Method Article

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

DOI:

10.3791/55448

⸱

May 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biochemistry, Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas Medical School at Houston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) to nowatorski, przyjazny dla użytkownika pakiet oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym do półautomatycznego przetwarzania danych z kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) dla pojedynczych cząstek. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać strukturę o rozdzielczości zbliżonej do atomowej, zaczynając od filmów z mikrofotografii cryo-EM, prowadząc użytkowników przez wszystkie etapy procesu określania struktury pojedynczej cząstki. Kroki te są kontrolowane z nowego graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE i wymagają minimalnej interwencji użytkownika. Korzystając z tego protokołu, strukturę 3,5 A TcdA1, kompleksu toksyny Tc z Photorhabdus luminescens, uzyskano z zaledwie 9500 pojedynczych cząstek. To uproszczone podejście pomoże początkującym użytkownikom bez dużego doświadczenia w przetwarzaniu i informacji strukturalnych a priori, w uzyskaniu wolnych od szumów i bezstronnych modeli atomowych ich oczyszczonych kompleksów makromolekularnych w ich stanie naturalnym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po rozwoju technologii bezpośredniego detektora elektronów, niezwykły postęp w krio-EM pojedynczych cząstek obecnie przekształca biologię strukturalną 1. W porównaniu z krystalografią rentgenowską, technika ta wymaga jedynie niewielkiej ilości materiału białkowego bez konieczności krystalizacji, a jednocześnie stwarza mniej ograniczeń dotyczących czystości próbki i nadal umożliwia oznaczanie struktur w rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Co ważne, różne składy lub stany mogą być teraz obliczeniowo oddzielone, a określanie struktury różnych konformacji może być przeprowadzane na niespotykanym dotąd poziomie szczegółowości. Ostatnio udało się stworzyć mapy gęstości trudnych cząsteczek w rozdzielczościach pozwalających na budowanie modeli de novo, a tym samym głębokie zrozumienie ich sposobu działania 2,3,4,5.

W społeczności 3DEM (3D Electron Microscopy) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) dostępna jest szeroka gama pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów, a większość z nich jest stale rozwijana. Rozdzielczość prawie atomowa została osiągnięta dla białek wykazujących różne masy cząsteczkowe i symetrie za pomocą kilku różnych pakietów oprogramowania, w tym EMAN2 6, IMAGIC7, FREALIGN 8, RELION 9, SPIDER 10 i SPARX 11. Każdy pakiet wymaga innego poziomu wiedzy użytkownika i zapewnia inny poziom wskazówek dla użytkownika, automatyzacji i rozszerzalności. Co więcej, podczas gdy niektóre programy zapewniają kompletne środowiska ułatwiające wszystkie etapy analizy obrazu, inne są zaprojektowane w celu optymalizacji określonych zadań, takich jak udoskonalanie parametrów wyrównania, zaczynając od znanej struktury referencyjnej. Ostatnio opracowano kilka platform, w tym APPION 12 i SCIPION 13, które zapewniają pojedynczy potok przetwarzania, który integruje podejścia i protokoły z różnych pakietów oprogramowania wymienionych powyżej.

Aby przyczynić się do obecnego rozwoju cryo-EM, SPARX został ponownie opracowany jako nowa, samodzielna i kompletna platforma do analizy pojedynczych cząstek, zwana SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy). W celu zwiększenia dostępności tej techniki dla początkujących badaczy w tej dziedzinie i poradzenia sobie z dużą ilością danych generowanych przez nowoczesne, w pełni zautomatyzowane, wysokiej klasy mikroskopy elektronowe, proces przetwarzania został przeprojektowany i uproszczony poprzez wprowadzenie łatwego w użyciu graficznego interfejsu użytkownika (GUI) i automatyzację głównych etapów przepływu pracy. Co więcej, dodano nowe algorytmy, które umożliwiają szybkie, powtarzalne i zautomatyzowane określanie struktury na podstawie obrazów kriogenicznych. Ponadto wprowadzono walidację na podstawie odtwarzalności, aby uniknąć typowych artefaktów powstających podczas udoskonalania i analizy heterogeniczności.

Chociaż program został gruntownie zmodyfikowany, jego cenione podstawowe cechy zostały zachowane: prosty kod open-source, nowoczesny projekt zorientowany obiektowo i interfejsy Pythona dla wszystkich podstawowych funkcji. Dzięki temu nie został zamieniony w program typu skrzynka, umożliwiający użytkownikom studiowanie i łatwe modyfikowanie kodu Pythona, tworzenie dodatkowych aplikacji lub modyfikowanie ogólnego przepływu pracy. Jest to szczególnie przydatne w przypadku niestandardowych projektów krio-EM.

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania mapy gęstości o niemal atomowej rozdzielczości z obrazów krio-EM za pomocą graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE. Opisuje szczegółowo wszystkie kroki wymagane do wygenerowania mapy gęstości z surowych filmów z bezpośredniego detektora cryo-EM i nie jest ograniczony do żadnego konkretnego typu makrocząsteczki. Protokół ten ma na celu przede wszystkim przeprowadzenie nowicjuszy w tej dziedzinie przez przepływ pracy i dostarczenie ważnych informacji na temat kluczowych etapów przetwarzania, a także niektórych możliwych pułapek i przeszkód. Bardziej zaawansowane funkcje i podstawy teoretyczne SPHIRE zostaną opisane w innym miejscu.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Aby postępować zgodnie z tym protokołem, konieczne jest poprawne zainstalowanie SPHIRE w systemie z instalacją MPI (obecnie jest to klaster Linux). Pobierz SPHIRE i zestaw danych TcdA1 z http://www.sphire.mpg.de i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. Ta procedura instaluje również EMAN2. SPHIRE obecnie używa e2boxera EMAN2 do selekcji cząstek i e2display do wyświetlania plików graficznych. Do korekcji ruchu w surowych filmach z mikrofotografii w zależności od dawki, SPHIRE używa unblur 14. Pobierz program i postępuj zgodnie z instrukcją instalacji (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff lab). Do interaktywnej wizualizacji powstałych struktur protokół użyje programu do grafiki molekularnej Chimera 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). Fajny samouczek umożliwiający zapoznanie się z funkcjami używanymi w tym protokole można znaleźć tutaj: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. Instrukcje dotyczące przesyłania zadania równoległego do klastra z graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE można znaleźć tutaj: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. Ogólna organizacja graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE i główne etapy przepływu pracy wykonywane w tym protokole są zilustrowane na rysunku 1.

