Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

DOI:

10.3791/55461

⸱

15 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy generowanie ludzkiej tkanki serca z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących z kardiomiocytów. Przedstawiono metodę analizy siły skurczu oraz przykładową zmianę wzorca skurczu przez inhibitor kanału hERG E-4031. Metoda ta wykazuje wysoki poziom odporności i przydatności do badań przesiewowych leków sercowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkanek serca opisuje techniki tworzenia trójwymiarowych tkanek generujących siłę. Dla wdrożenia tych procedur w badaniach podstawowych i przedklinicznym opracowywaniu leków ważne jest opracowanie protokołów automatycznego generowania i analizy w znormalizowanych warunkach. W tym miejscu przedstawiamy technikę generowania zmodyfikowanej tkanki serca (EHT) z kardiomiocytów różnych gatunków (szczur, mysz, człowiek). Technika ta polega na złożeniu fibryny-żelu zawierającego zdysocjowane kardiomiocyty między elastycznymi słupkami polidimetylosiloksanu (PDMS) w formacie 24-dołkowym. Trójwymiarowe, generujące siłę EHT powstają w ciągu dwóch tygodni po odlewaniu. Procedura ta pozwala na wytwarzanie kilkuset EHT tygodniowo i jest technicznie ograniczona jedynie dostępnością kardiomiocytów (0,4-1,0 x 106/EHT). Ocena skurczów mięśni auksotonicznych odbywa się w zmodyfikowanej komorze inkubacyjnej z blokadą mechaniczną dla płytek 24-dołkowych i kamerą umieszczoną na górze tej komory. Oprogramowanie steruje kamerą przemieszczoną w układzie osi XYZ do każdego EHT. Skurcze EHT są wykrywane przez algorytm automatycznego rozpoznawania figur, a siła jest obliczana na podstawie skrócenia EHT oraz skłonności do sprężystości i geometrii słupków PDMS. Procedura ta pozwala na automatyczną analizę dużej liczby EHT w znormalizowanych i sterylnych warunkach. Wiarygodne wykrywanie wpływu leku na skurcz kardiomiocytów ma kluczowe znaczenie dla opracowywania leków sercowych i farmakologii bezpieczeństwa. Pokazujemy, na przykładzie inhibitora kanału hERG E-4031, że ludzki układ EHT replikuje odpowiedzi leków na kinetykę skurczu ludzkiego serca, co wskazuje, że jest to obiecujące narzędzie do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skutki uboczne związane z sercem, takie jak zespół wydłużonego odstępu QT wywołany przez leki, doprowadziły do wycofania produktów z rynku w ciągu ostatnich lat. Statystyki wskazują, że około 45% wszystkich wypłat jest spowodowanych niepożądanym wpływem na układ sercowo-naczyniowy1. Niepowodzenie leku po kosztownym procesie rozwoju i zatwierdzenia jest najgorszym scenariuszem dla firm farmaceutycznych. Działy badawczo-rozwojowe koncentrują się zatem na wczesnym wykrywaniu takich niepożądanych skutków sercowo-naczyniowych. Ze względów ekonomicznych i etycznych trwają wysiłki na rzecz ograniczenia doświadczeń na zwierzętach i zastąpienia ich nowymi testami przesiewowymi in vitro.

