Artykuł metodologiczny

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

DOI:

10.3791/55445

⸱

3 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, 2Microscopy and Cytometry Facility, The Huck Institutes of Life Sciences, Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość sprzyja przewlekłemu stanowi zapalnemu, w którym pośredniczą głównie makrofagi rezydujące w tkankach, jak również makrofagi pochodzące z monocytów. Otyłość indukowana dietą (DIO) jest cennym modelem w badaniu roli heterogeniczności makrofagów; Jednak odpowiednie izolacje makrofagów są trudne do uzyskania z tkanek objętych stanem zapalnym. W tym protokole przedstawiamy etapy izolacji i niezbędne wytyczne dotyczące rozwiązywania problemów wynikające z naszych badań w celu uzyskania odpowiedniej populacji makrofagów rezydujących w tkankach od myszy po 18 tygodniach interwencji na diecie wysokotłuszczowej (HFD) lub wysokotłuszczowej/wysokocholesterolowej (HFHCD). Protokół ten koncentruje się na trzech charakterystycznych tkankach badanych w otyłości i miażdżycy, w tym wątrobie, białej tkance tłuszczowej (WAT) i aorcie. Podkreślamy, w jaki sposób dualistyczne zastosowanie cytometrii przepływowej może osiągnąć nowy wymiar izolacji i charakterystyki makrofagów rezydujących w tkankach. Podstawowa sekcja tego protokołu dotyczy zawiłości leżących u podstaw trawienia enzymatycznego specyficznego dla tkanek i izolacji makrofagów, a następnie barwienia przeciwciał na powierzchni komórki do analizy cytometrii przepływowej. Protokół ten odnosi się do istniejących złożoności leżących u podstaw sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) i przedstawia wyjaśnienia dotyczące tych zawiłości, aby uzyskać szeroki zakres charakterystyki z odpowiednio posortowanych populacji komórek. Alternatywne metody wzbogacania są dostępne do sortowania komórek, takich jak gęsta wątroba, co pozwala na elastyczność i zarządzanie czasem podczas pracy z FACS. Krótko mówiąc, protokół ten pomaga badaczowi w ocenie niejednorodności makrofagów z wielu tkanek objętych stanem zapalnym w danym badaniu i dostarcza wnikliwych wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, które okazały się skuteczne w korzystnej izolacji komórkowej i charakterystyce komórek odpornościowych w zapaleniu za pośrednictwem DIO.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele myszy były szeroko wykorzystywane do badania dynamiki chorób ludzkich. Właściwa izolacja komórek rezydujących w tkance od myszy w stanie chorobowym może stanowić platformę do zrozumienia molekularnego i komórkowego wkładu w patogenezę choroby1. Jednym z zaburzeń, które ma kluczowe znaczenie, jest otyłość. Częstość występowania otyłości rośnie na całym świecie równolegle z insulinoopornością i cukrzycą typu 2, chorobami układu krążenia i stłuszczeniem wątroby2,3. Nadmierne spożycie składników odżywczych jest dodatkowo zniekształcone przez zmniejszoną aktywność fizyczną, która wyzwala zmienione sygnały emanujące z tkanki tłuszczowej, które mogą zmienić środowisko komórkowe innych tkanek obwodowych, takich jak aorta i wątroba4. Takie zaburzenie homeostazy metabolicznej skutkuje przewlekłym ogólnoustrojowym zapaleniem o niskim stopniu nasilenia5.

jove_content, jak również ich rekrutacja do białej tkanki tłuszczowej (WAT), nie tylko inicjuje rozregulowanie sygnałów metabolicznych, ale także podtrzymuje stan zapalny6,7. Heterogeniczność fenotypowa i funkcjonalna makrofagów jest silnie związana z patogenezą chorób współistniejących związanych z otyłością7. Dynamiczna plastyczność polaryzacji makrofagów pozwala tym komórkom wykazywać szereg aktywowanych fenotypów, które koordynują postęp i ustępowanie stanu zapalnego8. Podczas gdy klasycznie aktywowane makrofagi (M1) są zaangażowane w rozprzestrzenianie się stanu zapalnego, alternatywnie aktywowane makrofagi (M2) są związane z rozdzielczością i naprawą tkanek9,10.

Gdy organizm przechodzi stres metaboliczny, biała tkanka tłuszczowa nienormalnie się gromadzi. Rozszerzona tkanka tłuszczowa przyciąga i zatrzymuje komórki zapalne, które głęboko zmieniają normalną funkcję adipocytów, sprzyjając insulinooporności, hiperglikemii i ostatecznie cukrzycy typu 2, insulinooporności lub hiperglikemii11,12. Równolegle biała tkanka tłuszczowa przebudowuje się w odpowiedzi na sygnały zapalne uwalniane przez infiltrowane klasycznie aktywowane (M1) makrofagi tkanki tłuszczowej (ATM)13,14. Ten wielokomórkowy narząd emituje kaskadę sygnałów, które zakłócają normalne funkcjonowanie innych narządów ciała, takich jak aorta i wątroba4.

Wątroba to metaboliczna potęga, która dostosowuje się w odpowiedzi na bodźce pochodzące z pobliskich rozregulowanych WAT15. Makrofagi wątrobowe lub komórki Kupffera, w odpowiedzi na zmiany metaboliczne, wydzielają cytokiny zapalne, które przekształcają zarówno fenotyp komórek miąższowych, jak i niemiąższowych oraz sprzyjają przebudowie tkanek. Nagromadzenie lipidów w wątrobie, stan zapalny, nadmierne złogi macierzy zewnątrzkomórkowej, martwica i ostateczna utrata funkcji następują po urazach zapalnych, przyczyniając się do szerokiego spektrum uszkodzeń wątroby związanych z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby16,17,18.

