Artykuł metodologiczny

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

DOI:

10.3791/55438

⸱

2 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins Hospital, 2Division of Cardiology, Johns Hopkins Hospital, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomateriałów, przy użyciu tylko komórek. Kardiomiocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty są najpierw izolowane, liczone i mieszane w pożądanych proporcjach komórek. Są one hodowane wspólnie w indywidualnych studzienkach na 96-dołkowych płytkach o bardzo niskim przyłączeniu. W ciągu 3 dni tworzą się bijące sferoidy. Te sferoidy są następnie zbierane przez dyszę za pomocą ssania próżniowego i montowane na matrycy igieł za pomocą biodrukarki 3D. Sferoidy są następnie pozostawione do stopienia na układzie igieł. Trzy dni po biodruku 3D sferoidy są usuwane jako nienaruszona plama, która już spontanicznie bije. Biodrukowane w 3D plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele różnych metod biodruku 3D1,2,3. 3D bioprinting jest często klasyfikowany według technologii druku1, z przykładami takimi jak bioprinting atramentowy, bioprinting mikroekstruzyjny, bioprinting wspomagany laserowo, kombinacja metod lub nowsze approaches. 3D bioprinting można również zaklasyfikować do metod wolnych od rusztowań lub zależnych od rusztowań4. Większość metod biodruku 3D jest zależna od rusztowań, gdzie istnieje zapotrzebowanie na biomateriały, np. bioinks5 lub scaffolds6. Jednak biodruk 3D zależny od rusztowania napotyka wiele problemów i ograniczeń4,7, takich jak immunogenność materiału rusztowania, koszt zastrzeżonych biotuszy, niska prędkość i toksyczność produktów degradacji.

Podjęto próbę inżynierii tkanek serca bez rusztowań przy użyciu sferoidów8, z potencjałem do przezwyciężenia tych wad inżynierii tkankowej zależnej od rusztowań. Jednak, jak przyznali autorzy w tym artykule, trudno było solidnie obsługiwać i umieszczać sferoidy w stałych miejscach w procesie biofabrykacji. Jednoczesne zastosowanie biodruku 3D i inżynierii tkankowej opartej na sferoidach ma potencjał, aby przezwyciężyć te trudności. W tym protokole opisujemy biodruk 3D tkanki serca bez innych biomateriałów, przy użyciu wyłącznie komórek w postaci sferoid.

Biodrukarki 3D bez rusztowań sferoidalne9 mają możliwość podnoszenia pojedynczych sferoid za pomocą ssania próżniowego i umieszczania ich na układzie igieł. Koncepcja pozycjonowania sferoid na tablicy igieł w biodruku 3D jest inspirowana zastosowaniem układów igieł (znanych jako "kenzan") w starożytnej japońskiej sztuce układania kwiatów, ikebanie. System ten pozwala na precyzyjne ustawienie sferoid w dowolnej konfiguracji i powoduje, że poszczególne sferoidy łączą się ze sobą w krótkim czasie, tworząc biodrukowaną tkankę 3D. Metoda ta pozwala zatem na łatwe manipulowanie sferoidami, co może mieć potencjalne implikacje dla przyszłości biofabrykacji narządów bez rusztowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kardiomiocytów

  1. Wygeneruj i hoduj ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej, jak opisano10.
  2. Różnicowanie hiPSC na kardiomiocyty pochodzące z hiPSC (hiPSC-CMs) przy użyciu wcześniej opisanych metod11,12.
  3. W 19 dniu po różnicowaniu wyizolować kardiomiocyty za pomocą 2 ml trypsyny/EDTA 0,05% w każdym dołku przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Monitoruj kardiomiocyty pod mikroskopem optycznym, aby obserwować dysocjację komórek.
  5. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 2 ml inhibitora trypsyny 0,0125%.
  6. Połącz izolowane kardiomiocyty i przenieś je do jednej stożkowej rurki o pojemności 50 ml za pomocą zmotoryzowanego napełniacza pipety.
  7. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osadu.
  8. Zawiesić osad w 5 ml pożywki komórkowej Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej B-27 (pożywka komórkowa RPMI/B-27).
  9. Odpipetować 20 μl komórek w pożywce komórkowej i wybarwić równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
  10. Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność zawiesiny komórek.

2. Przygotowanie fibroblastów

  1. Zainicjuj linię komórkową ludzkiego fibroblastu serca (HCF) (dorosłego typu komorowego)13.
  2. Przejście i odizolowanie ich zgodnie z protokołami hodowli HCF13.
  3. Odpipetować 20 μl komórek w pożywce komórkowej i wybarwić równą ilością roztworu błękitu trypanowego 0,4%.
  4. Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność nowej zawiesiny komórek.