Zestaw uznanych testów znajduje się w wytycznych Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejskiej Agencji Leków (EMA) dotyczących przedklinicznej oceny efektów leków proarytmicznych2. Technologia przeprogramowania komórek somatycznych, a następnie różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) przyczyniła się do rozwoju tej dziedziny badań3. Obecnie oferuje możliwość badań przesiewowych nowych kandydatów na leki na ludzkich kardiomiocytach in vitro i pozwala uniknąć problemów z różnicami międzygatunkowymi. Najnowsze protokoły różnicowania serca4,5 zapewniają nieograniczoną podaż kardiomiocytów bez obaw etycznych. Jednak pomiar siły skurczu, najważniejszego i najlepiej scharakteryzowanego parametru kardiomiocytów in vivo, nie jest dobrze ustalony. Jest to związane ze względną niedojrzałością6 ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) w porównaniu z dorosłymi kardiomiocytami. Możliwym postępem jest inżynieria trójwymiarowej tkanki serca z pojedynczych komórek7 (engineered heart tissue, EHT). Protokół EHT opiera się na osadzaniu pojedynczych mysich lub ludzkich kardiomiocytów8,9,10 w hydrożelu fibrynowym między dwoma elastycznymi postami z polidimetylosiloksanu (PDMS)11 w formacie 24-dołkowym. W ciągu kilku dni kardiomiocyty zaczynają samoistnie kurczyć się jako pojedyncze komórki i zaczynają tworzyć sieci komórkowe. Po 7-10 dniach widoczne są makroskopowe skurcze całej tkanki. Podczas tego procesu macierz zewnątrzkomórkowa ulega przebudowie, co prowadzi do zmniejszenia średnicy i długości. Skrócenie EHT powoduje wygięcie słupka PDMS nawet podczas spoczynku, poddając kardiomiocyty w rozwijającym się EHT ciągłemu obciążeniu. EHT kontynuują auksotoniczne skurcze mięśni przez kilka tygodni. Ludzkie EHT wykazują reakcje na stymulację fizjologiczną i farmakologiczną, co wskazuje na ich przydatność do badań przesiewowych leków i modelowania chorób7.

W tym manuskrypcie prezentujemy solidny i łatwy protokół do generowania ludzkiego EHT oraz automatyczną analizę kurczliwości zależnych od stężenia zmian wzorca skurczu w obecności inhibitorów kanału hERG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Poniższe kroki opisują protokół hodowli komórkowej. Proszę wykonywać w sterylnych warunkach i używać wstępnie podgrzanych mediów.