1. PROJEKT: Ustaw stałe wartości parametrów dla tego projektu

  1. Uruchom aplikację SPHIRE GUI, wpisując "sphire &" i ENTER w oknie terminala.
  2. Dostosuj parametry całego projektu (np. rozmiar piksela, promień cząstek i symetrię) w odpowiednich polach wejściowych na stronie ustawień projektu, a następnie zarejestruj te wartości dla wszystkich kolejnych etapów przepływu pracy.
    1. Kliknij ikonę "PROJEKT" w prawym dolnym rogu lewego panelu, aby otworzyć stronę ustawień projektu.
    2. Zmierz najdłuższą oś cząstki za pomocą interaktywnego narzędzia do wyświetlania obrazu e2display.py, a następnie wprowadź połowę rozmiaru cząstki w polu "Promień cząstki białka". Jeśli pomiar jest w A, pamiętaj, aby przeliczyć jednostkę na piksele przy użyciu rozmiaru piksela (np. jeśli cząstka ma długość 200 A, a rozmiar piksela wynosi 1,2 A/piksel, to najdłuższa oś cząstki wynosi 200/1,2 = ~166 pikseli, a promień 166/2 = 83 piksele).
    3. Ustaw "Rozmiar pudełka na cząstki" na co najmniej 1,5 raza wielkości cząstek. Unikaj rozmiarów okien zawierających dużą liczbę pierwszą. Pamiętaj też, że algorytm udoskonalania 3D wymaga obecnie parzystego rozmiaru pola.
      UWAGA: Okno powinno zawierać margines uwzględniający początkowe błędy centrowania wynikające z wybierania (konieczność przesunięcia cząstek w obrębie okna) oraz obszar tła wystarczający poza granicą cząstek do prawidłowej korekcji CTF (szczególnie ważne dla dużych wartości rozmycia16).
    4. Ustaw "Rozmiar okna CTF" na "Rozmiar pudełka na cząstki". W przypadku projektów z danymi o niskim kontraście należy użyć większego okna, aby uzyskać płynniejsze oszacowania widm mocy.
    5. Ustaw "Symetria grupy punktów" kompleksu (np. "C5"). Jeśli symetria struktury docelowej nie jest znana, pozostaw ją na poziomie "C1" (asymetryczna). Jeśli jednak w dalszej części przetwarzania zostanie zidentyfikowana określona symetria wysokiego rzędu, należy odpowiednio zmienić to ustawienie symetrii i powtórzyć kroki po wyrównaniu 2D za pomocą ISAC.
    6. Ustaw "Masę cząsteczkową białka" w kDa (wystarczy wartość przybliżona). Naciśnij przycisk "Zarejestruj ustawienia".

2. FILM: Wyrównaj klatki każdego mikrografu filmu, aby skorygować ogólny ruch próbki

  1. Dla wszystkich mikrofotografii filmowych oblicz przesunięcia x/y dla wszystkich klatek, a następnie utwórz ich średnią bez dawki i z korektą ruchu (patrz Dyskusja). Należy zauważyć, że pierwsza z nich jest konieczna tylko do oszacowania CTF, ponieważ oszacowanie nie działa dobrze w przypadku średnich ważonych dawką, podczas gdy drugie jest używane do wszystkich innych etapów określania struktury.
    1. Kliknij ikonę "MOVIE", a następnie przycisk "Micrograph Movie Alignment". Ustaw "Rozmyj ścieżkę wykonywalną", wybierając plik wykonywalny. Ustaw "Wprowadź wzorzec ścieżki mikrografu", wybierając surowy, niewyrównany mikrograf filmowy i zastępując zmienną część nazw plików symbolem wieloznacznym "*" (np. TcdA1_*.mrc). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Summovie ścieżkę pliku wykonywalnego", wybierając plik wykonywalny.
    3. Ustaw "Liczba klatek filmu" na liczbę klatek w każdym mikrofotografii filmu. Ustaw "Napięcie mikroskopu" i "Ekspozycja na klatkę" na wartości używane podczas zbierania danych. (Na przykład, jeśli całkowita dawka wynosi 60 e-/A2 przy 20 klatkach nagranych bez wstępnej ekspozycji, ekspozycja dla każdej klatki wynosi 60/20 = 3 e-/A2.) Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wyrównać klatki każdego mikrografu filmu.
      UWAGA: Spowoduje to automatyczne utworzenie dwóch katalogów wyjściowych zawierających odpowiednio mikrofotografie średnie z korekcją ruchu bez dawki i z korektą ruchu.

3. CTER: Oszacuj parametry rozmycia i astygmatyzmu CTF

  1. Oszacuj parametry CTF (rozmycie i astygmatyzm; pozostałe są ustawiane przez użytkownika) dla każdej mikrofotografii średniej nieważonej dawką.
    1. Kliknij ikonę "CTER", a następnie przycisk "Oszacowanie CTF". Aby ustawić "Wzorzec ścieżki mikrografu wejściowego", wybierz mikrofotografię z korekcją ruchu bez ważenia dawki, a następnie zastąp zmienną część nazw plików symbolem wieloznacznym "*". Określ również ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Kontrast amplitudy" na wartość rutynowo używaną dla rodzaju danych (grubość lodu jest głównym czynnikiem) i napięcia mikroskopu w laboratorium (np. 10%). Typowe wartości mieszczą się w zakresie od 7 do 14%17.
    3. Ustaw "Aberracja sferyczna mikroskopu (Cs)" i "Napięcie mikroskopu" używane podczas zbierania danych.
    4. Ustaw "Najniższą częstotliwość" i "Najwyższą częstotliwość" zakresu wyszukiwania dla modelu CTF pasując odpowiednio do 0,0285 i 0,285 A-1 (40 - 4 A). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby oszacować parametry CTF.
      UWAGA: Parametry CTF zostaną automatycznie zapisane w pliku partres.txt w określonym katalogu wyjściowym. Estymacja CTF dla 112 mikrofotografii została obliczona na 96 rdzeniach i zakończona po ~3 minutach na klastrze Linux użytym do uzyskania reprezentatywnych wyników.

