Artykuł metodologiczny

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

51.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55448

⸱

16 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biochemistry, Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas Medical School at Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Streszczenie

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) to nowatorski, przyjazny dla użytkownika pakiet oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym do półautomatycznego przetwarzania danych z kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) dla pojedynczych cząstek. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać strukturę o rozdzielczości zbliżonej do atomowej, zaczynając od filmów z mikrofotografii cryo-EM, prowadząc użytkowników przez wszystkie etapy procesu określania struktury pojedynczej cząstki. Kroki te są kontrolowane z nowego graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE i wymagają minimalnej interwencji użytkownika. Korzystając z tego protokołu, strukturę 3,5 A TcdA1, kompleksu toksyny Tc z Photorhabdus luminescens, uzyskano z zaledwie 9500 pojedynczych cząstek. To uproszczone podejście pomoże początkującym użytkownikom bez dużego doświadczenia w przetwarzaniu i informacji strukturalnych a priori, w uzyskaniu wolnych od szumów i bezstronnych modeli atomowych ich oczyszczonych kompleksów makromolekularnych w ich stanie naturalnym.

Wprowadzenie

Po rozwoju technologii bezpośredniego detektora elektronów, niezwykły postęp w krio-EM pojedynczych cząstek obecnie przekształca biologię strukturalną 1. W porównaniu z krystalografią rentgenowską, technika ta wymaga jedynie niewielkiej ilości materiału białkowego bez konieczności krystalizacji, a jednocześnie stwarza mniej ograniczeń dotyczących czystości próbki i nadal umożliwia oznaczanie struktur w rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Co ważne, różne składy lub stany mogą być teraz obliczeniowo oddzielone, a określanie struktury różnych konformacji może być przeprowadzane na niespotykanym dotąd poziomie szczegółowości. Ostatnio udało się stworzyć mapy gęstości trudnych cząsteczek w rozdzielczościach pozwalających na budowanie modeli de novo, a tym samym głębokie zrozumienie ich sposobu działania 2,3,4,5.

W społeczności 3DEM (3D Electron Microscopy) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) dostępna jest szeroka gama pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów, a większość z nich jest stale rozwijana. Rozdzielczość prawie atomowa została osiągnięta dla białek wykazujących różne masy cząsteczkowe i symetrie za pomocą kilku różnych pakietów oprogramowania, w tym EMAN2 6, IMAGIC7, FREALIGN 8, RELION 9, SPIDER 10 i SPARX 11. Każdy pakiet wymaga innego poziomu wiedzy użytkownika i zapewnia inny poziom wskazówek dla użytkownika, automatyzacji i rozszerzalności. Co więcej, podczas gdy niektóre programy zapewniają kompletne środowiska ułatwiające wszystkie etapy analizy obrazu, inne są zaprojektowane w celu optymalizacji określonych zadań, takich jak udoskonalanie parametrów wyrównania, zaczynając od znanej struktury referencyjnej. Ostatnio opracowano kilka platform, w tym APPION 12 i SCIPION 13, które zapewniają pojedynczy potok przetwarzania, który integruje podejścia i protokoły z różnych pakietów oprogramowania wymienionych powyżej.

Aby przyczynić się do obecnego rozwoju cryo-EM, SPARX został ponownie opracowany jako nowa, samodzielna i kompletna platforma do analizy pojedynczych cząstek, zwana SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy). W celu zwiększenia dostępności tej techniki dla początkujących badaczy w tej dziedzinie i poradzenia sobie z dużą ilością danych generowanych przez nowoczesne, w pełni zautomatyzowane, wysokiej klasy mikroskopy elektronowe, proces przetwarzania został przeprojektowany i uproszczony poprzez wprowadzenie łatwego w użyciu graficznego interfejsu użytkownika (GUI) i automatyzację głównych etapów przepływu pracy. Co więcej, dodano nowe algorytmy, które umożliwiają szybkie, powtarzalne i zautomatyzowane określanie struktury na podstawie obrazów kriogenicznych. Ponadto wprowadzono walidację na podstawie odtwarzalności, aby uniknąć typowych artefaktów powstających podczas udoskonalania i analizy heterogeniczności.

Chociaż program został gruntownie zmodyfikowany, jego cenione podstawowe cechy zostały zachowane: prosty kod open-source, nowoczesny projekt zorientowany obiektowo i interfejsy Pythona dla wszystkich podstawowych funkcji. Dzięki temu nie został zamieniony w program typu skrzynka, umożliwiający użytkownikom studiowanie i łatwe modyfikowanie kodu Pythona, tworzenie dodatkowych aplikacji lub modyfikowanie ogólnego przepływu pracy. Jest to szczególnie przydatne w przypadku niestandardowych projektów krio-EM.

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania mapy gęstości o niemal atomowej rozdzielczości z obrazów krio-EM za pomocą graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE. Opisuje szczegółowo wszystkie kroki wymagane do wygenerowania mapy gęstości z surowych filmów z bezpośredniego detektora cryo-EM i nie jest ograniczony do żadnego konkretnego typu makrocząsteczki. Protokół ten ma na celu przede wszystkim przeprowadzenie nowicjuszy w tej dziedzinie przez przepływ pracy i dostarczenie ważnych informacji na temat kluczowych etapów przetwarzania, a także niektórych możliwych pułapek i przeszkód. Bardziej zaawansowane funkcje i podstawy teoretyczne SPHIRE zostaną opisane w innym miejscu.

Protokół

UWAGA: Aby postępować zgodnie z tym protokołem, konieczne jest poprawne zainstalowanie SPHIRE w systemie z instalacją MPI (obecnie jest to klaster Linux). Pobierz SPHIRE i zestaw danych TcdA1 z http://www.sphire.mpg.de i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. Ta procedura instaluje również EMAN2. SPHIRE obecnie używa e2boxera EMAN2 do selekcji cząstek i e2display do wyświetlania plików graficznych. Do korekcji ruchu w surowych filmach z mikrofotografii w zależności od dawki, SPHIRE używa unblur 14. Pobierz program i postępuj zgodnie z instrukcją instalacji (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff lab). Do interaktywnej wizualizacji powstałych struktur protokół użyje programu do grafiki molekularnej Chimera 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). Fajny samouczek umożliwiający zapoznanie się z funkcjami używanymi w tym protokole można znaleźć tutaj: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. Instrukcje dotyczące przesyłania zadania równoległego do klastra z graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE można znaleźć tutaj: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. Ogólna organizacja graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE i główne etapy przepływu pracy wykonywane w tym protokole są zilustrowane na rysunku 1.