1. Różnicowanie serca hiPSC

  1. Pielęgnuj hiPSC
    1. Pokryć płytki 6-dołkowe (1 ml/studzienkę) lub kolby T75 (7 ml/kolbę) matrycą błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (np. geltrex, 1:200; patrz tabela materiałów) rozcieńczoną w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM) firmy Dulbecco przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przygotować pożywkę FTDA12, mieszając zasadową pożywkę DMEM/F-12 z 2 mM L-glutaminą, 0,5% penicylina/streptomycyna, 5 mg/l transferyny, 5 μg/l selenu, 0,1% albumina surowicy ludzkiej, 1x mieszanina lipidów, 5 mg/l insuliny, 50 nM dorsomorfina, 2,5 ng/ml aktywina A, 0,5 ng/ml ludzkiego TGFß1 i 30 ng/ml FGF2.
    2. Nasiona hiPSC (~3 x 105/ 10 cm²) w pożywce FTDA i kultura w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 21% O2 z dzienną zmianą pożywki (Rysunek 1A). Przy 80% konfluencji pasaż (1:2-1:6) z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA; 0,5 mM; czas inkubacji ~4 min).
  2. Tworzenie ciał zarodkowych (EB)
    1. Uprawiać hiPSC w kolbach T75 do wysokiej gęstości.
      1. Przemyć kolby ze zbiegającymi się komórkami dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem bez wapnia i magnezu (PBS) i inkubować w 0,5 mM EDTA przez ~10 min. Upewnij się, że komórki nie odczepiają się od dna kolby.
      2. Usunąć EDTA szklaną pipetą, przepłukać komórki 10 ml PBS, postukać kolbami w stół, aby odłączyć komórki.
        UWAGA: W razie potrzeby użyj skrobaka do komórek.
      3. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, dodać 1/4 objętości (np. 10 ml RMPI do 40 ml zawiesiny komórek) pożywkę RPMI 1640 (lub inną standardową pożywkę zawierającą 1,8 mM wapnia) i wirować przy 250 x g przez 5 min.
    2. Zawiesić osad komórkowy w pożywce FTDA uzupełnionej 4 mg/ml alkoholu poliwinylowego (PVA) i 10 μM Y27632 i policzyć komórki w komorze Neubauera.
    3. Napełnić kolbę przędzalniczą zawiesiną komórek (30 x 106 komórek/100 ml pożywki FTDA uzupełnionej PVA i Y-27632; patrz krok 1.2.2) i zainicjować tworzenie EB w kolbach wirujących (dostosować prędkość wirnika mieszadła magnetycznego do 40 obr./min) w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 5% O2) przez noc.
  3. Różnicowanie mezodermalne
    1. Podczas tworzenia EB kolby do hodowli komórek płaszcza odpowiednie do hodowli zawiesinowej z niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym (14 ml/T175) przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego ranka dwukrotnie przemyć kolby pokryte środkiem powierzchniowo czynnym PBS (30 ml/T175). Ponownie dodaj PBS i trzymaj w inkubatorze do czasu, aż będzie potrzebny.
    3. Wyjąć kolbę obrotową z inkubatora.
      UWAGA: Zawiesina komórek powinna być przezroczysta z małymi makroskopowo widocznymi EB (ryc. 1B).
    4. Przenieść 50 ml zawiesiny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i pozostawić EB na 5-20 minut.
    5. Usunąć supernatant i przemyć osad 7 ml RPMI 1640 uzupełnionym 2% PVA i 10 μM Y-27632. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki z podziałką 15 ml i oszacować objętość EB (~50-100 μL).
    6. Przenieść zawartość kolb przędzalniczych do niepowlekanych kolb T175 i pozostawić je na stojaku w kształcie litery V do sedymentacji na okres do 20 minut. Usunąć supernatant i umyć ciała zarodków, jak podano powyżej. Nie napełniaj kolby T175 więcej niż 200 ml, ponieważ sedymentacja zajęłaby zbyt dużo czasu. Jeżeli początkowa objętość kolby przędzalniczej przekracza 200 ml, zawiesinę EB podzielić na kilka kolb T175 i ponownie połączyć EB po umyciu.
    7. Usunąć pożywkę myjącą i ponownie zawiesić w pożywce do różnicowania mezodermalnego, czyli RPMI uzupełnionym 4 mg/ml PVA, 0,5% penicyliny/streptomycyny, 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 0,05% albuminy surowicy ludzkiej, 5 μg/ml transferyny, 5 ng/ml seleninu sodu, 0,1% mieszaniny lipidów, 250 μM fosfo-askorbinianu, 10 μM Y-27632, 10 ng/ml białka morfogennego kości-4 (BMP-4) i 3 ng/ml aktywiny A, 5 ng/ml stabilnego FGF2.