4. OKNO: Wyodrębnij cząstki z mikrofotografii średniej ważonej dawką

  1. Wybieraj cząstki ręcznie lub automatycznie z mikrofotografii za pomocą e2boxer6 i twórz pliki współrzędnych, z których każdy zawiera listę współrzędnych xy cząstek w powiązanym mikrografie.
    1. Kliknij ikonę "OKNO", a następnie przycisk "Wybieranie cząstek". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby uruchomić e2boxer 6i wybierz cząstki z każdej mikrofotografii ręcznie lub automatycznie18 (zobacz Dyskusja). Zapisz końcowe współrzędne cząstek dla każdego mikrografu w formacie pliku EMAN1 (.box). Alternatywnie można zaimportować pliki współrzędnych z innych programów po przekonwertowaniu ich do formatu EMAN1.
  2. Twórz stosy cząstek, wyodrębniając obrazy cząstek z mikrofotografii ważonych dawką (w SPHIRE stos cząstek jest często nazywany po prostu "stosem").
    1. Naciśnij przycisk "Ekstrakcja cząstek". Określ "Wzorzec ścieżki mikrografu wejściowego", wybierając mikrografię z korekcją ruchu ważoną dawką, a następnie zastępując zmienną część nazw plików symbolem wieloznacznym "*" (np. TcdA1_*.mrc). Podobnie ustaw "Wprowadź wzorzec ścieżki współrzędnych", wybierając plik współrzędnych (np. TcdA1_*.box). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Źródło parametrów CTF", wybierając plik parametrów CTF (partres.txt utworzony w kroku 3.1). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
  3. Połącz wyodrębnione stosy obrazów cząstek w jeden.
    1. Kliknij przycisk "Stos cząstek". Określ ścieżkę do "Wyjściowego stosu obrazów wirtualnych" przy użyciu formatu ścieżki pliku BDB (np. "bdb:Particles/stack", gdzie "Particles" wskazuje na katalog zawierający katalog bazy danych BDB, którego nazwa jest zawsze EMAN2DB, a "stack" odnosi się do określonego stosu obrazów w tej bazie danych). Określ "Wejściowy wzorzec stosu obrazów BDB", wybierając katalog zaczynający się od "mpi_proc", a następnie zastępując zmienną część nazw katalogów symbolem wieloznacznym "*" (np. Cząstki/mpi_proc_000 na Cząstki/mpi_proc_*). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".

5. ISAC: Klasyfikacja obrazów cząstek w 2D

  1. Obliczanie średnich klas 2D poprzez wyrównywanie cząstek i grupowanie ich zgodnie z ich wyglądem 2D.
    UWAGA: Wynikowe średnie 2D mają lepszy stosunek sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z obrazami pojedynczych cząstek, a zatem są wykorzystywane do wizualnej oceny jakości i niejednorodności zestawu danych, a także do sortowania niepożądanych obrazów ze stosu (np. kryształki lodu, krawędzie węgla, agregaty, fragmenty itp.)19. Co więcej, zostaną one następnie wykorzystane do określenia wstępnego modelu 3D.
    1. Kliknij ikonę "ISAC", a następnie przycisk "ISAC - Klastrowanie 2D". Ustaw "Stos obrazu wejściowego", wybierając plik stosu zawierający wyodrębnione cząstki. Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Użyj 200 - 1000 dla "Obrazów na klasę". Wybierz odpowiednią liczbę, biorąc pod uwagę oczekiwaną liczbę klas 2D (całkowita liczba cząstek podzielona przez liczbę obrazów na klasę). Dostosuj ten parametr w zależności od SNR i rozmiaru zestawu danych. Zwiększ liczbę elementów członkowskich na klasę w przypadku, gdy zestaw danych jest nadmiernie hałaśliwy. Zmniejsz tę liczbę, gdy dostępna jest mała liczba cząstek.
      UWAGA: Ze względu na ograniczenia pamięci, w przypadku dość dużych zbiorów danych (>100 000 cząstek), podziel cały zestaw danych na podzbiory, wykonaj ISAC dla każdego podzbioru niezależnie i połącz wyniki na końcu. Szczegółowe instrukcje dotyczące tego scenariusza przetwarzania znajdują się w http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php.
    3. Zaznacz pole wyboru "Odwrócenie fazy". Zachowaj domyślne wartości dla "Docelowego promienia cząstek" i "Docelowego rozmiaru obrazu cząstek", aby przyspieszyć proces poprzez automatyczne zmniejszanie wszystkich obrazów cząstek przy tych ustawieniach. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby obliczyć średnie klasy 2D.
      UWAGA: Ten krok jest wymagający obliczeniowo, a czas działania znacznie się wydłuża wraz z liczbą cząstek i klas, a także promieniem celu i rozmiarem obrazu. Na klastrze z 96 procesami klasyfikacja 2D ~10 000 cząstek zakończyła się po około 90 minutach.
  2. Wyświetl i wizualnie sprawdź wynikowe średnie ISAC 2D, aby upewnić się, że ich jakość jest zadowalająca (patrz Dyskusja).
    1. Naciśnij przycisk "Wyświetl dane" w sekcji "NARZĘDZIA". Ustaw "Pliki wejściowe", wybierając plik zawierający średnie ISAC 2D (class_averages.hdf utworzone w kroku 5.1). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wyświetlić końcowe, powtarzalne i zatwierdzone średnie klas dostarczone przez ISAC.
  3. Utwórz nowy stos zawierający tylko cząstki składowe zweryfikowanych średnich klas.
    1. Naciśnij przycisk "Utwórz podzbiór stosu". Ustaw "Stos obrazu wejściowego", wybierając ten sam plik stosu, co w kroku 5.1.1. Ustaw "Średnie ISAC", wybierając średnie ISAC 2D (class_averages.hdf utworzone w kroku 5.1). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".

6. VIPER: Oblicz początkowy model 3D

  1. Wybierz mały zestaw średnich klas (≥100 obrazów), usuwając wszystkie złe średnie klasowe i identyczne widoki cząstki (patrz Dyskusja) i użyj ich do obliczenia powtarzalnego modelu początkowego za pomocą VIPER. Pamiętaj, że wybór powinien zawierać co najmniej 60-80 wysokiej jakości średnich, z których każdy ma ~200-500 członków.
    1. Kliknij ikonę "VIPER", a następnie przycisk "Wyświetl dane". Ustaw "Pliki wejściowe", wybierając średnie ISAC 2D (class_averages.hdf utworzone w kroku 5.1). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
    2. Naciśnij środkowy przycisk myszy gdzieś w oknie graficznym wyświetlacza e2display i aktywuj przycisk "DEL " w wyskakującym okienku. Usuń wszystkie złe średnie klasowe i identyczne widoki cząstki (patrz Dyskusja). Naciśnij przycisk "Zapisz", aby zapisać pozostałe średnie klas 2D do nowego pliku.
  2. Na podstawie wybranych średnich ISAC wygeneruj początkowe odniesienie do kolejnego zagęszczenia 3D.
    1. Kliknij przycisk "Wstępny model 3D - RVIPER". Ustaw "Stos obrazów wejściowych", wybierając prześwietlone średnie klas (utworzone w kroku 6.1). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Upewnij się, że używasz tej samej wartości dla "Docelowego promienia cząstek", co w kroku 5.1.3 ISAC. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wygenerować powtarzalny model 3D ab initio.
      UWAGA: Ten krok jest wymagający obliczeniowo, a czas pracy znacznie się wydłuża wraz z liczbą średnich i rozmiarem cząstek. W klastrze z 96 procesami to zadanie (~100 średnich klas) zakończyło się po ~15 minutach.
  3. Sprawdź, czy wynikowy model 3D jest rozsądny, biorąc pod uwagę średnie klas, a także jego integralność strukturalną (tj. brak rozłączonych części i/lub artefaktów kierunkowych). Aby wyświetlić mapę, użyj programu Chimera15. W tym momencie należy przeprowadzić pierwsze porównanie ze strukturą krystaliczną białka homologicznego lub domeną białka będącego przedmiotem zainteresowania, jeśli taka istnieje (przykład pokazano w sekcji Reprezentatywne wyniki).
  4. Aby następnie udoskonalić obraz 3D, wygeneruj początkowe odniesienie 3D i maskę 3D na podstawie modelu 3D ab initio, usuwając otaczający go szum i ponownie skalując go w celu dopasowania do oryginalnego rozmiaru piksela.
    1. Kliknij przycisk "Utwórz odniesienie 3D". Ustaw "Głośność wejściową", wybierając model 3D ab initio (average_volume.hdf utworzony w kroku 6.2). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw opcję "Źródło współczynnika ponownego próbkowania", wybierając plik współczynnika skurczu ISAC (README_shrink_ratio.txt utworzony w kroku 5.1). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".