1. PROJEKT: Ustaw stałe wartości parametrów dla tego projektu

  1. Uruchom aplikację SPHIRE GUI, wpisując "sphire &" i ENTER w oknie terminala.
  2. Dostosuj parametry całego projektu (np. rozmiar piksela, promień cząstek i symetrię) w odpowiednich polach wejściowych na stronie ustawień projektu, a następnie zarejestruj te wartości dla wszystkich kolejnych etapów przepływu pracy.
    1. Kliknij ikonę "PROJEKT" w prawym dolnym rogu lewego panelu, aby otworzyć stronę ustawień projektu.
    2. Zmierz najdłuższą oś cząstki za pomocą interaktywnego narzędzia do wyświetlania obrazu e2display.py, a następnie wprowadź połowę rozmiaru cząstki w polu "Promień cząstki białka". Jeśli pomiar jest w A, pamiętaj, aby przeliczyć jednostkę na piksele przy użyciu rozmiaru piksela (np. jeśli cząstka ma długość 200 A, a rozmiar piksela wynosi 1,2 A/piksel, to najdłuższa oś cząstki wynosi 200/1,2 = ~166 pikseli, a promień 166/2 = 83 piksele).
    3. Ustaw "Rozmiar pudełka na cząstki" na co najmniej 1,5 raza wielkości cząstek. Unikaj rozmiarów okien zawierających dużą liczbę pierwszą. Pamiętaj też, że algorytm udoskonalania 3D wymaga obecnie parzystego rozmiaru pola.
      UWAGA: Okno powinno zawierać margines uwzględniający początkowe błędy centrowania wynikające z wybierania (konieczność przesunięcia cząstek w obrębie okna) oraz obszar tła wystarczający poza granicą cząstek do prawidłowej korekcji CTF (szczególnie ważne dla dużych wartości rozmycia16).
    4. Ustaw "Rozmiar okna CTF" na "Rozmiar pudełka na cząstki". W przypadku projektów z danymi o niskim kontraście należy użyć większego okna, aby uzyskać płynniejsze oszacowania widm mocy.
    5. Ustaw "Symetria grupy punktów" kompleksu (np. "C5"). Jeśli symetria struktury docelowej nie jest znana, pozostaw ją na poziomie "C1" (asymetryczna). Jeśli jednak w dalszej części przetwarzania zostanie zidentyfikowana określona symetria wysokiego rzędu, należy odpowiednio zmienić to ustawienie symetrii i powtórzyć kroki po wyrównaniu 2D za pomocą ISAC.
    6. Ustaw "Masę cząsteczkową białka" w kDa (wystarczy wartość przybliżona). Naciśnij przycisk "Zarejestruj ustawienia".

2. FILM: Wyrównaj klatki każdego mikrografu filmu, aby skorygować ogólny ruch próbki

  1. Dla wszystkich mikrofotografii filmowych oblicz przesunięcia x/y dla wszystkich klatek, a następnie utwórz ich średnią bez dawki i z korektą ruchu (patrz Dyskusja). Należy zauważyć, że pierwsza z nich jest konieczna tylko do oszacowania CTF, ponieważ oszacowanie nie działa dobrze w przypadku średnich ważonych dawką, podczas gdy drugie jest używane do wszystkich innych etapów określania struktury.
    1. Kliknij ikonę "MOVIE", a następnie przycisk "Micrograph Movie Alignment". Ustaw "Rozmyj ścieżkę wykonywalną", wybierając plik wykonywalny. Ustaw "Wprowadź wzorzec ścieżki mikrografu", wybierając surowy, niewyrównany mikrograf filmowy i zastępując zmienną część nazw plików symbolem wieloznacznym "*" (np. TcdA1_*.mrc). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Summovie ścieżkę pliku wykonywalnego", wybierając plik wykonywalny.
    3. Ustaw "Liczba klatek filmu" na liczbę klatek w każdym mikrofotografii filmu. Ustaw "Napięcie mikroskopu" i "Ekspozycja na klatkę" na wartości używane podczas zbierania danych. (Na przykład, jeśli całkowita dawka wynosi 60 e-/A2 przy 20 klatkach nagranych bez wstępnej ekspozycji, ekspozycja dla każdej klatki wynosi 60/20 = 3 e-/A2.) Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wyrównać klatki każdego mikrografu filmu.
      UWAGA: Spowoduje to automatyczne utworzenie dwóch katalogów wyjściowych zawierających odpowiednio mikrofotografie średnie z korekcją ruchu bez dawki i z korektą ruchu.

3. CTER: Oszacuj parametry rozmycia i astygmatyzmu CTF

  1. Oszacuj parametry CTF (rozmycie i astygmatyzm; pozostałe są ustawiane przez użytkownika) dla każdej mikrofotografii średniej nieważonej dawką.
    1. Kliknij ikonę "CTER", a następnie przycisk "Oszacowanie CTF". Aby ustawić "Wzorzec ścieżki mikrografu wejściowego", wybierz mikrofotografię z korekcją ruchu bez ważenia dawki, a następnie zastąp zmienną część nazw plików symbolem wieloznacznym "*". Określ również ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Kontrast amplitudy" na wartość rutynowo używaną dla rodzaju danych (grubość lodu jest głównym czynnikiem) i napięcia mikroskopu w laboratorium (np. 10%). Typowe wartości mieszczą się w zakresie od 7 do 14%17.
    3. Ustaw "Aberracja sferyczna mikroskopu (Cs)" i "Napięcie mikroskopu" używane podczas zbierania danych.
    4. Ustaw "Najniższą częstotliwość" i "Najwyższą częstotliwość" zakresu wyszukiwania dla modelu CTF pasując odpowiednio do 0,0285 i 0,285 A-1 (40 - 4 A). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby oszacować parametry CTF.
      UWAGA: Parametry CTF zostaną automatycznie zapisane w pliku partres.txt w określonym katalogu wyjściowym. Estymacja CTF dla 112 mikrofotografii została obliczona na 96 rdzeniach i zakończona po ~3 minutach na klastrze Linux użytym do uzyskania reprezentatywnych wyników.