    8. Usunąć PBS z kolb T175 pokrytych środkiem powierzchniowo czynnym i napełnić zawiesiną komórek (200 μl EB w 40 ml). Używaj mniejszych kolb, aby uzyskać mniejszą objętość EB.
    9. Uprawiać EB w zawiesinie przez trzy dni (37 °C, 5% CO2, 5% O2). Wymieniaj 50% pożywki (taki sam skład jak w kroku 1.3.7) każdego dnia (użyj stojaka sedymentacyjnego w kształcie litery V). Codziennie przed karmieniem przygotuj świeże podłoże.
  4. Różnicowanie serca
    1. Dzień wcześniej przygotować nowe naczynia pokryte środkiem powierzchniowo czynnym i obchodzić się z nimi w sposób opisany powyżej (1.3.2).
    2. Po trzech dniach indukcji mezodermalnej pozwól EB osiąść na maksymalnie 5 minut na stojaku sedymentacyjnym. Usuń większość pożywki i przemyj RPMI 1640 uzupełnionym 0,5% penicyliny/streptomycyny i 10 mM HEPES.
    3. Przenieść 10 ml zawiesiny EB do probówki z podziałką 15 ml i oszacować objętość EB po sedymentacji.
    4. Ostrożnie zawiesić EB w pożywce do różnicowania serca składającej się z RPMI 1640 uzupełnionego 0,5% penicyliny/streptomycyny, 10 mM HEPES, 0,05% albuminy surowicy ludzkiej, 5 μg/ml transferyny, 5 ng/ml seleninu sodu, 0,1% mieszanki lipidów, 250 μM fosfo-askorbinianu, 1 μM Y-27632, 100 nM Wnt-inhibitor DS-I-713.
    5. Przenieś EB do nowych kolb do hodowli komórkowych pokrytych środkiem powierzchniowo czynnym (~200 μL EB w 46 ml / T175).
    6. Inkubować przez trzy dni (37 °C, 5% CO2 , 21 % O2) z 50% zmianą podłoża (skład podłoża, patrz krok 1.4.4) drugiego i trzeciego dnia. Nie zmieniaj podłoża w ciągu pierwszych 48 godzin.
    7. Inkubować w pożywce składającej się z RPMI 1640 uzupełnionego 500 μM 1-tioglicerolem, 10 mM HEPES, 0,5% penicyliny/streptomycyny, 1 μM Y-27632, 2% suplementu do hodowli komórek nerwowych bez surowicy (np. B27) z insuliną, 100 nM inhibitora Wnt DS-I-7 z codzienną wymianą 50% pożywki przez następne cztery dni. EB powinny zacząć bić w tym okresie.
    8. Po tygodniu różnicowania serca zmień na tę samą pożywkę bez hamowania Wnt i z suplementem do hodowli komórek nerwowych bez surowicy. Zmieniaj 50% podłoża każdego dnia, z wyjątkiem pierwszego dnia.
  5. Dysocjacja ludzkich kardiomiocytów
    UWAGA: Po dwóch tygodniach protokołu różnicowania, EB powinny wykazywać spontaniczne skurcze (ryc. 1C). Jeśli tak, rozpocznij dysocjację i przygotuj roztwór kolagenazy.
    1. Przygotować roztwór kolagenazy, ważąc i rozpuszczając 200 U/ml w bezwapniowym zrównoważonym roztworze soli Hanksa bez wapnia/magnezu (HBSS) i dodać 1 mM HEPES, 10 μM Y-27632, 30 μM N-benzylo-p-toluenosulfonamidu (BTS). Wysterylizować przez filtrowanie (filtr 0,2 μm) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Rozmrażać podwielokrotności w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Umieść EB na stojaku sedymentacyjnym, odessaj pożywkę i zastąp 20-25 ml wstępnie podgrzanym HBSS. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
    3. Odessać HBSS i zastąpić go wstępnie podgrzanym roztworem kolagenazy (15 ml/T175). Inkubować przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 21 % O2 ).
    4. Przygotować bufor blokujący z DMEM uzupełnionym 1% penicyliną/streptomycyną i DNazą (12 μg/ml).
    5. Postukaj w kolby do hodowli komórkowych na stole, zdysocjowane EB powinny się rozpaść i rozpaść (jeśli nie, wydłuż czas inkubacji). Delikatnie rozetrzeć zawiesinę komórkową i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przemyć kolby buforem blokującym (15 ml/T175) i przenieść do probówki.
    6. Wirować przez 10 minut przy 100 x g. Ponownie zawiesić komórki w ciepłym DMEM, rozcierać i liczyć komórki.