7. MERIDIEN: Udoskonal początkową objętość 3D

  1. Uściślij objętość 3D, zaczynając od początkowego modelu 3D.
    1. Kliknij ikonę "MERIDIEN", a następnie przycisk "Udoskonalenie 3D". Ustaw "Stos obrazów wejściowych" i "Początkowe odniesienie 3D", wybierając stos cząstek i model 3D ab initio (utworzony odpowiednio w kroku 5.3 i 6.4). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Maskę 3D", wybierając plik maski 3D (utworzony w kroku 6.4). Zawsze używaj maski 3D, ale szczególnie na wczesnym etapie analizy używaj maski sferycznej lub maski o miękkich krawędziach luźno dopasowanej do odniesienia, aby uniknąć wprowadzenia stronniczości lub nieprawidłowego maskowania.
    3. Zaznacz pole wyboru "Zastosuj twardą maskę 2D". Ustaw "Rozdzielczość początkową" na wartość częstotliwości odcięcia w zakresie 20 - 25 A. Należy pamiętać, że filtr dolnoprzepustowy z tą częstotliwością odcięcia zostanie zastosowany do początkowej struktury 3D w celu zmniejszenia początkowego odchylenia modelu.
    4. Sprawdź specyfikację klastra używanego w tym procesie, a następnie ustaw "Pamięć na węzeł" na dostępną pamięć w gigabajtach. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby udoskonalić objętość 3D, zaczynając od początkowego modelu 3D w sposób w pełni zautomatyzowany.
      UWAGA: Ta procedura podzieli zestaw danych na dwie połowy, udoskonali oba modele niezależnie i wygeneruje dwie surowe objętości, z których każda będzie zawierać tylko połowę cząstek. Jest wymagający obliczeniowo, a czas pracy znacznie się wydłuża wraz z liczbą cząstek. Na tej gromadzie udoskonalanie meridianu zakończyło się po ~2,5 h przebiegu na 192 procesach (~8 000 cząstek, 352 wielkości pudełka).
  2. Utwórz maskę 3D o miękkich krawędziach z wyrafinowanej objętości do kolejnego kroku wyostrzania.
    1. Kliknij przycisk "Adaptacyjna maska 3D". Ustaw "Głośność wejściową", wybierając jedną z niefiltrowanych połówek głośności (utworzonych w kroku 7.1). Określ ścieżkę dla "Maski wyjściowej".
    2. Ustaw wartość "Próg binaryzacji". Użyj Chimery, aby upewnić się, że przy tym konkretnym progu szum wyraźnie wykracza poza objętość zainteresowania w obszarze rozpuszczalnika niefiltrowanych map połówkowych, a wszystkie gęstości białka są nadal ze sobą połączone. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby utworzyć maskę 3D z miękkimi krawędziami.
      UWAGA: Główna część wynikowej maski (składająca się z wokseli, których wartości wynoszą >0,5) powinna ściśle przylegać do struktury cząstek, ale nadal zawierać wszystkie interesujące nas gęstości. Spadek miękkiej krawędzi powinien mieć szerokość co najmniej 8-10 pikseli.
  3. Scal dwie niefiltrowane połówki objętości uzyskane przez udoskonalenie 3D. Następnie wyostrz scaloną głośność, dostosowując widmo mocy w oparciu o funkcję przenoszenia modulacji (MTF) detektora, szacowany współczynnik B i oszacowanie rozdzielczości FSC (korelacja powłoki Fouriera).
    1. Wybierz przycisk "Wyostrzanie". Ustaw "Pierwsza niefiltrowana połówka woluminu" i "Druga niefiltrowana połówka woluminu", wybierając odpowiednie pliki (vol_0_unfil.hdf i vol_1_unfil.hdf utworzone w kroku 7.1). Zawsze używaj opcji "B-factor enhancement". Zazwyczaj należy zachować wartość domyślną, aby oszacować wartość współczynnika B z wejściowego zestawu danych przy użyciu zakresu między częstotliwością rozdzielczości końcowej a 10 A. Alternatywnie określ wartość ad hoc (np. -100).
    2. Zachowaj wartość domyślną dla "Częstotliwość filtra dolnoprzepustowego", aby zastosować filtr oparty na FSC.
    3. Ustaw "Maskę dostarczoną przez użytkownika", wybierając maskę 3D (utworzoną w kroku 7.2). Pamiętaj, że zgłoszona rozdzielczość zostanie określona za pomocą FSC z tą maską. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wyostrzyć udoskonaloną objętość 3D.
  4. Wygeneruj mapę rozkładu kątowego 3D na podstawie kierunków rzutowania wszystkich cząstek oszacowanych przez powyższy krok udoskonalania 3D.
    1. Kliknij przycisk "Rozkład kątowy". Ustaw "Plik parametrów wyrównania", wybierając plik (final_params.txt utworzony w kroku 7.1) i naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
  5. Sprawdź wzrokowo wyostrzony model 3D za pomocą Chimery. Upewnij się, że struktura wydaje się rozsądna, biorąc pod uwagę osiągniętą rozdzielczość (patrz Dyskusja).
  6. Sprawdź wzrokowo rozkład kątowy za pomocą Chimery. Sprawdź, czy rozkład obejmuje w przybliżeniu równomiernie całą przestrzeń kątową 3D. Należy pamiętać, że w przypadku struktur symetrycznych rozkład jest ograniczony w obrębie unikalnego trójkąta asymetrycznego.