Równolegle do upośledzenia funkcji WAT i wątroby, duże tętnice gromadzą lipidy w ścianie tętnicy, ponieważ organizm przechodzi przewlekły stres metaboliczny19. Akumulacja lipidów w tętnicach wyzwala wydzielanie chemokin przez aktywowane komórki śródbłonka, a następnie rekrutację monocytów20. Po rekrutacji monocyty namnażają się, różnicują, połykają lipoproteiny i stają się komórkami piankowatymi. Miażdżyca jest inicjowana i podtrzymywana przez prozapalną aktywność rekrutowanych i rezydujących w tkankach makrofagów obciążonych lipidami. Ulegając zewnątrzkomórkowym i wewnątrzkomórkowym sygnałom stresu przekazywanym w tym aterogennym mikrośrodowisku, makrofagi te angażują się następnie w apoptotyczną kaskadę sygnalizacyjną. Gdy te komórki piankowate obumierają, wnoszą swoją wypełnioną lipidami zawartość do martwiczego rdzenia zmiany, co następnie prowadzi do pęknięcia płytki nazębnej, zawału mięśnia sercowego i udaru.

Łącznie, niejednorodność fenotypów makrofagów częściowo koordynuje otyłość wywołaną zmianami zapalnymi obserwowanymi w rozregulowanych tkankach, takich jak WAT, wątroba i aorta8,21. Charakterystyka zrekrutowanych i rezydujących w tkankach makrofagów może dostarczyć informacji na temat potencjalnych celów molekularnych, które manipulują fenotypem makrofagów1. Aby skutecznie scharakteryzować makrofagi z tkanek zapalnych wywołanych otyłością, można uzyskać zawiesinę jednokomórkową poprzez trawienie enzymatyczne. Takie protokoły dysocjacji muszą być skuteczne w wystarczającej degradacji tkanki łącznej, jednocześnie minimalizując śmierć komórek immunologicznych i zapewniając optymalną wydajność komórek. Mieszanina enzymów zależy od rodzaju tkanki i jej budowy strukturalnej. Sprężyste tkanki, takie jak aorta, wymagają silniejszej aktywności enzymatycznej w porównaniu z wątrobą i WAT, aby osiągnąć dysocjację tkanek. Z zawiesiny pojedynczej komórki można jednoznacznie scharakteryzować lub wyizolować makrofagi rezydujące w tkankach w celu dalszych analiz, takich jak profilowanie transkrypcyjne.

Tutaj opisany jest protokół specyficzny dla tkanki, który wykorzystuje trawienie tkanek zależne od kolagenazy i polichromatyczną cytometrię przepływową, aby skutecznie izolować i charakteryzować rezydujące w tkankach makrofagi uzyskane z tradycyjnych modeli myszy indukowanych dietą, miażdżycy, prostego stłuszczenia i stłuszczeniowego zapalenia wątroby. Jednoczesne barwienie markerów powierzchniowych komórek przeciwciałami przeciwko antygenom specyficznym dla leukocytów (CD45 i/lub CD11b) i makrofagów (F4/80) jest często stosowane do identyfikacji populacji makrofagów22. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest potężną strategią stosowaną do sortowania tych zidentyfikowanych populacji o wysokiej czystości. Posortowaną populację można następnie ocenić pod kątem profili genów specyficznych dla fenotypu za pomocą dalszej analizy molekularnej (takiej jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym)23. Chociaż standardowa cytometria przepływowa i sortowanie komórek oparte na cytometrii przepływowej są potężnymi narzędziami do rozróżniania makrofagów w bardzo niejednorodnej zawiesinie komórek, te pierwsze protokoły muszą zostać zoptymalizowane, aby zapewnić pomyślne wyniki. W tym badaniu opisano protokoły, które skutecznie izolują i charakteryzują żywotne makrofagi specyficzne dla tkanki; Co ważniejsze, badanie to dostarcza kluczowych informacji na temat często pojawiających się problemów technicznych, a także proaktywnych i rozwiązywanych strategii zapobiegania im i/lub ich rozwiązywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne (Sekcje 1, 1.2 i 1.3) zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Pensylwanii.

tkankaPrzygotowanie dysocjacyjnychOstatni tom składowanie
Biała tkanka tłuszczowa (WAT)Bufor dysocjacyjny: 2,5% HEPES, 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 3 mg/ml (0,3%) Kolagenaza typu II w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z 4,5 g/l glukozy bez L-glutaminy i pirogronianu sodu 500 mlminus 80 °C (10 ml podwielokrotności)
Wątroba25x perfuzyjny koncentrat buforowy (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150 mM NaOH w destylowanym dejonizowanymH2O500 ml minus 20 °C (40 ml podwielokrotności)
Bufor konserwujący (PRB): 1% BSA w 1x buforze perfuzyjnym1 L4 °C
Bufor dysocjacyjny: 1x Bufor perfuzyjny uzupełniony 4,76 mM CaCl2 i 72 U / ml kolagenazy typu IV50 ml (na mysz)Przygotować bezpośrednio przed użyciem
aortaBufor dysocjacyjny: 125 U/ml kolagenazy typu XI, 60 U/ml hialuronidazy typu I, 60 U/ml DNazy I, 450 U/ml kolagenazy typu I, 20 mM HEPES w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)500 mlminus 80 °C (10 ml podwielokrotności)

Tabela 1: Receptury perfuzyjnych specyficznych dla tkanek.