2. Generacja zmodyfikowanej tkanki serca (EHT)

  1. Autoklawuj dostępne na rynku stojaki PDMS i przekładki z politetrafluoroetylenu (PTFE) (patrz arkusz kalkulacyjny Materiały i sprzęt; Rysunek 2) i przygotować następujące roztwory w sterylnych warunkach, na jeden dzień przed wytworzeniem EHT.
    1. Przygotować 2% agarozy przez zważenie i rozpuszczenie w odpowiedniej objętości PBS, w autoklawie, natychmiast przechowywać w temperaturze 60 °C.
    2. Przygotować aprotyninę (33 mg/ml) przez zważenie i rozpuszczenie w odpowiedniej objętości aqua ad iniectabilia, przefiltrować jałową (filtr 0,22 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować fibrynogen (200 mg/ml) rozpuszczając sterylny fibrynogen w odpowiedniej objętości jałowego 0,9% NaCl (letniego), podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Przygotować trombinę (100 j./ml) przez rozpuszczenie sterylnej trombiny w trzech częściach sterylnego PBS i 2 częściach aqua ad iniectabilia, porcjach po 3 μl w małych probówkach i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Przygotować 10x DMEM, rozpuszczając 670 mg 10x DMEM w proszku w 5 ml aqua ad iniectabilia, przefiltrować sterylnie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Przygotuj 2x DMEM, mieszając 2 ml 10x DMEM z 2 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 0,2 ml penicyliny/streptomycyny i 5,8 ml aqua ad iniectabilia, przefiltrować sterylnie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    7. Przygotować pożywkę odlewaną EHT (ECM), mieszając DMEM z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy (200 mM), przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować formy odlewnicze na płytkach 24-dołkowych, pipetując 1,6 ml ciepłej agarozy (2%, PBS) i umieszczając przekładkę PTFE (rysunek 2A) w studzienkach.
    UWAGA: Przekładkę należy umieścić natychmiast po pipetowaniu w maksymalnie 8 dołkach - agaroza bardzo szybko krzepnie. Nie pozostawiaj agarozy w temperaturze pokojowej na dłużej niż 5 minut.
  3. Po zestaleniu agarozy (~10 min, agaroza stanie się nieprzezroczysta) usuń przekładki PTFE (rysunek 2C) i umieść stojaki PDMS (rysunek 2B) w formach odlewniczych tak, aby pary słupków PDMS sięgały do każdej formy (rysunek 2D).
  4. Zawiesić kardiomiocyty w ECM o minimalnym stężeniu 15 x 106 komórek/ml.
  5. Przygotować 110% szacowanej objętości mieszanki do rozpuszczenia w okrągłodennej probówce o pojemności 15 ml na lodzie. W przypadku 24 EHT należy odpipetować mieszaninę do rozpuszczenia wymienioną w Tabeli 1 odpowiednio dla kardiomiocytów ludzkich, szczurzych lub mysich (w zestawie 10% więcej).
    UWAGA: Stężenie komórek w mieszaninie do rekonstytucji jest różne dla EHT u ludzi (10 x 106 komórek/ml), szczurów (4,1 x 106 komórek/ml) i myszy (6,8 x 106 komórek/ml). W zależności od stężenia zawiesiny komórkowej dodać dodatkowy ECM do końcowej objętości 2 640 μl. Fibrynogen musi być letni do pipetowania. Powoli napełniać końcówkę pipety i nie dotykać powierzchni zimnej mieszaniny do rozpuszczania pipetą zawierającą fibrynogen podczas dodawania fibrynogenu do mieszaniny do rekonstytucji - lepkość fibrynogenu w końcówce pipety natychmiast wzrośnie.
  6. Mieszaninę rozpuszczoną należy rozpuścić 10 - 15 razy pipetą serologiczną, aż do rozpuszczenia skrzepu fibrynogenu. Sprawdzić, czy mieszanina do rozpuszczenia w pipecie jest jednorodna.
  7. Dla każdego EHT odpipetować 100 μl roztworu rozpuszczonego w jednej podwielokrotności trombiny (3 μl w probówce 200 μl), wymieszać i odpipetować mieszaninę do szczelin agarozy tak szybko, jak to możliwe (ryc. 2E). Użyj nowej końcówki filtra dla każdego EHT. Zawiesić mieszaninę do rozpuszczania (rozcieranie pipetą serologiczną 5-10 razy) po każdych 8 EHT.
  8. Po wypełnieniu wszystkich szczelin mieszanką do rekonstytucji zamknąć pokrywę naczynia do hodowli komórkowych i inkubować w temperaturze 37 °C, 7% CO2 przez 2 godziny.
  9. Wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją pod sterylnym kapturem. Przykryć każdą studzienkę niewielką ilością pożywki (np. DMEM, około 200-500 μl), delikatnie wstrząsnąć płytką i ponownie inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut. Dodatek DMEM ułatwi usuwanie z żeli fibrynowych z form odlewniczych agarozy.
  10. Przygotuj nową 24-dołkową płytkę z 1,5 ml pożywki EHT na studzienkę, składającą się z DMEM uzupełnionego 10% inaktywowaną termicznie surowicą końską, 1% penicyliną/streptomycyną, 10 μg/ml insuliny, 33 μg/ml aprotyniny.
  11. Ostrożnie wyjmij stojaki PDMS z form odlewniczych z agarozy i przenieś je na wypełnioną pożywką płytkę 24-dołkową (Rysunek 2F). Umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze (37 °C, 7% CO2 , 40% O2 dla EHT u ludzi i szczurów, 21% O2 dla EHT u myszy) i karmić w poniedziałki, środy i piątki świeżo przygotowanym podłożem EHT. EHT powinny wykazywać spontaniczne skurcze odchylające słupki stojaków PDMS 7-10 dni po odlaniu (Rysunek 1D, 2G).
    1. W przypadku mysich EHT dodać 25 μg/ml βDarabinofuranozydu 5-cytozyny do pożywki hodowlanej przez 48 godzin, aby ograniczyć proliferację fibroblastów.