4. OKNO: Wyodrębnij cząstki z mikrofotografii średniej ważonej dawką

  1. Wybieraj cząstki ręcznie lub automatycznie z mikrofotografii za pomocą e2boxer6 i twórz pliki współrzędnych, z których każdy zawiera listę współrzędnych xy cząstek w powiązanym mikrografie.
    1. Kliknij ikonę "OKNO", a następnie przycisk "Wybieranie cząstek". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby uruchomić e2boxer 6i wybierz cząstki z każdej mikrofotografii ręcznie lub automatycznie18 (zobacz Dyskusja). Zapisz końcowe współrzędne cząstek dla każdego mikrografu w formacie pliku EMAN1 (.box). Alternatywnie można zaimportować pliki współrzędnych z innych programów po przekonwertowaniu ich do formatu EMAN1.
  2. Twórz stosy cząstek, wyodrębniając obrazy cząstek z mikrofotografii ważonych dawką (w SPHIRE stos cząstek jest często nazywany po prostu "stosem").
    1. Naciśnij przycisk "Ekstrakcja cząstek". Określ "Wzorzec ścieżki mikrografu wejściowego", wybierając mikrografię z korekcją ruchu ważoną dawką, a następnie zastępując zmienną część nazw plików symbolem wieloznacznym "*" (np. TcdA1_*.mrc). Podobnie ustaw "Wprowadź wzorzec ścieżki współrzędnych", wybierając plik współrzędnych (np. TcdA1_*.box). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Źródło parametrów CTF", wybierając plik parametrów CTF (partres.txt utworzony w kroku 3.1). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
  3. Połącz wyodrębnione stosy obrazów cząstek w jeden.
    1. Kliknij przycisk "Stos cząstek". Określ ścieżkę do "Wyjściowego stosu obrazów wirtualnych" przy użyciu formatu ścieżki pliku BDB (np. "bdb:Particles/stack", gdzie "Particles" wskazuje na katalog zawierający katalog bazy danych BDB, którego nazwa jest zawsze EMAN2DB, a "stack" odnosi się do określonego stosu obrazów w tej bazie danych). Określ "Wejściowy wzorzec stosu obrazów BDB", wybierając katalog zaczynający się od "mpi_proc", a następnie zastępując zmienną część nazw katalogów symbolem wieloznacznym "*" (np. Cząstki/mpi_proc_000 na Cząstki/mpi_proc_*). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".

5. ISAC: Klasyfikacja obrazów cząstek w 2D

  1. Obliczanie średnich klas 2D poprzez wyrównywanie cząstek i grupowanie ich zgodnie z ich wyglądem 2D.
    UWAGA: Wynikowe średnie 2D mają lepszy stosunek sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z obrazami pojedynczych cząstek, a zatem są wykorzystywane do wizualnej oceny jakości i niejednorodności zestawu danych, a także do sortowania niepożądanych obrazów ze stosu (np. kryształki lodu, krawędzie węgla, agregaty, fragmenty itp.)19. Co więcej, zostaną one następnie wykorzystane do określenia wstępnego modelu 3D.
    1. Kliknij ikonę "ISAC", a następnie przycisk "ISAC - Klastrowanie 2D". Ustaw "Stos obrazu wejściowego", wybierając plik stosu zawierający wyodrębnione cząstki. Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Użyj 200 - 1000 dla "Obrazów na klasę". Wybierz odpowiednią liczbę, biorąc pod uwagę oczekiwaną liczbę klas 2D (całkowita liczba cząstek podzielona przez liczbę obrazów na klasę). Dostosuj ten parametr w zależności od SNR i rozmiaru zestawu danych. Zwiększ liczbę elementów członkowskich na klasę w przypadku, gdy zestaw danych jest nadmiernie hałaśliwy. Zmniejsz tę liczbę, gdy dostępna jest mała liczba cząstek.
      UWAGA: Ze względu na ograniczenia pamięci, w przypadku dość dużych zbiorów danych (>100 000 cząstek), podziel cały zestaw danych na podzbiory, wykonaj ISAC dla każdego podzbioru niezależnie i połącz wyniki na końcu. Szczegółowe instrukcje dotyczące tego scenariusza przetwarzania znajdują się w http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php.
    3. Zaznacz pole wyboru "Odwrócenie fazy". Zachowaj domyślne wartości dla "Docelowego promienia cząstek" i "Docelowego rozmiaru obrazu cząstek", aby przyspieszyć proces poprzez automatyczne zmniejszanie wszystkich obrazów cząstek przy tych ustawieniach. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby obliczyć średnie klasy 2D.
      UWAGA: Ten krok jest wymagający obliczeniowo, a czas działania znacznie się wydłuża wraz z liczbą cząstek i klas, a także promieniem celu i rozmiarem obrazu. Na klastrze z 96 procesami klasyfikacja 2D ~10 000 cząstek zakończyła się po około 90 minutach.
  2. Wyświetl i wizualnie sprawdź wynikowe średnie ISAC 2D, aby upewnić się, że ich jakość jest zadowalająca (patrz Dyskusja).
    1. Naciśnij przycisk "Wyświetl dane" w sekcji "NARZĘDZIA". Ustaw "Pliki wejściowe", wybierając plik zawierający średnie ISAC 2D (class_averages.hdf utworzone w kroku 5.1). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wyświetlić końcowe, powtarzalne i zatwierdzone średnie klas dostarczone przez ISAC.
  3. Utwórz nowy stos zawierający tylko cząstki składowe zweryfikowanych średnich klas.
    1. Naciśnij przycisk "Utwórz podzbiór stosu". Ustaw "Stos obrazu wejściowego", wybierając ten sam plik stosu, co w kroku 5.1.1. Ustaw "Średnie ISAC", wybierając średnie ISAC 2D (class_averages.hdf utworzone w kroku 5.1). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".

6. VIPER: Oblicz początkowy model 3D

  1. Wybierz mały zestaw średnich klas (≥100 obrazów), usuwając wszystkie złe średnie klasowe i identyczne widoki cząstki (patrz Dyskusja) i użyj ich do obliczenia powtarzalnego modelu początkowego za pomocą VIPER. Pamiętaj, że wybór powinien zawierać co najmniej 60-80 wysokiej jakości średnich, z których każdy ma ~200-500 członków.
    1. Kliknij ikonę "VIPER", a następnie przycisk "Wyświetl dane". Ustaw "Pliki wejściowe", wybierając średnie ISAC 2D (class_averages.hdf utworzone w kroku 5.1). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
    2. Naciśnij środkowy przycisk myszy gdzieś w oknie graficznym wyświetlacza e2display i aktywuj przycisk "DEL " w wyskakującym okienku. Usuń wszystkie złe średnie klasowe i identyczne widoki cząstki (patrz Dyskusja). Naciśnij przycisk "Zapisz", aby zapisać pozostałe średnie klas 2D do nowego pliku.
  2. Na podstawie wybranych średnich ISAC wygeneruj początkowe odniesienie do kolejnego zagęszczenia 3D.
    1. Kliknij przycisk "Wstępny model 3D - RVIPER". Ustaw "Stos obrazów wejściowych", wybierając prześwietlone średnie klas (utworzone w kroku 6.1). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Upewnij się, że używasz tej samej wartości dla "Docelowego promienia cząstek", co w kroku 5.1.3 ISAC. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wygenerować powtarzalny model 3D ab initio.
      UWAGA: Ten krok jest wymagający obliczeniowo, a czas pracy znacznie się wydłuża wraz z liczbą średnich i rozmiarem cząstek. W klastrze z 96 procesami to zadanie (~100 średnich klas) zakończyło się po ~15 minutach.
  3. Sprawdź, czy wynikowy model 3D jest rozsądny, biorąc pod uwagę średnie klas, a także jego integralność strukturalną (tj. brak rozłączonych części i/lub artefaktów kierunkowych). Aby wyświetlić mapę, użyj programu Chimera15. W tym momencie należy przeprowadzić pierwsze porównanie ze strukturą krystaliczną białka homologicznego lub domeną białka będącego przedmiotem zainteresowania, jeśli taka istnieje (przykład pokazano w sekcji Reprezentatywne wyniki).
  4. Aby następnie udoskonalić obraz 3D, wygeneruj początkowe odniesienie 3D i maskę 3D na podstawie modelu 3D ab initio, usuwając otaczający go szum i ponownie skalując go w celu dopasowania do oryginalnego rozmiaru piksela.
    1. Kliknij przycisk "Utwórz odniesienie 3D". Ustaw "Głośność wejściową", wybierając model 3D ab initio (average_volume.hdf utworzony w kroku 6.2). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw opcję "Źródło współczynnika ponownego próbkowania", wybierając plik współczynnika skurczu ISAC (README_shrink_ratio.txt utworzony w kroku 5.1). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".