1. Izolacja i dysocjacja tkanek

  1. WAT Izolacja i dysocjacja
    1. Przygotować specyficzne dla tkanek zgodnie z tabelą 1 i przechowywać je zgodnie z opisem.
    2. Przygotuj następujące odczynniki.
      1. Przygotować bufor do wytrawiania poprzez rozmrożenie odpowiedniej objętości buforu dysocjacyjnego WAT i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Bezpośrednio przed użyciem rozgrzać bufor do temperatury 37 °C. Przygotować bufor FACS, przygotowując 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    3. Izolacja WAT
      1. Poddaj mysz eutanazji w komorze wypełnionej dwutlenkiem węgla (CO2 ). Sprawdź skuteczność przed przejściem do etapu sekcji.
      2. Zanurz na krótko uśpioną mysz w zlewce zawierającej 70% etanolu, aż dokładnie nasiąknie i pokryje się etanolem. Umieść powierzchnię brzuszną myszy do góry na etapie preparacji i przymocuj przednie i tylne łapy myszy do deski preparacyjnej za pomocą igieł 21 G.
      3. Użyj kleszczyków ze średnią końcówką, aby chwycić skórę brzucha przed otworem cewki moczowej, a następnie użyj ostrych nożyczek preparujących, aby zrobić nacięcie w chwytanej skórze brzucha.
      4. Włóż dolne ostrze nożyczek do małego nacięcia między skórą a otrzewną i wykonaj boczne nacięcie od brzucha do klatki piersiowej
        5. .
      5. Delikatnie odciągnij skórę, aby odsłonić nienaruszoną jamę otrzewnej i wykonaj boczne nacięcie przez otrzewną i albo odchyl przezroczystą błonę, albo wytnij tkankę, aby odsłonić WAT.
      6. Zbierz okołookostne poduszeczki tłuszczowe zgodnie z opisem w Mann i wsp.24
        1. Okołogonadalne poduszeczki tłuszczowe u samców myszy są luźno związane z najądrzem i jądrami. Najpierw zlokalizuj jądra, a następnie za pomocą kleszczy o średnim punkcie chwyć głowę najądrza i delikatnie pociągnij.
        2. Za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych wytnij każdą poduszeczkę tłuszczową najądrza, przecinając wzdłuż powierzchni najądrza (głowa, ciało i ogon) oraz jądra.
        3. Za pomocą kleszczy delikatnie pociągnij za poduszeczkę tłuszczową, jednocześnie przecinając tkankę łączną bezpośrednio związaną ze strukturą najądrza.
        4. Za pomocą kleszczy mocno chwyć koniec poduszeczki tłuszczowej proksymalnie do najądrza i delikatnie oderwij poduszeczkę tłuszczową od gonad
        5. U samic myszy okołogonadalne poduszeczki tłuszczowe są luźno związane z trzonem macicy i rogiem macicy.
        6. Za pomocą kleszczy średniopunktowych chwyć tkankę tłuszczową okołogonadalną i delikatnie odciągnij tkankę od trzonu macicy i rogu macicy.
        7. Wytnij każdą poduszeczkę tłuszczową, przecinając wzdłuż trzonu macicy i rogu macicy za pomocą ostrych nożyczek preparujących.
      7. Umieść poduszeczki tłuszczowe na szalce Petriego wypełnionej PBS i trzymaj na lodzie, aby tkanka była wilgotna.
    4. Dysocjacja WAT na zawiesiny pojedynczych komórek
      1. Usuń nadmiar PBS z szalki Petriego i użyj żyletki z jedną krawędzią, aby zmielić WAT w jamie brzusznej na małe kawałki.
      2. Ostrą krawędzią żyletki delikatnie zeskrob zmielony WAT z jamy brzusznej do oznakowanej 15 ml polipropylenowej probówki zbiorczej zawierającej 2 ml buforu dysocjacyjnego WAT.
      3. Inkubować tę mieszaninę buforową do wytrawiania tkanek w powolnej, ciągłej rotacji w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
      4. Przefiltrować strawioną tkankę przez sitko o pojemności 70 μm do probówki zbiorczej o pojemności 50 ml, przesuwając gumowy tłok strzykawki ruchem okrężnym i kontynuować przesiewanie zawiesiny komórek przez filtr.
      5. Odmierzyć pipetę 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml, delikatnie pipetować w górę iw dół i umyć filtr zawiesiną jednokomórkową.
      6. Umyj filtr jeszcze dwa razy zimnym DMEM i umieść zawiesinę jednokomórkową na lodzie.
      7. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 8 min.
      8. Użyj aspiratora próżniowego, aby ostrożnie usunąć pływające adipocyty (pierwszy) i pozostały supernatant. Upewnij się, że nie naruszasz granulowanej frakcji naczyniowej zrębu (SVF).
      9. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl delikatnie ponownie zawiesić osad w buforze chlorkowo-potasowym amonu (ACK) w celu lizy erytrocytów zgodnie z instrukcjami producenta.
      10. Rozcieńczyć powyższą zawiesinę komórek DMEM i odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 300 g w temperaturze 4 °C przez 8 minut.
      11. Ponownie zawiesić komórki w zimnym PBS zawierającym 2% FBS (bufor FACS) i policzyć komórki w komorze Burkera/hemocytometrze.
      12. Przenieść 1 x 106 komórek (do podstawowej cytometrii przepływowej) lub całą zawiesinę komórek (do FACS) do znakowanych okrągłodennych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml. Przejdź do sekcji 2 dla protokołu barwienia cytometrii przepływowej.
  2. Izolacja i dysocjacja tkanek wątroby
    UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z Smedsrød25.
    1. Przygotować specyficzne dla tkanek zgodnie z tabelą 1 i przechowywać je zgodnie z opisem.
