania mechanicznego i enzymatycznego spowodują utratę natywnej ultrastruktury ECM, wcześniejsze badania z DAT wykazały, że pouczające efekty ECM pochodzącego z tkanki tłuszczowej są zachowane w tych formatach rusztowań, co sugeruje, że skład biorusztowania jest kluczowym mediatorem funkcji komórki11,29. Istotną zaletą stosowania pianek i mikronośników pochodzących z ECM jako substratów do hodowli komórkowych w porównaniu z nienaruszonymi tkankami pozbawionymi komórek jest to, że są one bardziej jednorodne, co może poprawić jednorodność dystrybucji komórek i interakcji komórka-komórka/komórka-ECM.

Opisane tutaj metody mogą być wykorzystane do wygenerowania szerokiej gamy specyficznych dla tkanek biorusztowań do wykorzystania w hodowlach komórkowych i zastosowaniach inżynierii tkankowej. Na przykład, oprócz DAT, DDT i DLV, nasze laboratorium z powodzeniem zastosowało te techniki do generowania porowatych pianek 3D przy użyciu zdecelularyzowanych kości, chrząstek, jądra miażdżystego i zwłóknienia pierścienia, a także dostępnego na rynku, nierozpuszczalnego kolagenu pochodzącego ze ścięgna bydlęcego. Z perspektywy in vitro te biorusztowania mogą być wykorzystane jako podstawa dla modeli kultur 3D o wyższej wierności do badania biologii komórkowej, fizjologii lub patologii chorób38, jako bioaktywne substraty w wysokoprzepustowych platformach przesiewowych leków39 lub jako matryce instruktażowe do różnicowania komórek macierzystych40,41. Pianki DAT, DDT i DLV wytwarzane w stężeniach 25 - 50 mg/ml są stabilne w długotrwałych hodowlach in vitro (testowane do 28 dni). Co więcej, wszystkie trzy typy mikronośników mogą wspomagać przyłączanie i proliferację komórek w dynamicznych warunkach w systemie hodowli przędzarki o niskim ścinaniu (10 - 15 obr./min) przez co najmniej 2 tygodnie. W przypadku zastosowań in vivo, biokompatybilne i biodegradowalne pianki i mikronośniki pochodzące z ECM są obiecujące jako gotowe produkty stymulujące konstruktywną przebudowę i regenerację tkanek11,29. Co więcej, rusztowania adhezyjne mogą być wykorzystywane jako systemy dostarczania terapii komórkowej42,43. Na przykład wykazano, że pianki DAT promują angiogenezę i adipogenezę, gdy są wysiewane allogenicznymi ASC i wszczepiane podskórnie w immunokompetentnym modelu szczura29. W porównaniu z nienaruszonym DAT, bardziej przetworzone pianki DAT ulegały znacznie szybszej degradacji, z 50% zmniejszeniem objętości po 3 tygodniach, gdy integrowały się z tkankami gospodarza, i prawie całkowitą resorpcją po 12 tygodniach. Jednak pianki wywołały również silniejszą odpowiedź angiogenną, co sugeruje, że trawiony enzymatycznie ECM miał unikalne działanie proregeneracyjne. Podobnie, mikronośniki pochodzące z ECM mogą być stosowane jako substraty do hodowli komórkowych in vitro w dynamicznych systemach hodowli oraz jako wstrzykiwane nośniki dostarczania komórek 11,30,44. Mówiąc dokładniej, mała średnica i duża powierzchnia mikronośników mogą umożliwić dostarczenie dużej ilości komórek w małej objętości, zapewniając jednocześnie matrycę, która może pomóc w utrzymaniu żywotności komórek i zwiększeniu retencji komórek w miejscu wstrzyknięcia30. Przed użyciem w jakimkolwiek żywym systemie ważne jest, aby upewnić się, że źródłowy ECM jest zasadniczo pozbawiony antygenowych składników komórkowych i/lub potencjalnie cytotoksycznych odczynników decelularyzacyjnych, które mogłyby wywołać negatywną odpowiedź gospodarza7.