3. Przygotowanie komórek śródbłonka

  1. Zainicjuj linię ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zgodnie z opisem14. Przejdź i wyizoluj je zgodnie z protokołami hodowli HUVEC zgodnie z opisem14.
  2. Odpipetować 20 μl komórek w pożywce komórkowej i wybarwić równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
  3. Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność zawiesiny komórek.

4. Współkultura:

  1. Wymieszaj trzy typy komórek (hiPSC-CM, HCF i HUVEC) w pożywkach komórkowych RPMI/B-27, aby wytworzyć zapas roztworu mieszanych komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, przy stosunku komórek hiPSC-CM:HCF:HUVEC wynoszącym 70:15:15 i stężeniu 165 000 komórek na ml.
  2. Rozprowadź roztwór mieszanych komórek na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U o bardzo niskim mocowaniu w ilości 200 μl na dołek lub 33 000 komórek na dołek, używając pipety wielokanałowej.
  3. Inkubować 96-dołkowe płytki przez 3 dni (37°C, 5% dwutlenku węgla, 95% wilgotności).
  4. Sprawdzić, czy w środku i na dnie poszczególnych studzienek znajdują się wielokomórkowe sferoidy o mieszanych komórkach, pod mikroskopem świetlnym.
    UWAGA: W dwuwymiarowej projekcji mikroskopowej sferoidy te będą miały okrągły kształt (Rysunek 1). Sferoidy powinny uformować się w ciągu 24 godzin, po wysianiu komórek do 96-dołkowych płytek o bardzo niskim przyłączeniu. Sferoidy powinny zacząć bić w ciągu 48 godzin, po wysianiu komórek do 96-dołkowych płytek. Sferoidy, które nie biją, nie powinny być używane do biodruku 3D, aby zapewnić, że ostateczna biodrukowana w 3D łatka serca jest funkcjonalna. Immunofluorescencja sferoidów dla koneksyny 43 (Cx43) i troponiny może być wykorzystana do oceny składu i jakości komórek sferoidalnych15.

5. 3D Bioprinting tkanek serca bez rusztowań

  1. Załaduj płytki zawierające sferoidy do magazynków biodrukarki 3D opartej na sferoidach bez rusztowań.
  2. Włącz biodrukarkę 3D i uruchom oprogramowanie do biodruku 3D.
    1. Kliknij "Pomocniczy", "Przygotowanie do operacji", "Tryb inspekcji", a następnie "Powrót do domu".
    2. Kliknij zieloną ikonę w obszarze "Start", aby rozpocząć inspekcję sferoidów.
    3. Zwróć uwagę, czy średnice sferoid pojawią się pod kolumną "(2) Dia (μm)" na ekranie.
  3. Aby oszacować średnią średnicę sferoidy z dokładnością do 100 μm, kliknij "Ustawienia początkowe" i wprowadź średnią średnicę sferoidy w polu Podziałka stosu Z (μm).
  4. Kliknij "Łącznie", liczba w sekcji "Warstwy" powinna zostać automatycznie dostosowana. Kliknij "Zastosuj", aby potwierdzić ustawienia.
  5. Kliknij "Mapa macierzy igieł", przejdź do "Nr warstwy", wybierz żądaną warstwę do biodruku 3D i narysuj żądany projekt biodruku 3D na mapie po lewej stronie ekranu, wybierając poszczególne pozycje sferoidów. Kliknij "Zastosuj", aby potwierdzić projekt biodruku 3D.
  6. Kliknij "Kontrola szyku igieł", aby rozpocząć inspekcję szyku igieł. Jeśli układ igieł jest nieostry, wprowadź wartości do "OffsetZ (μm)", w zakresie od 0 do 500 μm, aby dostosować ostrość kamery, zaczynając od 500 μm i zmniejszając o 100 μm do 0 μm.
  7. Kliknij "Parametry kontroli", "Typ 1" i ustaw "Średnica (μm)" na żądany zakres średnic. Ustaw "Zaokrąglenie (%)" i "Gładkość (%)" na żądane wartości procentowe. Kliknij "Zastosuj", aby potwierdzić ustawienia.
    UWAGA: Tutaj średnice sferoid zostały ustawione w zakresie od 450 μm do 550 μm. "Okrągłość (%)" i "Gładkość (%)" są obliczoną komputerowo oceną każdej pojedynczej sferoidy. Tutaj ustawienia używane dla "Zaokrąglenia (%)" to 60%, a "Gładkość (%)" to 70%.
  8. Kliknij "Obecność" i zaktualizuj "Średnicę (μm)" do tych samych ustawień co w poprzednim kroku. Kliknij "Zastosuj", aby potwierdzić ustawienia.
  9. Kliknij "Tryb stosu", a następnie zieloną ikonę w obszarze "Start", aby rozpocząć pobieranie sferoidów za pomocą dyszy biodrukarki 3D poprzez odsysanie próżniowe i umieszczanie sferoid w określonych miejscach w układzie igieł.
    UWAGA: W przypadku plastra serca składającego się z 81 sferoid (9 sferoid x 9 sferoidów), biodrukowanie 3D powinno zająć około 20 do 30 minut.
  10. Po bioprintingu, za pomocą sterylnych kleszczy, podnieś matrycę igieł zawierającą biodrukowaną łatkę 3D i przenieś ją do sterylnej zlewki o pojemności 250 ml zawierającej 150 ml pożywki komórkowej RPMI/B-27.
  11. Inkubuj biodrukowany plaster 3D za pomocą zestawu igieł przez 3 dni (37°C, 5% dwutlenku węgla, 95% wilgotności).