    2. Przygotuj następujące odczynniki.
      1. Przygotuj 1x bufor perfuzyjny (PB), rozcieńczając 40 ml PBC w 960 ml ultraczystegoH2O. Wstępnie ogrzej strzykawkę wypełnioną 50 ml PB w temperaturze 37 °C, tuż przed rozpoczęciem perfuzji. Wyeliminuj wszelkie obecne pęcherzyki powietrza.
        1. Aby wyeliminować pęcherzyki powietrza, odwróć strzykawkę w miejscu, w którym końcówka leur lock jest skierowana do góry. Postukać lub przesuwać strzykawkę, aż pęcherzyki powietrza znajdą się na górze strzykawki. Delikatnie nacisnąć tłok, aby usunąć powietrze
      2. Przygotować bufor wytrawiający przez rozcieńczenie 0,5 ml 476 mM roztworu CaCl2 do 49,5 ml 1x buforu perfuzyjnego. Dodaj 3600U kolagenazy typu IV do roztworu 4,76 mM CaCl2 – PB. Strzykawkę wypełnioną 50 ml buforu do wytrawiania należy ogrzać w temperaturze 37 °C tuż przed rozpoczęciem perfuzji. Wyeliminuj wszelkie obecne pęcherzyki powietrza, jak opisano w kroku 1.2.2.1.1.
      3. Przygotować bufor konserwujący (PRB) rozpuszczając 2,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 250 ml 1x bufor perfuzyjny. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub przechowywać na lodzie do czasu użycia.
      4. Przygotuj bufor FACS z 1x PBS i 2% FBS.
    3. Izolacja tkanki wątroby
      1. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2, nasyc mysz 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu narządów wewnątrzbrzusznych futrem.
      2. Umieść mysz brzuszną stroną do góry na desce preparacyjnej z pianki polistyrenowej i przymocuj przednią i tylną łapę myszy do deski preparacyjnej za pomocą igieł 21 G.
      3. Aby odsłonić ścianę klatki piersiowej i jamę otrzewnej, chwyć skórę brzucha w pobliżu ujścia cewki moczowej za pomocą kleszczy ze średnią końcówką punktową. Następnie użyj ostrych nożyczek preparujących, aby wykonać małe nacięcie na uchwyconej skórze brzucha.
      4. Włóż dolne ostrze nożyczek w małe nacięcie między skórą a otrzewną i wykonaj boczne nacięcie od pachwiny do podbródka.
      5. Delikatnie odciągnij skórę, aby odsłonić nienaruszoną jamę otrzewnej i ścianę klatki piersiowej, wykonaj boczne nacięcie przez otrzewną i wytnij błonę.
      6. Podnieś mostek i ostrożnie nacinaj przeponę, uważając, aby nie naruszyć żyły głównej dolnej (IVC). Przesuń narządy żołądkowo-jelitowe na bok i zlokalizuj IVC podwątrobowe. Użyj kleszczyków hemostatycznych, aby zacisnąć nadwątrobowy IVC, aby utrzymać miejscową perfuzję.
        Uwaga: Nadmierne nagromadzenie trzewnej białej tkanki tłuszczowej może często maskować IVC. Aby lepiej uwidocznić to naczynie, można wyciąć niewielki obszar tkanki tłuszczowej obok IVC. Nacięte okienko w giętkiej tkance tłuszczowej można następnie umieścić nad IVC, aby odsłonić naczynie do kaniulacji.
      7. Podłączyć strzykawkę wypełnioną wstępnie podgrzanym PB do zestawu do pobierania i infuzji krwi 23 G. Delikatnie nacisnąć tłok, aż rurka i igła zostaną wypełnione PB.
      8. Wprowadzić igłę 23 G, równolegle do poziomu podwątrobowego IVC. Zabezpiecz igłę na miejscu za pomocą 4 cm hemostatic clamp.
        UWAGA: Kaniulacja podwątrobowego IVC jest preferowana u myszy karmionych dietą, ponieważ IVC może być lepiej uwidoczniony i kaniulowany w jamie wypełnionej tłuszczem.
      9. Delikatnie naciśnij tłok, aby rozpocząć perfuzję, kolor szybko wypłynie z wątroby (najpierw prawy płat), jeśli igła zostanie odpowiednio umieszczona w naczyniu. Powiększenie płatów jest również widoczne, jeśli igła jest prawidłowo wprowadzona do podwątrobowego IVC.
      10. Natychmiast przeciąć żyłę wrotną, aby PB mógł swobodnie przepływać przez wątrobę.
      11. Wykonaj perfuzję wątroby, aż krew przestanie być widoczna. Od czasu do czasu delikatnie masuj płatki wątroby między palcem wskazującym a kciukiem, aby ułatwić perfuzję.
        UWAGA: Ważne jest, aby używać nieząbkowanych narzędzi o krawędziach do obsługi wątroby, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek.
      12. Gdy w strzykawce pozostanie 5 ml PB, należy zmienić strzykawkę na strzykawkę wypełnioną wstępnie podgrzanym buforem dysocjacyjnym. W tym czasie nie należy naruszać pozycji zabezpieczonej igły.
        Uwaga: Powiększone wątroby znacznie przekraczające 1,5 g powinny być perfundowane większą objętością wstępnie podgrzanego buforu trawiennego, aby zagwarantować pomyślną dysocjację wątroby.
      13. Perfaktoria aż do całkowitego strawienia. Delikatnie masuj płaty wątroby, aby ułatwić perfuzję.
        UWAGA: Oddzielenie torebki Glissona od miąższu można zaobserwować w pomyślnie strawionej wątrobie. Aby to ocenić, użyj krawędzi kleszczy, aby delikatnie nacisnąć lewy płat boczny. Na powierzchni powinien pojawić się odcisk, a wgłębienie powinno wypełniać się powoli po usunięciu kleszczyków.
      14. Wyjąć igłę z podwątrobowego IVC. Nie usuwaj kleszczy hemostatycznych zaciskających IVC nadwątrobowy.
      15. Wytnij całą wątrobę, ostrożnie przecinając łączące więzadła za pomocą krótkich, prostych ostrzy nożyczek preparujących i usuń woreczek żółciowy.