Enzym proteolityczny pepsyna jest powszechnie stosowany do wytwarzania hydrożeli pochodzących z ECM15. Pepsyna jest niespecyficzną proteazą, która trawi kolagen i inne białka ECM na małe fragmenty45. Podczas gdy doniesiono, że hydrożele wytwarzane z ECM trawionego pepsyną mają działanie instruktażowe dla komórek, ograniczeniem jest to, że materiały te są zwyklebardzo słabe mechanicznie. W naszym początkowym rozwoju mikronośników DAT wykorzystaliśmy podejście złożone, w którym DAT trawiony pepsyną połączono z alginianem i dodano kroplami do CaCl2 , tworząc kuliste kulki30. Koraliki zostały następnie fotousieciowane, a alginian wyekstrahowano za pomocą cytrynianu sodu. Oprócz wymogu sieciowania chemicznego, kluczowym ograniczeniem było to, że mikronośniki wytwarzane przy użyciu tego podejścia miały słabą stabilność poniżej zakresu rozmiarów 900 - 950 μm30. Zamiast pepsyny, przedstawione tutaj metody wykorzystują łagodniejsze trawienie ECM za pomocą enzymu glikolitycznego α-amylazy, który postuluje rozszczepianie grup węglowodanowych z regionów telopeptydowych kolagenu, zwiększając w ten sposób rozpuszczalność w kwasie octowym37. Takie podejście umożliwia izolację wysoce spolimeryzowanego kolagenu, który można wykorzystać do wytworzenia czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM bez konieczności chemicznego sieciowania lub innych dodatków. Te biorusztowania są stabilizowane poprzez interakcje fizyczne i wiązania wodorowe między dobrze zachowanymi włókienkami kolagenowymi, podobnie jak kolagen w natywnym mikrośrodowisku ECM.

Pianki są wysoce elastyczną platformą, która może być wytwarzana w szerokim zakresie geometrii w zależności od wybranej formy. W przypadku badań nad kulturami komórkowymi pianki mogą być odlewane bezpośrednio w płytkach studzienkowych TCPS, w celu utworzenia powłok lub rusztowań 3D o różnej grubości. Aby wytworzyć pianki 3D o bardzo jednolitych powierzchniach, zaleca się zaprojektowanie niestandardowej formy, którą można uszczelnić z obu stron za pomocą plastikowych lub szklanych szkiełek. Do syntezy pianek można użyć mielonego lub zmielonego kriogenicznie ECM. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdziliśmy, że pianki kriomielone są zwykle makroskopowo bardziej miękkie i mają bardziej zaburzoną ultrastrukturę przy niższych stężeniach31,36. W zależności od źródła tkanki, dodatkowe etapy obróbki mechanicznej mogą powodować zmiany w składzie ECM, które mogą wpływać na funkcjonowanie komórek. Na przykład w naszej poprzedniej pracy lamininę wykryto w mielonych piankach DLV, ale nie w kriomielonych piankach DLV31. Natomiast kolagen I, kolagen IV, laminina i fibronektyna zostały wykryte zarówno w mielonych, jak i kriomielonych piankach DAT36. Oprócz etapów obróbki mechanicznej, porowatość i wielkość porów pianek można w pewnym stopniu dostroić poprzez zmianę stężenia zawiesiny ECM i temperatury zamarzania47. Ogólnie rzecz biorąc, pianki o niższym stężeniu (~ 10 - 15 mg/ml) są jakościowo bardziej porowate, ale mogą szybko się kurczyć i mieć słabą stabilność w długotrwałej hodowli31,36. Podobnie, wolniejsze tempo zamarzania, zwykle osiągane przez wyższą temperaturę zamarzania, może powodować większe pory w piankach ze względu na wielkość kryształków lodu powstałych podczas produkcji29. Wszystkie te parametry mogą wpływać na interakcje komórek z materiałami, w tym na przyczepianie, infiltrację i przebudowę. Na przykład wzrost komórek na piankach, które są wytwarzane z wyższymi stężeniami ECM, może być ograniczony do obszarów powierzchniowych, szczególnie w przypadku zmielonych źródeł ECM i w warunkach hodowli statycznej36.