3. Analiza skurczu

UWAGA: Analiza skurczu opiera się na zapisie wideooptycznym w dostępnym na rynku przyrządzie do analizy EHT (patrz Tabela materiałów). Centralną jednostką tego instrumentu jest komora inkubacyjna (rysunek 3A). Oprogramowanie dostarczone z przyrządem oblicza siłę skurczu na podstawie ugięcia słupków PDMS o znanym module sprężystości i geometrii11 (rysunek uzupełniający 1).

  1. Włączyć urządzenie grzewcze maszyny na 2 godziny przed pomiarem. Włączyć zasilanie gazem i zasilanie elektroniczne układu osi bezpośrednio przed analizą skurczu.
  2. W celu zapisu linii podstawowej (punkt odniesienia w analizie) umieść 24-dołkową płytkę z EHT w pożywce EHT w przyrządzie do analizy EHT i uruchom oprogramowanie do analizy skurczu zgodnie z instrukcją dostawcy.
    1. Kliknij zakładkę "Protokół" w prawym panelu i wprowadź odpowiednie informacje dotyczące nazwy badania, użytkownika, gatunku, typu komórki, wieku, długości nagrania i dodatkowych uwag.
    2. Kliknij zakładkę "Widok kamery" na lewym panelu i uruchom tryb kamery na żywo z trybem automatycznego wykrywania postaci. Kliknij zakładkę "Konfiguracja" na prawym panelu idostosuj pozycję kamery za pomocą współrzędnych xyz dla każdej studzienki w naczyniu 24-dołkowym. Upewnij się, że EHT znajduje się na środku okna i jest ostry w aparacie.
      1. Upewnij się, że pokrywka naczynia do hodowli komórkowej nie jest zaparowana, ponieważ utrudni to rozpoznawanie figur i analizę skurczów.
        UWAGA: Algorytm rozpoznawania figur opiera się na wykrywaniu obszarów o wysokim kontraście i monitorowaniu ich zmiany położenia. W oprogramowaniu te obszary rozpoznawania figur będą oznaczone niebieskim krzyżykiem, który porusza się wraz ze skurczami EHT.
      2. Upewnij się, że pozycje niebieskich krzyżyków znajdują się zarówno na górnym, jak i dolnym końcu EHT i poruszają się tylko pionowo, dopasowując się do skurczów EHT (Rysunek 3B). Zapisz pozycje ustawień każdej studni, naciskając przycisk "pozycja ok".
    3. Następnie kliknij zakładkę "Parametry" w lewym panelu. Wyświetlane tutaj parametry definiują kryteria, na podstawie których oprogramowanie identyfikuje szczyt skurczu i oznacza go zielonym kwadratem. Wartości te są bardzo ważne dla prawidłowej identyfikacji pików skurczu (Rysunek 3C) i braku fałszywych punktów danych (Rysunek 3E-F).
      UWAGA: Wykaz parametrów zależnych od gatunku i przykłady przedstawiono na rysunku 3H. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z instrukcją oprogramowania.