8. SORT3D: Sortuj niejednorodność 3D, skupiając się na bardzo zmiennych regionach

  1. Oblicz mapę zmienności 3D na podstawie stosu cząstek użytego w uściśleniu 3D.
    1. Kliknij ikonę "SORT3D", a następnie przycisk "Szacowanie zmienności 3D". Ustaw "Stos obrazu wejściowego", wybierając ten sam stos cząstek ekranowanych, który został podany w kroku udoskonalania 3D 7.1.1. Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Zachowaj wartość domyślną dla "Liczba projekcji".
      UWAGA: Obrazy z otoczenia kątowego zostaną użyte do oszacowania wariancji 2D przy każdym kącie projekcji 3D. Im większa liczba, tym mniej hałaśliwe oszacowanie, ale tym niższa rozdzielczość, a artefakty obrotowe są bardziej wyraźne.
    3. Zaznacz pole wyboru "Użyj CTF". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
  2. Użyj mapy zmienności 3D, aby utworzyć maskę ostrości dla poniższego kroku klastrowania 3D.
    1. Wybierz przycisk "Binarna maska 3D". Ustaw "Głośność wejściową", wybierając mapę zmienności 3D (utworzoną w kroku 8.1). Określ ścieżkę do pliku dla opcji "Maska wyjściowa".
    2. Ustaw "Próg binaryzacji", korzystając z danych wyjściowych pola "Poziom" w "Przeglądarce głośności" Chimery. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
  3. Sortuj obrazy cząstek w jednorodne grupy strukturalne, skupiając się na strukturalnie bardzo zmiennych obszarach.
    1. Naciśnij przycisk "Klastrowanie 3D - RSORT3D". Ustaw "Wejściowy katalog zagęszczenia 3D", wybierając katalog wyjściowy zagęszczenia 3D (utworzony w kroku 7.1). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Maskę 3D", wybierając maskę 3D o miękkich krawędziach (utworzoną w kroku 7.2). Ustaw "Maskę ostrości 3D", wybierając binaryzowaną mapę zmienności 3D (utworzoną w kroku 8.2).
    3. W przypadku dużych zestawów danych użyj co najmniej 5 000–10 000 dla "obrazów na grupę". Należy pamiętać, że program zawsze utrzymuje liczbę obrazów w grupie na poziomie niższym niż to ustawienie. Dostosuj wartość, biorąc pod uwagę oczekiwaną liczbę grup 3D (całkowita liczba cząstek podzielona przez wartość "Obrazy na grupę"), zestaw danych, SNR i stopień niejednorodności. Zacznij od ~5-10 początkowych grup 3D, jeśli dostępna jest wystarczająca liczba cząstek, chyba że spodziewana jest większa liczba odrębnych stanów strukturalnych w zbiorze danych.
    4. Użyj co najmniej 3 000-5 000 cząstek dla "Najmniejszej wielkości grupy". Zauważ, że program zignoruje grupy składające się z mniejszej liczby obrazów niż ustawienie "Najmniejszy rozmiar grupy". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wykonać klastrowanie 3D.
      UWAGA: RSORT3D jest podzielony na dwa etapy. Pierwszy krok "sort3d" porządkuje niejednorodność 3D. Następnie rekonstruuje objętości każdej jednorodnej grupy strukturalnej przy użyciu parametrów wyrównania 3D określonych przez powyższy krok udoskonalania 3D. Drugi krok "rsort3d" wyszukuje powtarzalne elementy każdej grupy, przeprowadzając dwukierunkowe porównanie dwóch niezależnych przebiegów sortowania. Następnie rekonstruuje jednorodne struktury, używając tylko tych cząstek, które są odtwarzalnie przypisane. Na klastrze z 96 rdzeniami ta praca (~8 000 cząstek, rozmiar pudełka 352) zakończyła się po około 3 godzinach.
  4. Po zakończeniu programu użyj Chimery, aby wybrać jednorodną grupę 3D. Wybierz strukturę o najwyższej rozdzielczości pozornej, zwykle skojarzoną z najbardziej zaludnioną grupą. Upewnij się, że wybrana struktura jest wizualnie rozsądna, biorąc pod uwagę średnie klas 2D i biologiczne aspekty interesującego białka (patrz Dyskusja). Jeśli istnieją inne woluminy, które mają prawie identyczną strukturę przy podobnej rozdzielczości, należy je uznać za wyłaniające się z jednej jednorodnej grupy 3D.
  5. Wykonaj lokalne zagęszczenie względem elementów cząstkowych z najbardziej jednorodnej grupy 3D (o najwyższej rozdzielczości).
    1. Kliknij przycisk "Lokalne uściślenie podzbioru". Ustaw "Ścieżkę do pliku tekstowego podzbioru", wybierając plik tekstowy zawierający identyfikatory cząstek wybranej grupy (np. Cluster0.txt utworzone w kroku 8.3). Ustaw "Katalog zagęszczenia 3D", wybierając katalog wyjściowy poprzedniego udoskonalenia 3D (utworzonego w kroku 7.1).
    2. Ustaw opcję "Ponowne uruchamianie iteracji" na tę, w której osiągnięto najwyższą rozdzielczość w poprzednim udoskonaleniu 3D. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wykonać lokalne udoskonalenie wybranej populacji cząstek.
  6. Podobnie jak w kroku 7.2, utwórz maskę 3D o miękkich krawędziach z niefiltrowanej końcowej połowy objętości zrekonstruowanej przez lokalne udoskonalenie podzbioru.
  7. Podobnie jak w kroku 7.3, scal dwie niefiltrowane końcowe połówki woluminów uzyskane przez lokalne uściślenie podzbioru i wyostrz scalony wolumin. Jednak tym razem nie filtruj zaostrzonej głośności.
    UWAGA: Jeśli analiza heterogeniczności w kroku 8.4 wskazuje na kilka odrębnych stanów o porównywalnej rozdzielczości, można chcieć udoskonalić wszystkie różne stany niezależnie.