W przypadku mikronośników kluczowymi parametrami, które można dostroić, są stężenie zawiesiny ECM, rozstaw igieł i przyłożone napięcie, przy czym wyższe stężenia zazwyczaj dają mikronośniki, które są bardziej stabilne w długotrwałej hodowli dynamicznej. Po rozpoczęciu elektronatryskiwania kropelki zawiesiny ECM powinny szybko opaść do środka kolby, w kierunku kolektora z folii aluminiowej. Aby zapobiec agregacji, ważne jest, aby kulki stykały się z ciekłym azotem przed folią. Odległość między igłą a powierzchnią ciekłego azotu można dostosować, aby spełnić te wymagania. Należy zauważyć, że optymalizacja może być wymagana w zależności od właściwości każdego konkretnego źródła ECM, w szczególności przy wyborze zakresu stężeń, który będzie generował stabilne biorusztowania. Innym kluczowym czynnikiem jest protokół decelularyzacji, który jest używany do generowania materiałów wyjściowych, ponieważ metody decelularyzacji, które degradują ECM lub obecność resztkowych odczynników (np. środków powierzchniowo czynnych) może negatywnie wpłynąć na stabilność powstałych pianek i mikronośników. Jeśli napotkasz wyzwania związane ze stabilnością biorusztowania, opcje, które można zbadać, obejmują zastosowanie bardziej stopniowego procesu nawadniania, zwiększenie stężenia zawiesiny ECM oraz zbadanie ECM mielonego i kriomielonego. Jeśli wszystkie te opcje nie rozwiążą problemu, może być konieczne zbadanie alternatywnych protokołów decelularyzacji lub źródeł ECM.

Aby zapewnić powtarzalność podczas produkcji rusztowań, należy zachować szczególną ostrożność na niektórych etapach protokołu. Podczas kriomielenia tkanek pozbawionych komórek zaleca się, aby mielenie odbywało się natychmiast po liofilizacji w suchym środowisku, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo agregacji cząstek w wyniku absorpcji wilgoci z otoczenia. Podczas wytwarzania mikronośnika sugeruje się, aby zawiesina była natryskiwana elektrolitycznie w małych partiach, o maksymalnej objętości 3 ml, aby uniknąć problemów z chłodzeniem próbki, które mogą spowodować zatkanie igły. Ponadto ważne jest, aby mikronośniki nie mogły się rozmrozić po procesie elektronatryskiwania. Aby zachować ich sferyczną geometrię i stabilność mechaniczną, mikronośniki powinny być pobierane z ciekłego azotu, transportowane w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem i natychmiast liofilizowane. Wreszcie, zarówno w przypadku pianek, jak i mikronośników, bardzo ważne jest, aby etapy nawadniania były wykonywane powoli przez kilka dni. Szybkie nawodnienie może spowodować załamanie strukturalne w skali makro i/lub mikro. Ponadto ponowne nawodnienie musi następować powoli, aby zapobiec tworzeniu się małych pęcherzyków powietrza w rusztowaniu, które mogą wymagać znacznej ilości czasu na odgazowanie w lekkiej próżni.

Podsumowując, metody przedstawione w tym artykule mogą być wykorzystane do wytwarzania różnorodnej gamy specyficznych dla tkanek pianek i mikronośników składających się z czystego, nieusieciowanego chemicznie ECM. Zaletą dla badaczy biologii jest to, że rusztowania są łatwe w obsłudze i mogą być przetwarzane podobnie jak tkanki podczas wykonywania analiz za pomocą technik takich jak histologia, immunohistochemia lub testy ekspresji genów i białek. Ponadto rusztowania pochodzące z ECM mogą być degradowane enzymatycznie w celu ekstrakcji wysiewanych populacji komórek lub mogą być wykorzystywane bezpośrednio jako biodegradowalne i biokompatybilne nośniki komórek. Ogólnie rzecz biorąc, ta elastyczna technologia platformy jest bardzo przydatna w wielu zastosowaniach, w tym w badaniach 3D nad kulturami komórkowymi badającymi funkcję komórki, jako substraty do ekspansji komórek oraz jako proregeneracyjne biorusztowania.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Kanadyjska Rada ds. Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC) oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) zapewniły fundusze na tę pracę. Autorzy chcieliby podziękować dr Aminowi Rizkalli za wykorzystanie jego systemu do elektronatryskiwania, Nanofabrication Facility na Uniwersytecie Zachodnim za użycie sprzętu do obrazowania SEM, rzeźni Mount Brydges za dostarczenie próbek tkanek świń oraz dr Aaronowi Grantowi, Brianowi Evansowi i Robertowi Richardsowi za ich współpracę kliniczną na rzecz tych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy, lodowatyBioShopACE222.500