7. MERIDIEN: Udoskonal początkową objętość 3D

  1. Uściślij objętość 3D, zaczynając od początkowego modelu 3D.
    1. Kliknij ikonę "MERIDIEN", a następnie przycisk "Udoskonalenie 3D". Ustaw "Stos obrazów wejściowych" i "Początkowe odniesienie 3D", wybierając stos cząstek i model 3D ab initio (utworzony odpowiednio w kroku 5.3 i 6.4). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Maskę 3D", wybierając plik maski 3D (utworzony w kroku 6.4). Zawsze używaj maski 3D, ale szczególnie na wczesnym etapie analizy używaj maski sferycznej lub maski o miękkich krawędziach luźno dopasowanej do odniesienia, aby uniknąć wprowadzenia stronniczości lub nieprawidłowego maskowania.
    3. Zaznacz pole wyboru "Zastosuj twardą maskę 2D". Ustaw "Rozdzielczość początkową" na wartość częstotliwości odcięcia w zakresie 20 - 25 A. Należy pamiętać, że filtr dolnoprzepustowy z tą częstotliwością odcięcia zostanie zastosowany do początkowej struktury 3D w celu zmniejszenia początkowego odchylenia modelu.
    4. Sprawdź specyfikację klastra używanego w tym procesie, a następnie ustaw "Pamięć na węzeł" na dostępną pamięć w gigabajtach. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby udoskonalić objętość 3D, zaczynając od początkowego modelu 3D w sposób w pełni zautomatyzowany.
      UWAGA: Ta procedura podzieli zestaw danych na dwie połowy, udoskonali oba modele niezależnie i wygeneruje dwie surowe objętości, z których każda będzie zawierać tylko połowę cząstek. Jest wymagający obliczeniowo, a czas pracy znacznie się wydłuża wraz z liczbą cząstek. Na tej gromadzie udoskonalanie meridianu zakończyło się po ~2,5 h przebiegu na 192 procesach (~8 000 cząstek, 352 wielkości pudełka).
  2. Utwórz maskę 3D o miękkich krawędziach z wyrafinowanej objętości do kolejnego kroku wyostrzania.
    1. Kliknij przycisk "Adaptacyjna maska 3D". Ustaw "Głośność wejściową", wybierając jedną z niefiltrowanych połówek głośności (utworzonych w kroku 7.1). Określ ścieżkę dla "Maski wyjściowej".
    2. Ustaw wartość "Próg binaryzacji". Użyj Chimery, aby upewnić się, że przy tym konkretnym progu szum wyraźnie wykracza poza objętość zainteresowania w obszarze rozpuszczalnika niefiltrowanych map połówkowych, a wszystkie gęstości białka są nadal ze sobą połączone. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby utworzyć maskę 3D z miękkimi krawędziami.
      UWAGA: Główna część wynikowej maski (składająca się z wokseli, których wartości wynoszą >0,5) powinna ściśle przylegać do struktury cząstek, ale nadal zawierać wszystkie interesujące nas gęstości. Spadek miękkiej krawędzi powinien mieć szerokość co najmniej 8-10 pikseli.
  3. Scal dwie niefiltrowane połówki objętości uzyskane przez udoskonalenie 3D. Następnie wyostrz scaloną głośność, dostosowując widmo mocy w oparciu o funkcję przenoszenia modulacji (MTF) detektora, szacowany współczynnik B i oszacowanie rozdzielczości FSC (korelacja powłoki Fouriera).
    1. Wybierz przycisk "Wyostrzanie". Ustaw "Pierwsza niefiltrowana połówka woluminu" i "Druga niefiltrowana połówka woluminu", wybierając odpowiednie pliki (vol_0_unfil.hdf i vol_1_unfil.hdf utworzone w kroku 7.1). Zawsze używaj opcji "B-factor enhancement". Zazwyczaj należy zachować wartość domyślną, aby oszacować wartość współczynnika B z wejściowego zestawu danych przy użyciu zakresu między częstotliwością rozdzielczości końcowej a 10 A. Alternatywnie określ wartość ad hoc (np. -100).
    2. Zachowaj wartość domyślną dla "Częstotliwość filtra dolnoprzepustowego", aby zastosować filtr oparty na FSC.
    3. Ustaw "Maskę dostarczoną przez użytkownika", wybierając maskę 3D (utworzoną w kroku 7.2). Pamiętaj, że zgłoszona rozdzielczość zostanie określona za pomocą FSC z tą maską. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wyostrzyć udoskonaloną objętość 3D.
  4. Wygeneruj mapę rozkładu kątowego 3D na podstawie kierunków rzutowania wszystkich cząstek oszacowanych przez powyższy krok udoskonalania 3D.
    1. Kliknij przycisk "Rozkład kątowy". Ustaw "Plik parametrów wyrównania", wybierając plik (final_params.txt utworzony w kroku 7.1) i naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
  5. Sprawdź wzrokowo wyostrzony model 3D za pomocą Chimery. Upewnij się, że struktura wydaje się rozsądna, biorąc pod uwagę osiągniętą rozdzielczość (patrz Dyskusja).
  6. Sprawdź wzrokowo rozkład kątowy za pomocą Chimery. Sprawdź, czy rozkład obejmuje w przybliżeniu równomiernie całą przestrzeń kątową 3D. Należy pamiętać, że w przypadku struktur symetrycznych rozkład jest ograniczony w obrębie unikalnego trójkąta asymetrycznego.