9. LOCALRES: Oszacuj lokalną rozdzielczość końcowej objętości 3D

  1. Oszacuj lokalną rozdzielczość objętości 3D uzyskaną z jednorodnego zestawu cząstek.
    1. Kliknij ikonę "LOCALRES", a następnie przycisk "Rozdzielczość lokalna". Ustaw "Pierwsza połowa tomu" i "Druga połowa objętości", wybierając niefiltrowane końcowe połowy tomu lokalnego uściślenia podzbioru (utworzonego w kroku 8.5). Ustaw "Maskę 3D", wybierając maskę 3D o miękkich krawędziach utworzoną w kroku 8.6. Określ ścieżkę pliku dla "Woluminu wyjściowego".
    2. Zachowaj domyślną wartość 7 pikseli dla "rozmiaru okna FSC". Pamiętaj, że to ustawienie definiuje rozmiar okna, w którym obliczana jest korelacja lokalna-przestrzeń rzeczywista; Większe rozmiary okien zapewniają płynniejsze mapy rozdzielczości kosztem lokalnej rozwiązywalności.
    3. Zachowaj domyślną wartość 0,5 wartości "Odcięcie rozdzielczości" dla kryterium rozdzielczości.
      UWAGA: Dla każdego woksela program poinformuje lokalną rozdzielczość jako częstotliwość, przy której lokalny FSC spada poniżej wybranego progu rozdzielczości. Próg niższy niż 0,5 nie jest zalecany, ponieważ niższe wartości korelacji wiążą się z dużą niepewnością statystyczną. W związku z tym odpowiednia rozdzielczość lokalna będzie się znacznie różnić między wokselami.
    4. W polu "Rozdzielczość ogólna" ustaw rozdzielczość bezwzględną szacowaną w wyostrzaniu po lokalnym zawężeniu podzbioru (krok 8.7). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby obliczyć lokalną rozdzielczość woluminu.
  2. Zastosuj filtr lokalny 3D do objętości wyostrzonej po lokalnym zawężeniu podzbioru przy użyciu mapy rozdzielczości lokalnej 3D.
    1. Kliknij przycisk "Filtr lokalny 3D". Ustaw "Głośność wejściową", wybierając wyostrzoną, ale niefiltrowaną wolumin 3D (utworzony w kroku 8.7). Podobnie ustaw "Plik rozdzielczości lokalnej" i "Maskę 3D" (utworzone odpowiednio w kroku 9.1 i 8.6). Pamiętaj, że maska 3D definiuje region, w którym zostanie zastosowane filtrowanie lokalne. Określ ścieżkę pliku dla "Woluminu wyjściowego". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby zastosować lokalny filtr 3D.
  3. Użyj Chimery, aby wizualnie sprawdzić ostateczny model 3D i mapę 3D o lokalnej rozdzielczości (utworzone odpowiednio w kroku 9, 2 i 9.1). Wybierz opcję "Kolor powierzchni", aby pokolorować objętość 3D zgodnie z rozdzielczością lokalną. Pamiętaj, że dystrybucja lokalnych rezolucji powinna być płynna (patrz Dyskusja).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół został wykonany na podstawie 112 filmów z bezpośredniego detektora komponentu A kompleksu Photorhabdus luminescens Tc (TcdA1) 20,21,22. Ten zestaw danych został zarejestrowany na kriomikroskopie elektronowym z korekcją Cs za pomocą pistoletu do emisji pola o wysokiej jasności (XFEG), działającego przy napięciu przyspieszenia 300 kV. Obrazy zostały uzyskane automatycznie z całkowitą dawką 60 e-/Å-2 przy rozmiarze piksela 1,14 A w skali próbki. Po wyrównaniu klatek filmu (Krok 2 Protokołu), uzyskane średnie skorygowane o ruch miały izotropowe pierścienie Thon rozciągające się do wysokiej rozdzielczości (Rysunek 2a). Poszczególne cząstki były dobrze widoczne i dobrze oddzielone od siebie (ryc. 2b). Cząstki zostały następnie wybrane za pomocą narzędzia roju e2boxer 18 (Protokół Krok 4.1). W tym przypadku odpowiedni próg został ustalony przy użyciu bardziej selektywnego wariantu (rysunek 2c). 112 cyfrowych mikrofotografii dostarczyło 9652 cząstek. Większość wyodrębnionych obrazów (Krok 4.2 Protokołu) zawierała dobrze zdefiniowane cząstki, a ich rozmiar pudełka był ~1,5 razy większy niż rozmiar cząstek, zgodnie z zaleceniami (Rysunek 2d). Następnie, za pomocą ISAC, przeprowadzono analizę niejednorodności 2D (Protokół Krok 5). Dało to 98 średnich klas (Rysunek 3a). Korzystając z tych średnich klas 2D, obliczono model ab initio przy użyciu VIPER (Protokół Krok 6) w rozdzielczości pośredniej (rysunek 3b). Model ten wykazuje doskonałą zgodność ze strukturą krystaliczną TcdA1 poprzednio rozwiązaną z rozdzielczością 3,9 A 22 (Rysunek 3c). Ten model ab initio został wykorzystany jako początkowy szablon do udoskonalenia 3D (MERIDIEN), uzyskując rekonstrukcję 3,5 A (kryterium 0,143) (Krok 7 protokołu) z zaledwie ~40 000 jednostek asymetrycznych (rysunek 4). Ta mapa rozdzielczości niemal atomowej została uzyskana w ciągu 24 godzin, przy użyciu do 96 procesorów na etapach przepływu pracy, które korzystają z wielu rdzeni.

Dla analizy zmienności 3D (krok 8 protokołu), w kroku 8.3.3 użyto tylko 2 000 obrazów cząstek na grupę (tj. proces rozpoczyna się od 5 początkowych grup 3D) i 200 obrazów dla najmniejszej wielkości grupy w kroku 8.3.4 ze względu na małą liczbę cząstek (~10 000). Analiza wykazała zlokalizowaną elastyczność głównie w N-końcowym regionie kompleksu, który zawiera znacznik He używany do oczyszczania (ryc. 5a). Rzeczywiście, dwanaście N-końcowych reszt i znacznik He nie zostały rozwiązane w poprzednio opublikowanej strukturze krystalicznej TcdA1 22 i ten najprawdopodobniej nieuporządkowany obszar pozostał nierozwiązany w obecnej gęstości krio-EM, prawdopodobnie ze względu na jego elastyczność. Dodatkową zmienność wykryto w domenach wiążących receptor i domenie wiążącej BC (Figura 5a). Ze względu na ogólnie zadowalającą rozdzielczość struktury i raczej niewielki rozmiar zbioru danych, ta niejednorodność została uznana za dopuszczalną i dlatego nie przeprowadzono ukierunkowanej klasyfikacji 3D 23. Na koniec obliczono lokalną rozdzielczość końcowej mapy gęstości (krok 9.1 protokołu, rysunek 5b), a wyostrzoną mapę 3D przefiltrowano lokalnie (krok 9.2 protokołu). Wolumin o tej jakości może być wykorzystany do budowania modelu de novo za pomocą Coot 24 lub dowolnego innego narzędzia do udoskonalania (Rysunek 6).