Przewody z zaciskiem krokodylkowymVWR470149-728
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-101
&alfa;-amylazaSigma101074694z Aspergillus aryzae
Waga analitycznaSartoriusCPA225D
WirówkaThermo Scientific75004251Z wahliwym wirnikiem kubełkowym do probówek wirówkowych 15 i 50 ml
Probówki wirówkowe (15 ml)Sarstedt62.554.205
Probówki wirówkowe (50 ml)Sarstedt62.547.205
Kolagen ze ścięgna Achillesa bydlęcego (nierozpuszczalny)SigmaC9879 Lub podobne nierozpuszczalne źródło kolagenu; Może być stosowany jako alternatywa dla tkanek bezkomórkowych do wytwarzania pianek i mikronośników
System kriomieleniaRetsch20.745.0001MM 400
EksykatorFisher Scientific8624426Do liofilizowanego ECM i przechowywania biorusztowań
DMEM: F12 SzynkiSigmaD6421Używany do pożywek proliferacyjnych
Kolba DewaraFisher Scientific10-196-6Niska forma; zakres objętości 250 - 500 ml
Podwójnie destylowana woda (ddH2O)Z systemu oczyszczania wody Barnstead GenPure xCAD
D-PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Żubr311425125
ECM (macierz zewnątrzkomórkowa)Izolowany z ludzkiej tkanki tłuszczowej, skóry właściwej świni lub mięśnia sercowego świni, zgodnie z opisem w Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 oraz Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
EthanolGreenfield Specialty Alcohols Inc.P016EAANAbsolutna
płodowa surowica bydlęca (FBS)Żubr80150Stosowany do pożywek proliferacyjnych
KleszczeVWR37-501-32Do przenoszenia pianek
Zamrażarka (-20 ° C)Zamrażarka VWR97043-346
(-80 & deg; C)Thermo ScientificEXF40086A
Fiolki szklaneFisher Scientific03-339-26DDo przechowywania liofilizowanego kriofrezowanego ECM
Ręczny homogenizatorFisher Scientific14-359-251Prędkość: 8 000 - 30 000 obr./min
Akcesoria do homogenizatora: sondy generatora z zębami piłyFisher Scientific14-261-1710 x 95 mm
Ciekły azotDo elektronatryskiwania
LiofilizatorLabconco7750021FreeZone4.5
Komora mieleniaRetsch02.462.0213Zalecana objętość 25 mL
Kule mieląceVWR16003-606Średnica 10 mm, zalecana stal nierdzewna
Igła 18 GVWRC ABD305185Do dozowania zawiesiny ECM do form
Orbital wytrząsarka inkubatoraSciLogex832010089999Kontrolowana temperatura (37 ° C)
Penicylina-streptomycynaLife Technologies15140-122Używany do mediów proliferacyjnych
Pipet-Aid XPMandel ScientificDRU-4-000-101
Stojak retortowyVWR470019-526
Zacisk stojaka do retortyVWR21573-606
Safety-Lok StrzykawkaBD309606Strzykawka Luer lock 3 ml do wytwarzania i dozowania zawiesiny ECM do mikronośników
Pipety serologiczne (10  mL)Sarstedt86.1254.001
Pipety serologiczne (25 mL)Sarstedt86.1685.001
Chlorek soduBioShop7647-14-5
Fosforan sodu jednozasadowyBioShop10049-21-5
ScoopulaVWR89259-968Do zbierania mikronośników
Nożyczki chirurgiczneVWR82027-590
Pompa strzykawkowaVWR10117-490Sterowany mikroprocesorem
zasilacz wysokonapięciowyGamma High Voltage ResearchES30P-5W/DDPMZdolny do zalecanego zakresu napięcia 15 - 25 kV
Płytki 12-dołkoweFisher Scientific12565321Do stosowania jako formy podczas produkcji pianki; Można również wybrać inne rozmiary lub formy zdefiniowane przez użytkownika
Zestaw do infuzji ze skrzydłamiTerumo2225809230 cm długości rurki, zalecane 25 G 3/4"; Można stosować inne rozstawy igieł, które mogą wpływać na średnicę mikronośnika

Bibliografia

  1. Eweida, A. M., Marei, M. K. Naturally Occurring Extracellular Matrix Scaffolds for Dermal Regeneration: Do They Really Need Cells? Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  3. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From Cell-ECM Interactions to Tissue Engineering. J. Cell. Phys. 199 (2), 174-180 (2004).