8. SORT3D: Sortuj niejednorodność 3D, skupiając się na bardzo zmiennych regionach

  1. Oblicz mapę zmienności 3D na podstawie stosu cząstek użytego w uściśleniu 3D.
    1. Kliknij ikonę "SORT3D", a następnie przycisk "Szacowanie zmienności 3D". Ustaw "Stos obrazu wejściowego", wybierając ten sam stos cząstek ekranowanych, który został podany w kroku udoskonalania 3D 7.1.1. Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Zachowaj wartość domyślną dla "Liczba projekcji".
      UWAGA: Obrazy z otoczenia kątowego zostaną użyte do oszacowania wariancji 2D przy każdym kącie projekcji 3D. Im większa liczba, tym mniej hałaśliwe oszacowanie, ale tym niższa rozdzielczość, a artefakty obrotowe są bardziej wyraźne.
    3. Zaznacz pole wyboru "Użyj CTF". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
  2. Użyj mapy zmienności 3D, aby utworzyć maskę ostrości dla poniższego kroku klastrowania 3D.
    1. Wybierz przycisk "Binarna maska 3D". Ustaw "Głośność wejściową", wybierając mapę zmienności 3D (utworzoną w kroku 8.1). Określ ścieżkę do pliku dla opcji "Maska wyjściowa".
    2. Ustaw "Próg binaryzacji", korzystając z danych wyjściowych pola "Poziom" w "Przeglądarce głośności" Chimery. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie".
  3. Sortuj obrazy cząstek w jednorodne grupy strukturalne, skupiając się na strukturalnie bardzo zmiennych obszarach.
    1. Naciśnij przycisk "Klastrowanie 3D - RSORT3D". Ustaw "Wejściowy katalog zagęszczenia 3D", wybierając katalog wyjściowy zagęszczenia 3D (utworzony w kroku 7.1). Określ ścieżkę do "Katalogu wyjściowego".
    2. Ustaw "Maskę 3D", wybierając maskę 3D o miękkich krawędziach (utworzoną w kroku 7.2). Ustaw "Maskę ostrości 3D", wybierając binaryzowaną mapę zmienności 3D (utworzoną w kroku 8.2).
    3. W przypadku dużych zestawów danych użyj co najmniej 5 000–10 000 dla "obrazów na grupę". Należy pamiętać, że program zawsze utrzymuje liczbę obrazów w grupie na poziomie niższym niż to ustawienie. Dostosuj wartość, biorąc pod uwagę oczekiwaną liczbę grup 3D (całkowita liczba cząstek podzielona przez wartość "Obrazy na grupę"), zestaw danych, SNR i stopień niejednorodności. Zacznij od ~5-10 początkowych grup 3D, jeśli dostępna jest wystarczająca liczba cząstek, chyba że spodziewana jest większa liczba odrębnych stanów strukturalnych w zbiorze danych.
    4. Użyj co najmniej 3 000-5 000 cząstek dla "Najmniejszej wielkości grupy". Zauważ, że program zignoruje grupy składające się z mniejszej liczby obrazów niż ustawienie "Najmniejszy rozmiar grupy". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wykonać klastrowanie 3D.
      UWAGA: RSORT3D jest podzielony na dwa etapy. Pierwszy krok "sort3d" porządkuje niejednorodność 3D. Następnie rekonstruuje objętości każdej jednorodnej grupy strukturalnej przy użyciu parametrów wyrównania 3D określonych przez powyższy krok udoskonalania 3D. Drugi krok "rsort3d" wyszukuje powtarzalne elementy każdej grupy, przeprowadzając dwukierunkowe porównanie dwóch niezależnych przebiegów sortowania. Następnie rekonstruuje jednorodne struktury, używając tylko tych cząstek, które są odtwarzalnie przypisane. Na klastrze z 96 rdzeniami ta praca (~8 000 cząstek, rozmiar pudełka 352) zakończyła się po około 3 godzinach.
  4. Po zakończeniu programu użyj Chimery, aby wybrać jednorodną grupę 3D. Wybierz strukturę o najwyższej rozdzielczości pozornej, zwykle skojarzoną z najbardziej zaludnioną grupą. Upewnij się, że wybrana struktura jest wizualnie rozsądna, biorąc pod uwagę średnie klas 2D i biologiczne aspekty interesującego białka (patrz Dyskusja). Jeśli istnieją inne woluminy, które mają prawie identyczną strukturę przy podobnej rozdzielczości, należy je uznać za wyłaniające się z jednej jednorodnej grupy 3D.
  5. Wykonaj lokalne zagęszczenie względem elementów cząstkowych z najbardziej jednorodnej grupy 3D (o najwyższej rozdzielczości).
    1. Kliknij przycisk "Lokalne uściślenie podzbioru". Ustaw "Ścieżkę do pliku tekstowego podzbioru", wybierając plik tekstowy zawierający identyfikatory cząstek wybranej grupy (np. Cluster0.txt utworzone w kroku 8.3). Ustaw "Katalog zagęszczenia 3D", wybierając katalog wyjściowy poprzedniego udoskonalenia 3D (utworzonego w kroku 7.1).
    2. Ustaw opcję "Ponowne uruchamianie iteracji" na tę, w której osiągnięto najwyższą rozdzielczość w poprzednim udoskonaleniu 3D. Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby wykonać lokalne udoskonalenie wybranej populacji cząstek.
  6. Podobnie jak w kroku 7.2, utwórz maskę 3D o miękkich krawędziach z niefiltrowanej końcowej połowy objętości zrekonstruowanej przez lokalne udoskonalenie podzbioru.
  7. Podobnie jak w kroku 7.3, scal dwie niefiltrowane końcowe połówki woluminów uzyskane przez lokalne uściślenie podzbioru i wyostrz scalony wolumin. Jednak tym razem nie filtruj zaostrzonej głośności.
    UWAGA: Jeśli analiza heterogeniczności w kroku 8.4 wskazuje na kilka odrębnych stanów o porównywalnej rozdzielczości, można chcieć udoskonalić wszystkie różne stany niezależnie.