figure-results-1
Rysunek 1: Przetwarzanie obrazu za pomocą SPHIRE. (a) Graficzny interfejs użytkownika pakietu oprogramowania SPHIRE . Określony krok przepływu pracy można aktywować, wybierając odpowiedni piktogram po lewej stronie graficznego interfejsu użytkownika ("krok przepływu pracy"). Polecenia i narzędzia powiązane z tym krokiem przepływu pracy pojawią się w centralnym obszarze graficznego interfejsu użytkownika. Po wybraniu jednego z poleceń, odpowiednie parametry są wyświetlane w prawej części GUI. Parametry zaawansowane zazwyczaj nie wymagają modyfikacji wstępnie ustawionych wartości domyślnych. (b) Etapy w procesie przetwarzania obrazu pojedynczej cząstki za pomocą graficznego interfejsu użytkownika SPHERER. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Korekcja ruchu i ekstrakcja cząstek. a, b) Typowa mikrofotografia cyfrowa o niskiej jakości, niskiej dawce i korekcji dryftu, zarejestrowana z rozogniskowaniem 1,7 μm. Zwróć uwagę na izotropowe pierścienie Thona rozciągające się do rozdzielczości 2,7 A w widmie mocy (a) i dobrze dostrzegalne cząstki na obrazie 2D (b). (c) Selekcja cząstek za pomocą e2boxer. Zielone kółka oznaczają wybrane cząstki. d) Typowe cząstki surowe ekstrahowane z mikrofotografii ważonej dawką. Podziałka = 20 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Grupowanie 2D i początkowe generowanie modelu. (a) Galeria średnich klas 2D, z których większość reprezentuje widoki cząstki z boku. Podziałka = 20 nm. orazMapa 3D TcdA1 ab initio uzyskana za pomocą RVIPER z bezreferencyjnych średnich klas. c) Dopasowanie struktury krystalicznej TcdA1 (wstęgi) (pdb-id 1VW1) do początkowej gęstości krio-EM (przezroczysty szary). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Struktura Cryo-EM 3D TcdA1. a, b) Ostateczna mapa gęstości TcdA1 o gęstości 3,5 A obliczona przy użyciu ~9 500 obrazów cząstek: (a) widok z boku i (b) widok z góry. c) Reprezentatywne obszary gęstości krio-elektromagnetycznej dla α-helisy i β-arkusza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza zmienności i rozdzielczość lokalna. a) Powierzchnia zaostrzonej mapy krioelektromagnetycznej TcdA1 (kolor szary) i mapy zmienności (kolor zielony). Dla lepszej przejrzystości mapa zmienności została przefiltrowana dolnoprzepustowa do 30 A. (b) Renderowanie powierzchni zaostrzonej mapy krio-EM TcdA1 pokolorowanej zgodnie z lokalną rozdzielczością (A). Zwróć uwagę na zgodność topologiczną między obszarami o dużej zmienności i niskiej rozdzielczości lokalnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Budowanie modelu 3D TcdA1 przy użyciu Coot. Reprezentatywne obszary gęstości krio-EM i modelu atomowego pokazano dla α-helisy. Model atomowy został zbudowany de novo przy użyciu Coot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojedynczy cząstek cryo-EM wykazał szybki rozwój w ostatnich latach i dostarczył licznych struktur rozdzielczych kompleksów makromolekularnych o dużym znaczeniu biologicznym25. Aby wesprzeć dużą liczbę początkujących użytkowników, którzy obecnie wkraczają w tę dziedzinę, opracowaliśmy platformę do analizy obrazu pojedynczych cząstek SPHIRE i przedstawiamy tutaj protokół instruktażowy dla całego przepływu pracy, w tym wyrównywania filmów, wybierania cząstek, szacowania CTF, wstępnych obliczeń modelu, analizy niejednorodności 2D i 3D, udoskonalania 3D w wysokiej rozdzielczości oraz szacowania i filtrowania rozdzielczości lokalnej.

Opisany tutaj protokół ma służyć jako krótki przewodnik po określaniu struktury 3D przy użyciu mikrofotografii krio-EM białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz przy pomocy narzędzi obliczeniowych dostarczanych przez samodzielny graficzny interfejs użytkownika SPHIRE.

Główną cechą przepływu pracy jest to, że większość procedur musi być uruchomiona tylko raz, ponieważ opierają się one na koncepcji walidacji przez odtwarzalność19 i nie wymagają dostosowywania parametrów. Ten automatyczny mechanizm walidacji jest główną zaletą SPHIRE w porównaniu z innymi pakietami oprogramowania, ponieważ wyniki są zwykle obiektywne, powtarzalne i, co najważniejsze, możliwe do uzyskania przy akceptowalnych kosztach obliczeniowych. Pipeline zapewnia ponadto bogactwo informacji diagnostycznych dla doświadczonych użytkowników w celu przeprowadzenia dalszej niezależnej walidacji i oceny przy użyciu własnych metod. Niemniej jednak początkujący użytkownik, który ma co najmniej elementarne przygotowanie teoretyczne w zakresie biologii strukturalnej i mikroskopii elektronowej, powinien być w stanie uzyskać struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej przy użyciu własnych danych i zautomatyzowanych procedur walidacji.

Jednak uzyskanie struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej nie zawsze jest proste, a wynik będzie w dużym stopniu zależał od jakości próbki i danych wejściowych. Dla przedstawionych tutaj procedur zakłada się, że dostępna jest wystarczająca liczba wysokiej jakości niewyrównanych surowych filmów EM, których średnie pokazują wyraźnie dostrzegalne jednorodne i losowo zorientowane pojedyncze cząstki. Ogólnie rzecz biorąc, nie ma ograniczeń dotyczących symetrii, wielkości lub ogólnego kształtu cząsteczki, ale niska masa cząsteczkowa może być czynnikiem ograniczającym, zwłaszcza gdy białko ma pozbawiony cech kształt kulisty. Zazwyczaj analiza większych, dobrze uporządkowanych cząstek o wysokiej symetrii punktowo-grupowej jest mniej wymagająca. Dlatego zdecydowanie zaleca się, aby początkujący użytkownicy najpierw uruchomili obecny protokół z dobrze scharakteryzowanym zestawem danych cryo-EM. Dobrym punktem wyjścia są dane z samouczka SPHIRE (http:/sphire.mpg.de) lub jeden z zestawów danych (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) przesłanych przez EMPIAR z surowymi filmami.

Podczas przetwarzania własnych danych istnieje duże prawdopodobieństwo, że niektóre zbiory danych lub niektóre obrazy nie będą spełniać określonych kryteriów jakościowych. W tym kontekście, oprócz automatycznych kontroli stabilności i odtwarzalności, wykonywanych przez program dla głównych etapów przepływu pracy, nadal zaleca się, aby użytkownicy wizualnie sprawdzali wyniki w określonych "punktach kontrolnych" protokołu, zwłaszcza jeśli ostateczna rekonstrukcja nie jest zadowalająca.