  4. Du, J., et al. Extracellular Matrix Stiffness Dictates Wnt Expression Through Integrin Pathway. Sci. Rep. 6, 4195-4200 (2016).
  5. Badylak, S. F. The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction. Cell & Dev. Biol. 13 (2), 377-383 (2002).
  6. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of Tissues and Organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  7. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An Overview of Tissue and Whole Organ Decellularization Processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  8. Reing, J. E., et al. The Effects of Processing Methods Upon Mechanical and Biologic Properties of Porcine Dermal Extracellular Matrix Scaffolds. Biomaterials. 31 (33), 8626-8633 (2010).
  9. Yang, Q., et al. Morphological Appearance, Content of Extracellular Matrix and Vascular Density of Lung Metastases Predicts Permissiveness to Infiltration by Adoptively Transferred Natural Killer and T Cells. Cancer Immun. Immunother. 55 (6), 699-707 (2006).
  10. Calle, E., Ghaedi, M., Sundaram, S., Sivarapatna, A., Tseng, M. K., Niklason, L. E. Strategies for Whole Lung Tissue Engineering. IEEE Trans. Biomed. Eng. 61 (5), 1482-1496 (2014).
  11. Turner, A. E. B., Yu, C., Bianco, J., Watkins, J. F., Flynn, L. E. The Performance of Decellularized Adipose Tissue Microcarriers as an Inductive Substrate for Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 33 (18), 4490-4499 (2012).
  12. Brown, C. F. C., Yan, J., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Effect of Decellularized Adipose Tissue Particle Size and Cell Density on Adipose-Derived Stem Cell Proliferation and Adipogenic Differentiation in Composite Methacrylated Chondroitin Sulphate. Biomed. Mater. 10 (4), 1-12 (2015).
  13. Cheung, H. K., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Watkins, J. F., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Composite Hydrogel Scaffolds Incorporating Decellularized Adipose Tissue for Soft Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 35 (6), 1914-1923 (2014).
  14. Almeida, H. V., Eswaramoorthy, R., Cunniffe, G. M., Buckley, C. T., O'Brien, F. J., Kelly, D. J. Fibrin Hydrogels Functionalized with Cartilage Extracellular Matrix and Incorporating Freshly Isolated Stromal Cells as an Injectable for Cartilage Regeneration. Acta Biomat. 36, 55-62 (2016).
  15. Wassenaar, J. W., Braden, R. L., Osborn, K. G., Christman, K. L. Modulating in vivo Degradation Rate of Injectable Extracellular Matrix Hydrogels. J. Mater. Chem. B. 4 (16), 2794-2802 (2016).
  16. Ugerleider, J. L., et al. Extracellular Matrix Hydrogel Promotes Tissue Remodeling, Arteriogenesis, and Perfusion in a Rat Hindlimb Ischemia Model. JACC Basic Transl. Sci. 1 (1-2), 32-44 (2015).
  17. Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Eng. Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
  18. Pati, F., et al. Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular. Matrix Bioink. Nat. Commun. 5, 3935(2014).
  19. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D Cell Culture Systems - Advantages and Applications. J. Cell. Phys. 230 (1), 16-26 (2015).
  20. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. Three-dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. Tissue Eng Part B, Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  21. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The Third Dimension Bridges the Gap Between Cell Culture and Live Tissue. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  22. Bouet, G., Marchat, D., Cruel, M., Malaval, L., Vico, L. In Vitro Three-Dimensional Bone Tissue Models: From Cells to Controlled and Dynamic Environment. Tissue Eng. Part B Rev. 21 (1), 133-156 (2015).
  23. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene Expression Perturbation in vitro - A Growing Case for Three-Dimensional (3D) Culture Systems. Sem. Cancer Biol. 15 (5), 405-412 (2005).
  24. Bonnier, F., et al. Cell Viability Assessment Using the Alamar Blue Assay: A Comparison of 2D and 3D Cell Culture Models. Toxicology in vitro. 29 (1), 124-131 (2015).
  25. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The Extracellular Matrix at a Glance. J. Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
  26. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential Effects of Tissue Culture Coating Substrates on Prostate Cancer Cell Adherence, Morphology and Behavior. PLoS ONE. 9 (11), e112122(2014).