9. LOCALRES: Oszacuj lokalną rozdzielczość końcowej objętości 3D

  1. Oszacuj lokalną rozdzielczość objętości 3D uzyskaną z jednorodnego zestawu cząstek.
    1. Kliknij ikonę "LOCALRES", a następnie przycisk "Rozdzielczość lokalna". Ustaw "Pierwsza połowa tomu" i "Druga połowa objętości", wybierając niefiltrowane końcowe połowy tomu lokalnego uściślenia podzbioru (utworzonego w kroku 8.5). Ustaw "Maskę 3D", wybierając maskę 3D o miękkich krawędziach utworzoną w kroku 8.6. Określ ścieżkę pliku dla "Woluminu wyjściowego".
    2. Zachowaj domyślną wartość 7 pikseli dla "rozmiaru okna FSC". Pamiętaj, że to ustawienie definiuje rozmiar okna, w którym obliczana jest korelacja lokalna-przestrzeń rzeczywista; Większe rozmiary okien zapewniają płynniejsze mapy rozdzielczości kosztem lokalnej rozwiązywalności.
    3. Zachowaj domyślną wartość 0,5 wartości "Odcięcie rozdzielczości" dla kryterium rozdzielczości.
      UWAGA: Dla każdego woksela program poinformuje lokalną rozdzielczość jako częstotliwość, przy której lokalny FSC spada poniżej wybranego progu rozdzielczości. Próg niższy niż 0,5 nie jest zalecany, ponieważ niższe wartości korelacji wiążą się z dużą niepewnością statystyczną. W związku z tym odpowiednia rozdzielczość lokalna będzie się znacznie różnić między wokselami.
    4. W polu "Rozdzielczość ogólna" ustaw rozdzielczość bezwzględną szacowaną w wyostrzaniu po lokalnym zawężeniu podzbioru (krok 8.7). Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby obliczyć lokalną rozdzielczość woluminu.
  2. Zastosuj filtr lokalny 3D do objętości wyostrzonej po lokalnym zawężeniu podzbioru przy użyciu mapy rozdzielczości lokalnej 3D.
    1. Kliknij przycisk "Filtr lokalny 3D". Ustaw "Głośność wejściową", wybierając wyostrzoną, ale niefiltrowaną wolumin 3D (utworzony w kroku 8.7). Podobnie ustaw "Plik rozdzielczości lokalnej" i "Maskę 3D" (utworzone odpowiednio w kroku 9.1 i 8.6). Pamiętaj, że maska 3D definiuje region, w którym zostanie zastosowane filtrowanie lokalne. Określ ścieżkę pliku dla "Woluminu wyjściowego". Naciśnij przycisk "Uruchom polecenie", aby zastosować lokalny filtr 3D.
  3. Użyj Chimery, aby wizualnie sprawdzić ostateczny model 3D i mapę 3D o lokalnej rozdzielczości (utworzone odpowiednio w kroku 9, 2 i 9.1). Wybierz opcję "Kolor powierzchni", aby pokolorować objętość 3D zgodnie z rozdzielczością lokalną. Pamiętaj, że dystrybucja lokalnych rezolucji powinna być płynna (patrz Dyskusja).

Wyniki

Opisany powyżej protokół został wykonany w oparciu o 112 filmów z detektora bezpośredniego komponentu A kompleksu Tc Photorhabdus luminescens (TcdA1) 20,21,22. Zbiór danych ten został zarejestrowany za pomocą kriomikroskopu elektronowego z korekcją aberracji sferycznej (Cs) i wysokojasnym działkiem emisyjnym pola (XFEG), pracującego przy napięciu przyspieszającym 300 kV. Obrazy pozyskano automatycznie przy całkowitej dawce 60 e-/Å-2 i rozmiarze piksela 1,14 Å w skali preparatu. Po wyrównaniu klatek filmu (Krok protokołu 2), otrzymane średnie po korekcji ruchu wykazały izotropowe pierścienie Thona rozciągające się do wysokich rozdzielczości (Rycina 2a). Poszczególne cząsteczki były łatwo widoczne i dobrze odseparowane (Rycina 2b). Następnie cząsteczki wybrano za pomocą narzędzia swarm programu e2boxer 18 (Krok protokołu 4.1). W tym przypadku odpowiedni próg ustawiono, korzystając z opcji bardziej selektywnej (Rycina 2c). 112 cyfrowych mikrografii pozwoliło na uzyskanie 9 652 cząsteczek. Większość wyekstrahowanych obrazów (Krok protokołu 4.2) zawierała wyraźnie zdefiniowane cząsteczki, a rozmiar ramki był około 1,5 raza większy od rozmiaru cząsteczki, zgodnie z zaleceniami (Rycina 2d). Następnie, przy użyciu ISAC, przeprowadzono analizę heterogeniczności 2D (Krok protokołu 5). Przyniosło to 98 średnich klas (Rycina 3a). Wykorzystując te średnie klasy 2D, obliczono model ab initio za pomocą VIPER (Krok protokołu 6) przy rozdzielczości pośredniej (Rycina 3b). Model ten wykazuje doskonałą zgodność ze strukturą krystaliczną TcdA1, rozwiązaną wcześniej przy rozdzielczości 3,9 Å 22 (Rycina 3c). Model ab initio ten posłużył jako szablon początkowy do rafinacji 3D (MERIDIEN), co pozwoliło na uzyskanie rekonstrukcji o rozdzielczości 3,5 Å (kryterium 0,143) (Krok protokołu 7) z zaledwie ~40 000 jednostek asymetrycznych (Rycina 4). Mapę o rozdzielczości zbliżonej do atomowej uzyskano w ciągu 24 h, wykorzystując do 96 procesorów CPU w krokach procesu, które korzystają z wielordzeniowości.

W przypadku analizy zmienności 3D (Krok protokołu 8), w kroku 8.3.3 wykorzystano jedynie 2000 obrazów cząstek na grupę (t.j. proces rozpoczyna się od 5 początkowych grup 3D) oraz 200 obrazów dla najmniejszego rozmiaru grupy w kroku 8.3.4 ze względu na niewielką liczbę cząstek (~10 000). Analiza wykazała lokalną elastyczność głównie w regionie N-końcowym kompleksu, który zawiera znacznik His używany do oczyszczania (Rycina 5a). Rzeczywiście, dwanaście reszt N-końcowych oraz znacznik His nie zostały rozdzielone w opublikowanej wcześniej strukturze krystalicznej TcdA1 22 i ten prawdopodobnie nieuporządkowany region pozostał nierozdzielony w obecnej gęstości cryo-EM, prawdopodobnie ze względu na jego elastyczność. Dodatkową zmienność wykryto w domenach wiążących receptor oraz w domenie wiążącej BC (Rycina 5a). Ze względu na ogólnie satysfakcjonującą rozdzielczość struktury i dość niewielki rozmiar zbioru danych, uznano tę heterogeniczność za dopuszczalną, w związku z czym nie przeprowadzono ukierunkowanej klasyfikacji 3D 23. Na koniec obliczono lokalną rozdzielczość końcowej mapy gęstości (Krok protokołu 9.1, Rycina 5b), a wyostrzona mapa 3D została poddana lokalnemu filtrowaniu (Krok protokołu 9.2)). Wolumen o takiej jakości może być wykorzystany de novo do budowania modelu przy użyciu programu Coot 24 lub dowolnego innego narzędzia do rafinacji (Rycina 6).