Pierwszą kontrolę wzrokową można przeprowadzić na poziomie mikrofotografii po wyrównaniu filmu (krok 2 protokołu) i oszacowaniu CTF (krok 3 protokołu). Otrzymane średnie skorygowane o ruch powinny pokazywać wyraźnie dostrzegalne i dobrze oddzielone pojedyncze cząstki, a ich widma mocy powinny pokazywać wyraźnie dostrzegalne, izotropowe pierścienie Thon. Częstotliwość przestrzenna, do której są one widoczne, określa w większości przypadków najwyższą rozdzielczość, do której w zasadzie można ostatecznie określić konstrukcję. Przykłady średniej skorygowanej ruchem o wystarczającej jakości i jej spektrum mocy przedstawiono w sekcji "Reprezentatywne wyniki". Obrazy odstające, które mogą mieć negatywny wpływ na wynik końcowy, można usunąć za pomocą narzędzi GUI do oceny dryfu i CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).

Jeśli chodzi o badania przesiewowe cząstek, kluczowym krokiem w procesie projektowania SPHIRE jest klasyfikacja 2D przy użyciu ISAC (Protocol step 5.2). W tym przypadku użytkownik powinien kontrolować, czy powtarzalne średnie klas 2D identyfikowane automatycznie przez program przyjmują zakres orientacji wystarczający do prawie równomiernego pokrycia przestrzeni kątowej. Jeśli jakość średnich klas nie jest zadowalająca (zaszumione i/lub rozmyte obrazy) i/lub liczba powtarzalnych średnich klas jest bardzo niska, należy rozważyć poprawę jakości automatycznego wybierania, optymalizację obrazowania zestawu danych lub przygotowanie próbki. W większości przypadków nie jest możliwe obliczenie wiarygodnej rekonstrukcji na podstawie zestawu danych, który nie daje dobrych średnich klas 2D. Przykłady wysokiej jakości średnich klas 2D znajdują się w sekcji "Reprezentatywne wyniki".

Do uzyskania wiarygodnego początkowego modelu 3D przy użyciu RVIPER w sposób zautomatyzowany wymaganych jest co najmniej 100 średnich klas (krok 6.1 protokołu). Na tym etapie użytkownik powinien wybrać średnie o najwyższej jakości i uwzględnić jak najwięcej różnych orientacji cząstki. Jakość początkowego modelu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia późniejszego udoskonalenia 3D w wysokiej rozdzielczości.

W innych pakietach oprogramowania klasyfikacja 3D jest czasami wykonywana w celu usunięcia "złych" cząstek 8,9. Jednak w SPHIRE większość tych cząstek jest automatycznie eliminowana już podczas klasyfikacji 2D za pomocą ISAC. W związku z tym zaleca się wykonywanie intensywnego obliczeniowo etapu sortowania 3D tylko wtedy, gdy rekonstrukcja i analiza zmienności 3D wskazują na niejednorodność zbioru danych.

Co najważniejsze, użytkownik powinien zawsze dokładnie sprawdzić wynikowe objętości 3D (krok 9.3 protokołu) i upewnić się, że cechy danej gęstości dobrze zgadzają się z rozdzielczością nominalną. Przy rozdzielczości <9 A widoczne stają się gęstości przypominające pręciki odpowiadające α-helisom. Przy rozdzielczości <4,5 A gęstości odpowiadające pasmom w arkuszach β są zwykle dobrze oddzielone i widoczne stają się duże aminokwasy. Mapa o wysokiej rozdzielczości (<3 A) powinna pokazywać wyraźnie dostrzegalne łańcuchy boczne, co pozwoli na zbudowanie dokładnego modelu atomowego.

Uzyskane do tej pory wyniki pokazują, że dzięki zautomatyzowanym testom odtwarzalności SPHIRE i minimalnym kontrolom wizualnym, niniejszy protokół ma ogólne zastosowanie do każdego rodzaju projektu krio-EM z pojedynczymi cząstkami. Reprezentatywne wyniki każdego etapu przetwarzania przedstawiono dla rekonstrukcji toksyny TcdA1 Photorhabdus luminescens 21, która została rozwiązana do rozdzielczości bliskiej atomowi. Mapy gęstości o podobnej jakości mogą być wykorzystywane do konstruowania wiarygodnych modeli atomowych poprzez śledzenie szkieletowe de novo , a także udoskonalanie w przestrzeni odwrotnej lub rzeczywistej, a tym samym zapewniają solidną strukturę strukturalną dla zrozumienia złożonych mechanizmów molekularnych.

KODY AKCEZYJNE:

Współrzędne struktury EM i nieprzetworzonych filmów zostały zdeponowane w Banku Danych Mikroskopii Elektronowej i Archiwum Obrazów Pilotażowych Mikroskopii Elektronowej pod numerami dostępu odpowiednio EMD-3645 i EMPIAR-10089.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy D. Rodererowi za dostarczenie nam mikrofotografii TcdA1. Dziękujemy Steve'owi Ludtke za jego nieustanne wsparcie dla infrastruktury EMAN2. Prace te były wspierane przez fundusze Towarzystwa Maxa Plancka (dla S.R.) i Rady Europejskiej w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) (grant nr 615984) (dla S.R.) oraz grant z National Institutes of Health R01 GM60635 dla P.A.P.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Instytut Fizjologii Molekularnej SPHIRE Max Planck - Dortmund  oraz Houston Medical School, Houston, Teksas http://sphire.mpg.de
UCSF Uniwersytet Kalifornijski Chimera, San Franciscohttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
UnblurJanelia Farm Research Campus, Ashburnhttp://grigoriefflab.janelia.org/unblur
CootMRC Laboratory of Molecular Biology,  http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2Baylor College of Medicine, Houstonhttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Klaster obliczeniowy z 1824 rdzeniamiMax Planck Institute of Molecular PhysiologyLinux Cluster z 76  węzłami, każdy z 2 procesorami Xeon E5-2670v3 12C 2,30 GHz i 128 Gb RAM
TITAN KRIOS mikroskop elektronowy FEI300 kV, poprawka Cs, XFEG
Falcon II bezpośredni detektor elektronówFEI
EPU (oprogramowanie do automatycznej akwizycji danych)FEIhttps://www.fei.com/software/epu/
Cambridge

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , Oxford University Press. (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle AnalysisElectron Cryo microscopySPHIRE Software3D RefinementCTF EstimationParticle PickingISAC 2D ClusteringVIPER Initial ModelMERIDIEN RefinementLocal Resolution Analysis

Related Articles