      16. Umieść całą wątrobę w 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 10 ml lodowatego buforu konserwującego i przechowuj w temperaturze 4 оC, aż będzie gotowa do uwolnienia komórek.
    4. Dysocjacja komórek wątroby
      1. Przenieś wątrobę do 10 cm naczynia zawierającego 10 ml lodowatego DMEM.
      2. Chwyć odcięty IVC nadwątrobowy przyczepiony do wyciętej wątroby za pomocą kleszczy zębatych. Użyj kleszczy o średnich punktach, aby uwolnić komórki z torebki Glissona, wykonując szybki ruch głaskania każdego płata.
      3. Przepuść nasycony DMEM przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm podłączone do probówki zbiorczej o pojemności 50 ml.
      4. Odpipetować 10 ml lodowatego DMEM na 10 cm szalkę Petriego i powtarzać czynności od 1.2.4.1 do 1.2.4.3 aż do momentu, gdy przestanie być obserwowane nasycenie podłoża. Umieścić zawiesinę komórkową na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
      5. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, odwracając probówkę zbiorczą, a następnie odwirować przy 54 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
      6. Zebrać supernatant w czystej probówce zbiorczej o pojemności 50 ml. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o sile 54 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
      7. Powtórz krok 1.2.4.6 jeszcze dwa razy przed przejściem do kroku 1.2.4.8.
      8. Przenieść supernatant do czystej probówki zbiorczej o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      9. Ponownie zawiesić niemiąższowe osady komórkowe w buforze FACS i policzyć je w komorze Burkera/hemocytometrze.
      10. Przenieś 1 x 106 komórek (do podstawowej cytometrii przepływowej) lub 15 x 106 - 20 x 106 komórek (do FACS) do znakowanych 5 ml okrągłodennych probówek z polistyrenu. Przejdź do sekcji 2 dla protokołu barwienia cytometrii przepływowej.
  3. Izolacja i dysocjacja aorty
    UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z Butcher et al. 26
    1. Przygotować specyficzne dla tkanek w oparciu o receptury podane w tabeli 1 i przechowywać je zgodnie z opisem.
    2. Przygotuj następujące odczynniki.
      1. Przygotować bufor do wytrawiania poprzez rozmrożenie odpowiedniej objętości buforu dysocjacyjnego WAT i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Bezpośrednio przed użyciem rozgrzać bufor do temperatury 37 °C.
      2. Przygotować 10x roztwór heparyny, rozpuszczając sól sodową heparyny w 1x PBS o stężeniu 200 U/ml. Rozcieńczyć 10x roztwór podstawowy heparyny z 1x PBS, aby przygotować 1x roztwór heparyny. Przechowywać 10x i 1x roztwory heparyny w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      3. Przygotuj bufor FACS z 1x PBS zawierającym 2% FBS.
    3. Rozwarstwienie aorty
      1. Poddaj mysz eutanazji w komorze wypełnionej dwutlenkiem węgla i spłucz 70% etanolem.
      2. Umieść mysz brzuszną stroną do góry na etapie sekcji, rozłóż przednie i tylne łapy myszy i przymocuj je do deski sekcyjnej za pomocą igieł 21 G.
      3. Natychmiast po eutanazji myszy należy wykonać nakłucie serca. W razie potrzeby patrz kroki od 1.3.3.4 do 1.3.3.9.
      4. Zlokalizuj wyrostek mieczykowaty na dolnym końcu mostka
      5. Aby to zrobić, umieść palec pośrodku wzdłuż szerokości szyi zwierzęcia. Śledź wzdłuż brzusznej linii środkowej od szyi do ogonowego końca mostka, aż poczujesz chrzęstne przedłużenie.
      6. Użyj kleszczy średnio punktowych, aby chwycić przedłużenie chrzęstne i, jeśli to konieczne, zaznacz położenie wyrostka mieczykowatego, usuwając plamę włosów lub skóry w tym obszarze.
      7. Częściowo wprowadzić igłę 26 G pod wyrostek mieczykowaty pod kątem 20-30°.
      8. Delikatnie przyłożyć podciśnienie do strzykawki, powoli wycofując tłok, a następnie wprowadzić igłę głębiej do jamy, aż zacznie płynąć krew.
      9. Jeśli przepływ krwi ustaje, powoli obracaj igłę lub lekko wsuwaj i wysuwaj.
      10. Użyj kleszczy, aby chwycić skórę brzucha przed otworem cewki moczowej i użyj ostrych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej przez otrzewną od pachwiny do podbródka.
      11. Odciągnij skórę, aby odsłonić narządy jamy brzusznej i klatkę piersiową palcami lub kleszczami, delikatnie przesuń narządy jamy brzusznej na bok.
      12. Użyj kleszczy, aby chwycić wyrostek mieczykowaty, unieś mostek i nacinaj przeponę.
      13. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przetnij boczne żebra po obu stronach. Chwytając mostek, odwróć klatkę piersiową do góry i przetnij podstawę łączącą. Usuń klatkę piersiową, odsłaniając leżące poniżej narządy klatki piersiowej.
      14. Ukrwić aortę za pomocą igły o rozmiarze 26 dołączonej do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej 1x roztworem heparyny, wstrzykując 1-2 ml roztworu do lewej komory (LV) serca.
        UWAGA: Pamiętaj, aby perfuzjować w wolnym tempie z niewielkim naciskiem, aby zapewnić nienaruszone miażdżycowe zmiany w aorcie.
      15. Wyciąć grasicę, płuca i tkankę łączną. W razie potrzeby zapoznaj się z krokami 1.3.3.16 i 1.3.3.17.