  27. McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified Three-Dimensional Culture System for Long-Term Expansion of Embryonic Stem Cells. World J. Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
  28. Flynn, L. E. The Use of Decellularized Adipose Tissue to Provide an Inductive Microenvironment for the Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  29. Yu, C., et al. Porous Decellularized Adipose Tissue Foams for Soft Tissue Regeneration. Biomaterials. 34 (13), 3290-3302 (2013).
  30. Turner, A. E. B., Flynn, L. E. Design and Characterization of Tissue-Specific Extracellular Matrix-Derived Microcarriers. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (3), 186-197 (2012).
  31. Russo, V., Omidi, E., Samani, A., Hamilton, A., Flynn, L. E. Porous, Ventricular Extracellular Matrix-Derived Foams as a Platform for Cardiac Cell Culture. Biores Open Access. 4 (1), 374-388 (2015).
  32. Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Eng. Part C, Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
  33. Owen, S. C., Fisher, S. A., Tam, R. Y., Nimmo, C. M., Shoichet, M. S. Hyaluronic Acid Click Hydrogels Emulate the Extracellular Matrix. Langmuir. 29 (24), 7393-7400 (2013).
  34. Zargham, S., Bazgir, S., Tavakoli, A., Rashidi, A. S., Damerchely, R. The Effect of Flow Rate on Morphology and Deposition Area of Electrospun Nylon 6 Nanofiber. J. Eng. Fibers Fabr. 7 (4), 42-49 (2012).
  35. Gryshkov, O., Pogozhykh, D., Zernetsch, H., Hofmann, N., Mueller, T., Glasmacher, B. Process Engineering of High Voltage Alginate Encapsulation of Mesenchymal Stem Cells. Mater. Sci. Eng. C Biol. Appl. 36, 77-83 (2014).
  36. Turco, B. Characterization and Cell-Seeding of Decellularized Adipose Tissue Foams for Wound Healing. , Queen's University. Kingston, Ontario, Canada. (2014).
  37. Steven, F. S. The Nishihara Technique for the Solubilization of Collagen. Application To the Preparation of Soluble Collagens From Normal and Rheumatoid Connective Tissue. Ann. Rheum. Dis. 23, 300-301 (1964).
  38. Hansen, N. U. B., Genovese, F., Leeming, D. J., Karsdal, M. A. The Importance of Extracellular Matrix for Cell Function and in vivo Likeness. Exp. Mol. Pathol. 98 (2), 286-294 (2015).
  39. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D Cell Culture Opens New Dimensions in Cell-Based Assays. Drug Discov. Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  40. Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
  41. Liao, J., Guo, X., Grande-Allen, K. J., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Bioactive Polymer/Extracellular Matrix Scaffolds Fabricated with a Flow Perfusion Bioreactor for Cartilage Tissue Engineering. Biomaterials. 31 (34), 8911-8920 (2010).
  42. Choi, Y. C., Choi, J. S., Woo, C. H., Cho, Y. W. Stem Cell Delivery Systems Inspired by Tissue-Specific Niches. J. Control. Release. 193, 42-50 (2014).
  43. Han, T. T. Y., Toutounji, S., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Adipose-Derived Stromal Cells Mediate in vivo Adipogenesis , Angiogenesis and Inflammation in Decellularized Adipose Tissue Bioscaffolds. Biomaterials. 72, 125-137 (2015).
  44. Yu, C., Kornmuller, A., Flynn, L. E. Porous Decellularized Extracellular Matrix Microcarriers for Tissue-Specific Cell Expansion and Delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. , (2016).
  45. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. J. Food Sci. 81 (1), C27-C34 (2016).
  46. Lin, H., Yang, G., Tan, J., Tuan, R. S. Influence of Decellularized Matrix Derived from Human Mesenchymal Stem Cells on their Proliferation, Migration and Multi-Lineage Differentiation Potential. Biomaterials. 33 (18), 4480-4489 (2012).
  47. Fonte, P., Reis, S., Sarmento, B. Facts and Evidences on the Lyophilization of Polymeric Nanoparticles for Drug Delivery. J. Control. Release. 225, 75-86 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Piany z macierzy pozakom rkowejmikrono niki ECMrusztowania specyficzne dla tkanekprzetwarzanie tkanek decelularyzowanychprzygotowanie zawiesiny ECMkontrolowana liofilizacja z zamra aniemtechnika elektrosprayowaniaplatformy do 3D hodowli kom rekrusztowania bez sieciowania chemicznegosystemy dostarczania w medycynie regeneracyjnej

Powiązane artykuły