6. Usunięcie biodrukowanej łatki 3D z matrycy igieł i dojrzewanie łaty

  1. Po 3 dniach inkubacji, trzymając jedną rękę u podstawy układu igieł, a drugą na plastikowej osłonie pod plastrem, delikatnie przesuń plastikową osłonę do góry, aby usunąć biodrukowaną łatkę 3D z matrycy igieł.
    UWAGA: W razie potrzeby można nasmarować igły solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), w razie potrzeby, w celu płynniejszego i łatwiejszego usuwania.
  2. Za pomocą pary sterylnych kleszczy podnieś plastikową osłonę z biodrukowaną naszywką 3D na wierzchu i przenieś plaster i plastikową osłonę do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego pożywkę komórkową RPMI/B-27.
  3. Delikatnie potrząśnij plastikową osłoną z plastrem w pożywce z ogniwami RPMI/B-27, trzymając kleszcze nadal trzymające się plastikowej osłony, aby uwolnić plaster do podłoża.
  4. Sprawdź biodrukowaną łatkę 3D pod mikroskopem świetlnym, aby zobaczyć, czy bije, aby upewnić się, że biodrukowana łatka 3D jest funkcjonalna.
  5. Inkubuj biodrukowany plaster 3D w naczyniu 35 mm przez 3 dni lub dłużej (37°C, 5% dwutlenku węgla, 95% wilgotności).
    UWAGA: Po 3 dniach sferoidy łączą się ze sobą, a otwory w plastrze, w których znajdowały się igły, nie powinny być już widoczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na końcu kroku 4.4 (kohodowla), komórki w każdym dołku powinny zebrać się na dnie 96-dołkowych płytek dolnych U-dołka o bardzo niskim mocowaniu, aby pod wpływem grawitacji utworzyć sferoidy. Te sferoidy zawierają hiPSC-CM, HCF i HUVEC i mogą być wizualnie sprawdzane pod mikroskopem świetlnym, gdzie powinny wydawać się okrągłe przez dwuwymiarową projekcję (Rysunek 1). Pod koniec kroku 6.3 biodrukowana łatka serca 3D powinna zawierać puste przestrzenie tkankowe spowodowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ważne jest, aby do biodruku 3D używać bijących, funkcjonalnych sferoidów. Jeśli sferoidy nie biją, dalsze ich używanie niezmiennie spowoduje powstanie niefunkcjonalnej biodrukowanej łatki 3D.

Jedną z zalet tego podejścia jest możliwość manipulowania zawartością komórek w plastrze poprzez zmianę całkowitej liczby komórek i procentu kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów w sferoidach. Pozwala to na drukowanie wielu różnych rodzajów plastrów na serce, o różnych właściwościach histologi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy podają następujące źródła finansowania: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research oraz Maryland Stem Cell Research Fund (2016-MSCRFI-2735).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GeltrexInvitrogen 
Trypsyna/EDTA 0,05%Thermo Fisher15400054
zdefiniowany inhibitor trypsyny 0,0125%Thermo FisherR007100
RPMI Pożywka komórkowaInvitrogen11875-093RPMI uzupełniony witaminą B27 stanowi pożywkę hodowlaną HIPSC-CM
Suplement B-27Thermo Fisher17504044RPMI uzupełniony o B27 stanowi HIPSC-CM pożywka
hodowlana Countess Automatyczny licznik komórekInvitrogenC10227
Ludzkie fibroblasty serca (typ komorowy dla dorosłych)Sciencell6310
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowejLonzaCC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery U Akita Sumitomo Bakelit Co.MS-9096UZ
Regenova Bio Drukarka 3DCyfuse Biomedical KkNie dotyczywww.cyfusebio.com/en/
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fisher15250061
Przeciwciało Troponiny TThermo Fisher701620
Connexin 43 (Cx43) PrzeciwciałoChemiconMAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant z DAPIThermo FisherP36935
A1413202

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
  2. Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
  3. Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
  4. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
  5. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  6. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
  7. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
  8. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
  9. Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681(2015).
  10. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
  11. Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
  12. Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
  13. ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
  14. Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
  15. Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
  16. Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
  17. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002(2015).
  18. Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
  19. Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biodruk 3Dsferoidy kom rkoweultra niska adhezjamatryca igiemikroskopia konfokalnaspontaniczne skurczeregeneracja tkanekmodele chor b serca

Powiązane artykuły