        1. Przed sercem zlokalizuj biały dwupłatowy (lub w kształcie motyla) narząd i mocno chwyć grasicę kleszczami. Pociągnij oba płaty do góry od wnęki i przetnij u podstawy nożyczkami.
        2. Aby usunąć płuca, uszczypnij płat płuca kleszczami, odciągnij tkankę od jamy klatki piersiowej i przetnij u podstawy. Powtórz dla każdego pozostałego płata.
      16. Użyj mikroskopu preparacyjnego i narzędzi do mikropreparacji, a następnie zbierz łuk aorty (w tym tętnicę nienazwaną, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową), aortę wstępującą, zstępującą, piersiową i brzuszną.
        1. Zlokalizuj aortę wstępującą w lewej komorze serca.
        2. Za pomocą pary zakrzywionych kleszczyków o wymiarach 0,07 x 0,04 mm delikatnie chwyć część aorty wstępującej wyłaniającą się z lewej komory.
          UWAGA: W porównaniu z otaczającą tkanką tłuszczową o żółtym zabarwieniu, aorta będzie jasnym białym naczyniem pochodzącym z lewej komory, gdy zostanie wystarczająco przepłukana roztworem heparyny.
          1. Jeśli aorta nie została prawidłowo przepłukana przez perfuzję serca, przepłucz ją ponownie, podczas gdy aorta pozostaje połączona z jamą. Aby to zrobić, przeciąć w pobliżu połączenia serce-aorta, usuń serce, a następnie przeciąć poziomo przez dolny koniec aorty brzusznej. Wprowadzić igłę 26 G do otworu aorty wstępującej i delikatnie przepłukać aortę roztworem heparyny 1x.
          2. Delikatnie pociągnij za aortę wstępującą, aby lepiej rozróżnić tkankę tłuszczową od osadzonej aorty.
          3. Wciąż delikatnie ciągnąc za aortę wstępującą, użyj końcówki zamkniętych sprężynowych nożyczek preparujących, aby usunąć tłuszcz, który otacza aortę wstępującą i łuk aorty. W tym celu należy pogładzić tkankę tłuszczową końcówką zamkniętych ostrzy nożyczek, aby oderwać tłuszcz łączący.
            UWAGA: Powstrzymaj się od wycinania tkanki tłuszczowej poprzez cięcie, aż aorta wstępująca i łuk będą wyraźnie widoczne. Ma to na celu zapobieżenie przecięciu aorty.
          4. Jeśli aorta wstępująca i łuk mogą być wyraźnie odgraniczone od otaczającej tkanki tłuszczowej, użyj sprężynowych nożyczek preparujących, aby wyciąć nadmiar tłuszczu.
          5. Delikatnie chwyć łuk aorty kleszczami. Ponownie za pomocą sprężynowej końcówki nożyczek pogłaszcz tłuszcz wzdłuż długości aorty zstępującej, piersiowej i brzusznej do ogonowego końca aorty brzusznej, zrób to po prawej stronie rękawa tłuszczu.
          6. Kontynuuj chwytanie wzdłuż aorty podczas odrywania tłuszczu. Pamiętaj, aby robić to delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniu aorty.
          7. Delikatnie pociągnij aortę w górę w kierunku mikroskopu, tak aby tłuszcz znalazł się teraz za aortą.
          8. Włóż zamknięte ostrza nożyczek między granicę tłuszcz-aorta w pobliżu przedniego końca aorty zstępującej, pogłębić przyczepienie tkanki tłuszczowej do powierzchni aorty, tępo wykonując ruch zamaszysty.
            UWAGA: Zaleca się dokładne usunięcie nadmiaru tłuszczu i tkanki łączącej, gdy aorta nadal znajduje się w jamie.
          9. Wytnij serce i przetnij ogonowy koniec aorty brzusznej poprzecznie. Usuń całą aortę.
          10. Umieść aortę w naczyniu o średnicy 35 mm i usuń nadmiar tłuszczu z aorty za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 21. Umieść wyciętą aortę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml na lodzie.
    4. Dysocjacja aorty na zawiesiny pojedynczych komórek
      1. Odmierzyć pipetą 0,2 ml buforu dysocjacyjnego aorty do probówki zawierającej aortę. Włóż sprężynowe ostrza nożyczek w kierunku stożkowego końca rurki i szybko zmiel aortę, aby ułatwić trawienie enzymatyczne.
      2. Przenieść mieszaninę tkanki i roztworu do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml i odpipetować 1,8 ml buforu dysocjacyjnego aorty do uzyskania całkowitej objętości 2 ml
        UWAGA: Aby ułatwić przenoszenie zawiesiny tkankowej, odetnij 1 cm od stożkowego końca standardowej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl. Za pomocą skróconej końcówki przenieś zawiesinę za pomocą mikropipety.
      3. Inkubować rozdrobnioną aortę w buforze dysocjacyjnym aorty przez 55 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 220 obr./min (0,514 x g).
      4. Przepuścić zawiesinę przez sitko komórkowe o średnicy 50 μm do probówki z polipropylenu o pojemności 15 ml. Użyj gumowego tłoka tłoka strzykawki, aby ułatwić filtrowanie.
      5. Przepłukać probówkę zbiorczą o pojemności 15 ml buforem FACS o pojemności 1 ml, zebrać zawiesinę i przepuścić przez sitko do komórek.
      6. Umyj sitko o pojemności 50 μm jeszcze dwa razy buforem FACS o pojemności 1 ml.
      7. Osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w zimnym buforze FACS. Policz komórki w komorze Burkera/hemocytometrze.
      8. Przenieść 1 x 106 (dla podstawowej cytometrii przepływowej) komórek lub całą zawiesinę komórek (dla FACS) do znakowanych okrągłodennych probówek z polistyrenu o pojemności 5 ml. Przejdź do sekcji 2 dla protokołu barwienia cytometrii przepływowej.