Schemat przepływu pracy SPHIRE; etapy przetwarzania obrazów: wyrównanie, estymacja CTF, ekstrakcja cząstek.
Rysunek 1: Przetwarzanie obrazów za pomocą SPHIRE. (a) Interfejs graficzny (GUI) pakietu oprogramowania SPHIRE. Konkretny etap przepływu pracy można aktywować, wybierając odpowiedni piktogram po lewej stronie GUI („etap przepływu pracy”). Polecenia i narzędzia powiązane z tym etapem przepływu pracy pojawią się w centralnej części GUI. Po wybraniu jednego z poleceń, odpowiednie parametry są wyświetlane w prawej części GUI. Parametry zaawansowane zazwyczaj nie wymagają modyfikacji domyślnych wartości. (b) Etapy w przepływie pracy przetwarzania obrazów pojedynczych cząstek przy użyciu GUI SPHIRE. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces obrazowania Cryo-EM; transformata Fouriera, selekcja cząsteczek, średnie klasy 2D dla analizy struktury.
Rysunek 2: Korekcja ruchu i ekstrakcja cząsteczek. (a, b) Typowy wysokiej jakości, niskodawkowy, skorygowany pod kątem dryfu mikrograf cyfrowy zarejestrowany przy defokusie 1,7 µm. Zwróć uwagę na izotropowe pierścienie Thona sięgające rozdzielczości 2,7 Å w widmie mocy (a) oraz wyraźnie widoczne cząsteczki na obrazie 2D (b). (c) Selekcja cząsteczek przy użyciu e2boxer. Zielone okręgi wskazują wybrane cząsteczki. (d) Typowe surowe cząsteczki wyekstrahowane z mikrografu z ważeniem dawką. Paski skali = 20 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza Cryo-EM; rekonstrukcja struktury 3D; wizualizacja kompleksu białkowego; mikroskopia elektronowa.
Rycina 3: Grupowanie 2D i generowanie modelu początkowego. (a) Galeria średnich klas 2D, w której większość przedstawia widoki boczne cząsteczki. Pasek skali = 20 nm. (b) Mapa 3D ab initio TcdA1 otrzymana za pomocą RVIPER z bezreferencyjnych średnich klas. (c) Dopasowanie sztywnego ciała struktury krystalicznej TcdA1 (wstążki) (pdb-id 1VW1) do początkowej gęstości cryo-EM (przezroczysty szary). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza struktury Cryo-EM, kompleksy białkowe, trójwymiarowa mapa gęstości, konfiguracja molekularna, biologia strukturalna.
Rysunek 4: Trójwymiarowa struktura Cryo-EM TcdA1. (a, b) Końcowa mapa gęstości TcdA1 o rozdzielczości 3.5 Å, obliczona na podstawie ok. 9 500 obrazów cząstek: (a) widok z boku oraz (b) widok z góry. (c) Reprezentatywne obszary gęstości cryo-EM dla helisy α i harmonijki β. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza struktury białka, domeny wiążące receptor, schemat strukturalny, wizualizacja molekularna.
Rysunek 5: Analiza zmienności i rozdzielczość lokalna. (a) Powierzchnia wyostrzonej mapy cryo-EM TcdA1 (szara) oraz mapa zmienności (zielona). Dla lepszej przejrzystości mapa zmienności została poddana filtrowaniu dolnoprzepustowemu do 30 Å. (b) Rendering powierzchni wyostrzonej mapy cryo-EM TcdA1 pokolorowanej zgodnie z rozdzielczością lokalną (Å). Zwróć uwagę na zgodność topologiczną między obszarami wysokiej zmienności a niską rozdzielczością lokalną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wizualizacja struktury białka; schemat modelu szkieletowego; interfejs oprogramowania do modelowania molekularnego.
Rysunek 6: Budowa modelu 3D TcdA1 przy użyciu programu Coot. Przedstawiono reprezentatywne regiony gęstości cryo-EM oraz model atomowy dla helisy α. Model atomowy zbudowano de novo przy użyciu programu Coot. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Pojedynczy cząstek cryo-EM wykazał szybki rozwój w ostatnich latach i dostarczył licznych struktur rozdzielczych kompleksów makromolekularnych o dużym znaczeniu biologicznym25. Aby wesprzeć dużą liczbę początkujących użytkowników, którzy obecnie wkraczają w tę dziedzinę, opracowaliśmy platformę do analizy obrazu pojedynczych cząstek SPHIRE i przedstawiamy tutaj protokół instruktażowy dla całego przepływu pracy, w tym wyrównywania filmów, wybierania cząstek, szacowania CTF, wstępnych obliczeń modelu, analizy niejednorodności 2D i 3D, udoskonalania 3D w wysokiej rozdzielczości oraz szacowania i filtrowania rozdzielczości lokalnej.

Opisany tutaj protokół ma służyć jako krótki przewodnik po określaniu struktury 3D przy użyciu mikrofotografii krio-EM białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz przy pomocy narzędzi obliczeniowych dostarczanych przez samodzielny graficzny interfejs użytkownika SPHIRE.

Główną cechą przepływu pracy jest to, że większość procedur musi być uruchomiona tylko raz, ponieważ opierają się one na koncepcji walidacji przez odtwarzalność19 i nie wymagają dostosowywania parametrów. Ten automatyczny mechanizm walidacji jest główną zaletą SPHIRE w porównaniu z innymi pakietami oprogramowania, ponieważ wyniki są zwykle obiektywne, powtarzalne i, co najważniejsze, możliwe do uzyskania przy akceptowalnych kosztach obliczeniowych. Pipeline zapewnia ponadto bogactwo informacji diagnostycznych dla doświadczonych użytkowników w celu przeprowadzenia dalszej niezależnej walidacji i oceny przy użyciu własnych metod. Niemniej jednak początkujący użytkownik, który ma co najmniej elementarne przygotowanie teoretyczne w zakresie biologii strukturalnej i mikroskopii elektronowej, powinien być w stanie uzyskać struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej przy użyciu własnych danych i zautomatyzowanych procedur walidacji.

Jednak uzyskanie struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej nie zawsze jest proste, a wynik będzie w dużym stopniu zależał od jakości próbki i danych wejściowych. Dla przedstawionych tutaj procedur zakłada się, że dostępna jest wystarczająca liczba wysokiej jakości niewyrównanych surowych filmów EM, których średnie pokazują wyraźnie dostrzegalne jednorodne i losowo zorientowane pojedyncze cząstki. Ogólnie rzecz biorąc, nie ma ograniczeń dotyczących symetrii, wielkości lub ogólnego kształtu cząsteczki, ale niska masa cząsteczkowa może być czynnikiem ograniczającym, zwłaszcza gdy białko ma pozbawiony cech kształt kulisty. Zazwyczaj analiza większych, dobrze uporządkowanych cząstek o wysokiej symetrii punktowo-grupowej jest mniej wymagająca. Dlatego zdecydowanie zaleca się, aby początkujący użytkownicy najpierw uruchomili obecny protokół z dobrze scharakteryzowanym zestawem danych cryo-EM. Dobrym punktem wyjścia są dane z samouczka SPHIRE (http:/sphire.mpg.de) lub jeden z zestawów danych (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) przesłanych przez EMPIAR z surowymi filmami.