2. Cytometria przepływowa i barwienie FACS

TGL TGL TGL TGL TGL TGLI TGLI TGL
FluoroforR-fikoerytryna (PE)PE/Cyjanina (Cy) 7PE/cyjanina (Cy) 5Błękit pacyficzny (PB)
Laser (nm)Niebieski (488 nm) / Żółty (561-570 nm) - Zielony (532 nm)Niebieski (488 nm) / Żółty (561-570 nm) - Zielony (532 nm)Niebieski (488 nm) / Żółty (561-570 nm) - Zielony (532 nm)Fioletowy (405 nm)
WzbudzenieMAX (nm)Okręg wyborczy 496Okręg wyborczy 496Okręg wyborczy 496Rejon 401
Emisja MAX (nm)Okręg wyborczy 578785667Okręg wyborczy 455
Marker fenotypowyRozmiar F4/80Płyta CD11cPłyta CD11bPłyta CD45
EMR1, LY71integryna αX, integryna łańcucha αX, CR4, p150, ITGAXIntegryna αM, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAMT200, Ly-5, LCA
Docelowy typ komórkiMakrofagi rezydujące w tkankachKlasycznie aktywowane (M1) makrofagiMonocyty / makrofagiLeukocyty (makrofagi / monocyty, limfocyty i granulocyty)
Podzbiór komórek dendrytycznychKomórki dendrytyczne, komórki NK, aktywowane limfocyty T i podzbiór jelitowych limfocytów śródnabłonkowych (IEL) Granulocyty, komórki dendrytyczne, komórki NK oraz podzbiory limfocytów T i B
Współczynnik rozcieńczenia1:501:1001:1001:100
Kontrolki izotypuPE Szczur IgG2aPE/CY7 Chomik ormiański IgGPE/Cy5 Szczur IgG2bSzczur błękitny pacyficzny IgG2c

Tabela 2: Lista przeciwciał oznaczonych fluoroforem specyficznych dla rozróżniania makrofagów rezydujących w tkankach.

  1. Zbierz i przygotuj następujące elementy: FACS Buffer 5 ml okrągłodenne probówki polistyrenowe, przeciwciało blokujące receptor przeciw mysi CD16/32 Fc, przeciwciała pierwszorzędowe sprzężone lub niesprzężone z fluoroforem, przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (jeśli to konieczne), 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS).
    UWAGA: W przypadku barwienia dużych ilości komórek stężenie przeciwciał jest bardziej krytyczne niż liczba komórek. Na przykład, w przypadku barwienia 10 x 106 komórek, objętość buforu barwiącego i stężenie przeciwciał powinny być takie same, jak w przypadku barwienia 1,0 x 106 komórek w objętości buforu 100 μl. Do barwienia1,0 x 10 8 komórek zaleca się 5-krotne zwiększenie ilości przeciwciał.
  2. W razie potrzeby dodać dodatkowy lodowaty bufor FACS do każdej probówki FACS, granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 751 x g przez 5 minut (4 °C). Odessać supernatant po odwirowaniu.
  3. Dodać przeciwciało blokujące receptor Fc CD16/CD32 przeciwko mysim receptorom CD16/CD32 do wszystkich próbek zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
  4. Dodać koktajl przeciwciał pierwszorzędowych sprzężonych z fluoroforem bezpośrednio do zawiesiny komórek zawierającej przeciwciało blokujące receptor Fc i inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Chronić próbki przed światłem, aby zminimalizować bielenie przeciwciał sprzężonych z fluoroforem.
    1. W przypadku, gdy zastosowano niesprzężone przeciwciała pierwszorzędowe, należy postępować zgodnie z poniższymi krokami po zakończeniu kroku 2.4.
    2. Próbki barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami przemywać przez odwirowanie w temperaturze 751 x g przez 5 minut (4 °C).
    3. Usunąć sklarowany osad przez dekantację i ponownie zawiesić osad w 100 μl buforze FACS.
    4. Dodać sprzężone przeciwciało drugorzędowe do wszystkich niezbędnych próbek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przejść do kroku 2.5.
  5. Po inkubacji przeciwciał dodać 2 ml lodowatego buforu FACS, a następnie osadzać komórki w temperaturze 751 x g przez 5 minut (4 °C). Zdekantować supernatant i upewnić się, że nie zakłócasz osadu.
  6. Delikatnie wymieszać komórki, a następnie ponownie zawiesić z 200-400 μl buforu FACS, a następnie przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu standardowej analizy cytometrii przepływowej lub sortowania komórek.
  7. W celu krótkotrwałego utrwalenia wybarwionych komórek przejdź do kroków od 2.8 do 2.10. Fiksacji należy używać tylko do standardowej cytometrii przepływowej.
  8. Bezpośrednio po kroku 2.5 ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml 2-4% paraformaldehydu (PFA) na 15-30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Uwaga: PFA jest znanym środkiem drażniącym o działaniu rakotwórczym i toksycznym. Podczas korzystania z PFA należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością. Należy pamiętać o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej i wentylacji wyciągowej.
  9. Po utrwaleniu przemyć komórki, dodając 2 ml buforu FACS do wszystkich próbek i odwirować w temperaturze 751 x g w 4 °C przez 5 minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant.
  10. Ponownie zawiesić utrwalone komórki w 200 μl lodowatego buforu FACS i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przechowywać utrwalone komórki do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C, najlepiej przeprowadzić akwizycję cytometrii przepływowej w ciągu 48 godzin, aby zminimalizować autofluorescencję.
  11. Pozyskać dane cytometrii przepływowej zgodnie z instrukcjami producenta cytometru przepływowego lub przeprowadzić sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie, jak opisano przez Basu i wsp. 23

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas korzystania z myszy C57BL/6 (BL6) z niedoborem apolipoproteiny E (ApoE KO) utrzymywanych na diecie wysokotłuszczowej i wysokocholesterolowej (HCHFD lub HCD) przez 18 tygodni, 1 x 104 - 2 x 104 CD45+F4/80+ makrofagi aorty mogą być izolowane po połączeniu dwóch próbek. Wątroby wypreparowane od myszy ApoE KO karmionych HFHCD, wyprodukowały więcej niż 5 x 105 posortowanych komórek Kupffera (w zależności od dostępnego czasu sortowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą, które naśladują choroby współistniejące, takie jak miażdżyca, stłuszczenie proste, stłuszczeniowe zapalenie wątroby i cukrzyca typu 2, są szeroko stosowane w celu lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw postępu choroby. Trawienie zależne od kolagenazy jest często stosowane do dysocjacji tkanek w celu uwolnienia komórek z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)16,27. Enzymy, takie jak kolagenaza,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Głównemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej w Kompleksie Naukowym Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 26 G x 5/8 calaBD305115
Rurki 23 G x 0,75 cala x 12 cali Zestaw do pobierania krwiBD367297Służy do kaniulacji podwątrobowego IVC podczas perfuzji wątroby
21 G 1 1/2 cala. IgłyBD305156
Strzykawka 1 ml z gumowymi ogranicznikami
10 ml StrzykawkaBD309604
1 ml StrzykawkaBD309659
F4/80 PEBiolegend123110
CD11c PE/Cy7Biolegend117318
CD11b PE/Cy5eBioscience15-0112-81
Blok Anti-Mouse CD16/32 FC Biolegend101320
CD45 Pacific BlueBiolegend103126
PE Szczur IgG2aBiolegend400508
PE/Cy7 Chomik ormiański IgGBiolegend400922
PE/Cy5 Szczur IgG2bBiolegend400610
Szczur niebieski pacyficzny IgG2cBiolegend400717
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM) Cellgro15-017-CV
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Cellgro21-031-CV
70 μ m sitka komórkoweCorning, Inc.352350
Probówka do mikrowirówek 1,7 ml DenvilleC2170
Paraformaldehydowy roztwór wodny -16xMikroskopia elektronowa SciencesCAS #30525-89-4
Nożyczki do mikropreparacji, 3.5 cala, proste, 23 mm, ostre Stoelting52132-10PUżywany do ogólnych celów preparacyjnych
Mikrokleszcze, 4 cale, pełna krzywa, 0,8 mmStoelting52102-37P Używany do ogólnych celów preparacyjnych
Nożyczki do preparowania sprężyn – 3 mm Krawędź tnąca Fine Science Tool15000-10Służy do rozwarstwiania aorty Kroki od 1.3.3.17 do 1.3.3.28
Zakrzywiony 0,07 mm x 0,04  mm Kleszcze końcówkoweFine Science Tool11297-10Służy do rozwarstwiania aorty Kroki 1.3.3.17 do 1.3.3.28
Kleszcze hemostatyczne (zakrzywione)Fine Science Tool13021-12
Heparyna Sól sodowaFischer Scientific9041-08-1
35 mm Hodowla komórkowa/szalki PetriegoFischer Scientific12-565-90
Polistyrenowe szalki Petriego (10 cm) z pokrywkąFischer Scientific08-757-100D
15 ml stożkowe probówki wirówkowe (polipropylen)Fischer Scientific14-959-53A
50 ml stożkowe probówki wirówkowe ( Polipropylen)Fischer Scientific14-432-22
5 ml rurki z polistyrenu okrągłodennego Fischer Scientific14-959-5
Płodowa surowica bydlęcaGemini Bio-Products100-106
Etanol (alkohol etylowy denaturowany, dowolny wodny)MilliporeEX0285-1
Albumina surowicy bydlęcejRocklandBSA-50
HEPESSigma-AldrichH3375
Kolagenaza typu IISigma-AldrichC6885
Collagenasse Typ XISigma-AldrichC7657
Hialuronidaza typu ISigma-AldrichH3506
DNAseSigma-AldrichDN25
Kolagenaza typu ISigma-AldrichC0130
NaOHSigma Aldrich1310-73-2 
CaCl2Sigma Aldrich449709-10G
Zlewka 500 ml Sigma Aldrich02-540M
4 cm Zacisk hemostatycznyStoelting52120-40
Kleszcze zębateStoelting52104-33P
50 μ m Filtry jednorazoweSystemex04-0042-2317
Kolagenaza Typ IVThermoFischer Scientific17104019
Chlorek amonu Potas (ACK)ThermoFischer Scientific 
Maszynki do golenia (0,22 mm (0,009"))VWR International55411-050
Texas Red Żywa/martwa plamaCzerwona plama żywotności (w Rysunek 1A)
Strzykawka BD 309659 A1049201

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546(2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174(2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848(2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13(2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Macrophage IsolationTissue DigestionFlow CytometryFluorescent activated Cell SortingObesity related InflammationDiet induced ObesityLiver Cell DissociationCell Surface StainingFACS BufferPerfusion Buffer

Powiązane artykuły