Podczas przetwarzania własnych danych istnieje duże prawdopodobieństwo, że niektóre zbiory danych lub niektóre obrazy nie będą spełniać określonych kryteriów jakościowych. W tym kontekście, oprócz automatycznych kontroli stabilności i odtwarzalności, wykonywanych przez program dla głównych etapów przepływu pracy, nadal zaleca się, aby użytkownicy wizualnie sprawdzali wyniki w określonych "punktach kontrolnych" protokołu, zwłaszcza jeśli ostateczna rekonstrukcja nie jest zadowalająca.

Pierwszą kontrolę wzrokową można przeprowadzić na poziomie mikrofotografii po wyrównaniu filmu (krok 2 protokołu) i oszacowaniu CTF (krok 3 protokołu). Otrzymane średnie skorygowane o ruch powinny pokazywać wyraźnie dostrzegalne i dobrze oddzielone pojedyncze cząstki, a ich widma mocy powinny pokazywać wyraźnie dostrzegalne, izotropowe pierścienie Thon. Częstotliwość przestrzenna, do której są one widoczne, określa w większości przypadków najwyższą rozdzielczość, do której w zasadzie można ostatecznie określić konstrukcję. Przykłady średniej skorygowanej ruchem o wystarczającej jakości i jej spektrum mocy przedstawiono w sekcji "Reprezentatywne wyniki". Obrazy odstające, które mogą mieć negatywny wpływ na wynik końcowy, można usunąć za pomocą narzędzi GUI do oceny dryfu i CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).

Jeśli chodzi o badania przesiewowe cząstek, kluczowym krokiem w procesie projektowania SPHIRE jest klasyfikacja 2D przy użyciu ISAC (Protocol step 5.2). W tym przypadku użytkownik powinien kontrolować, czy powtarzalne średnie klas 2D identyfikowane automatycznie przez program przyjmują zakres orientacji wystarczający do prawie równomiernego pokrycia przestrzeni kątowej. Jeśli jakość średnich klas nie jest zadowalająca (zaszumione i/lub rozmyte obrazy) i/lub liczba powtarzalnych średnich klas jest bardzo niska, należy rozważyć poprawę jakości automatycznego wybierania, optymalizację obrazowania zestawu danych lub przygotowanie próbki. W większości przypadków nie jest możliwe obliczenie wiarygodnej rekonstrukcji na podstawie zestawu danych, który nie daje dobrych średnich klas 2D. Przykłady wysokiej jakości średnich klas 2D znajdują się w sekcji "Reprezentatywne wyniki".

Do uzyskania wiarygodnego początkowego modelu 3D przy użyciu RVIPER w sposób zautomatyzowany wymaganych jest co najmniej 100 średnich klas (krok 6.1 protokołu). Na tym etapie użytkownik powinien wybrać średnie o najwyższej jakości i uwzględnić jak najwięcej różnych orientacji cząstki. Jakość początkowego modelu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia późniejszego udoskonalenia 3D w wysokiej rozdzielczości.

W innych pakietach oprogramowania klasyfikacja 3D jest czasami wykonywana w celu usunięcia "złych" cząstek 8,9. Jednak w SPHIRE większość tych cząstek jest automatycznie eliminowana już podczas klasyfikacji 2D za pomocą ISAC. W związku z tym zaleca się wykonywanie intensywnego obliczeniowo etapu sortowania 3D tylko wtedy, gdy rekonstrukcja i analiza zmienności 3D wskazują na niejednorodność zbioru danych.

Co najważniejsze, użytkownik powinien zawsze dokładnie sprawdzić wynikowe objętości 3D (krok 9.3 protokołu) i upewnić się, że cechy danej gęstości dobrze zgadzają się z rozdzielczością nominalną. Przy rozdzielczości <9 A widoczne stają się gęstości przypominające pręciki odpowiadające α-helisom. Przy rozdzielczości <4,5 A gęstości odpowiadające pasmom w arkuszach β są zwykle dobrze oddzielone i widoczne stają się duże aminokwasy. Mapa o wysokiej rozdzielczości (<3 A) powinna pokazywać wyraźnie dostrzegalne łańcuchy boczne, co pozwoli na zbudowanie dokładnego modelu atomowego.

Uzyskane do tej pory wyniki pokazują, że dzięki zautomatyzowanym testom odtwarzalności SPHIRE i minimalnym kontrolom wizualnym, niniejszy protokół ma ogólne zastosowanie do każdego rodzaju projektu krio-EM z pojedynczymi cząstkami. Reprezentatywne wyniki każdego etapu przetwarzania przedstawiono dla rekonstrukcji toksyny TcdA1 Photorhabdus luminescens 21, która została rozwiązana do rozdzielczości bliskiej atomowi. Mapy gęstości o podobnej jakości mogą być wykorzystywane do konstruowania wiarygodnych modeli atomowych poprzez śledzenie szkieletowe de novo , a także udoskonalanie w przestrzeni odwrotnej lub rzeczywistej, a tym samym zapewniają solidną strukturę strukturalną dla zrozumienia złożonych mechanizmów molekularnych.

KODY AKCEZYJNE:

Współrzędne struktury EM i nieprzetworzonych filmów zostały zdeponowane w Banku Danych Mikroskopii Elektronowej i Archiwum Obrazów Pilotażowych Mikroskopii Elektronowej pod numerami dostępu odpowiednio EMD-3645 i EMPIAR-10089.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy D. Rodererowi za dostarczenie nam mikrofotografii TcdA1. Dziękujemy Steve'owi Ludtke za jego nieustanne wsparcie dla infrastruktury EMAN2. Prace te były wspierane przez fundusze Towarzystwa Maxa Plancka (dla S.R.) i Rady Europejskiej w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) (grant nr 615984) (dla S.R.) oraz grant z National Institutes of Health R01 GM60635 dla P.A.P.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instytut Fizjologii Molekularnej SPHIRE Max Planck - Dortmund  oraz Houston Medical School, Houston, Teksas http://sphire.mpg.de
UCSF Uniwersytet Kalifornijski Chimera, San Franciscohttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
UnblurJanelia Farm Research Campus, Ashburnhttp://grigoriefflab.janelia.org/unblur
CootMRC Laboratory of Molecular Biology,  http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2Baylor College of Medicine, Houstonhttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Klaster obliczeniowy z 1824 rdzeniamiMax Planck Institute of Molecular PhysiologyLinux Cluster z 76  węzłami, każdy z 2 procesorami Xeon E5-2670v3 12C 2,30 GHz i 128 Gb RAM
TITAN KRIOS mikroskop elektronowy FEI300 kV, poprawka Cs, XFEG
Falcon II bezpośredni detektor elektronówFEI
EPU (oprogramowanie do automatycznej akwizycji danych)FEIhttps://www.fei.com/software/epu/
Cambridge

Bibliografia

  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , Oxford University Press. (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Oprogramowanie SPHIREudoskonalanie 3Destymacja CTFwybieranie cząstekklasteryzacja 2D ISACmodel początkowy VIPERudoskonalenie MERIDIENanaliza rozdzielczości lokalnej
Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.