    4. Kliknij zakładkę "Automatycznie" w prawym panelu i rozpocznij analizę, aktywując przycisk "Start". Oprogramowanie będzie przemieszczać się sekwencyjnie z jednego dołka do drugiego, rejestrować skurcze EHT i obliczać siłę podczas nagrywania (wyświetlane w zakładce "Czas rzeczywisty" na lewym panelu). Na zakończenie analizy automatycznie zostanie wygenerowany raport pdf podsumowujący wyniki.
  3. Zapisz i przeanalizuj raport pdf wygenerowany przez system w celu podsumowania wyników.
  4. Monitoruj parametry kurczliwości poprzez powtarzanie pomiarów przez kilka dni. EHT będzie zwiększał swoją siłę skurczu, aż osiągnie plateau (zwykle około 15 dnia hodowli).
  5. Badania przesiewowe na obecność narkotyków
    1. Przygotować bezbiałkowy roztwór Tyrode na jeden dzień przed pomiarem i zrównoważyć na płytkach 24-dołkowych (2 ml/dołek) w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 7% CO2, 40% O2) przez noc: 120 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,1-5 mM CaCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 22,6 mM NaHCO3, 5 mM glukozy, 0,05 mM na2EDTA, 25 mM HEPES. Dodać wapń do 1,8 mM lub wcześniej oznaczoną wartość [EC50], aby zbadać pozytywne działanie inotropowe.
    2. Zważyć i rozpuścić lek w DMSO i w razie potrzeby przefiltrować sterylnie. Przygotować 6 różnych roztworów 1000x-sub-stock (w DMSO) o stężeniu roboczym (np. 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM dla odpowiedniego zakresu nanomolowego).
    3. Rozcieńczyć odpowiedni bulion na płytkach Tyrode (2 μl w każdym dołku o pojemności 2 ml) i dokładnie wymieszać. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze, aż będą potrzebne.
    4. Rozpocznij pomiar bazowy, umieszczając pierwszą 24-dołkową płytkę wypełnioną tyrolą pod sterylnym kapturem i umieść elektrody węglowe w studzienkach. Przenieś stojaki PDMS z EHT umieszczonymi na elektrodach węglowych, zamknij pokrywę, włóż płytkę z powrotem do inkubatora i poczekaj na okres równowagi ~ 30 min.
    5. Przenieść EHT z inkubatora do blokady w przyrządzie do analizy EHT. Zamknij instrument i zarejestruj spontaniczną kurczliwość wyjściową (20 s/EHT).
    6. Podłącz elektrody węglowe do stymulacyjnego i rozpocznij stymulację elektryczną EHT (2,5 V, czas trwania impulsu 4 ms, człowiek: ~1 Hz, szczur: ~2 Hz, mysz: ~4 Hz). Zapisz "tempo" linii bazowej (10 s/EHT). Upewnij się, że wszystkie EHT mają odpowiednie tempo. Częstotliwość i napięcie stymulacji mogą się różnić w zależności od linii komórkowej.
    7. Po zapisie linii podstawowej wyjmij EHT z instrumentu i przenieś elektrody ze stojakami PDMS na górze, na płytkę 24-dołkową z pierwszym stężeniem leku. Natychmiast przenieść EHT z powrotem do blokady przyrządu do analizy EHT i tam przeprowadzić inkubację (standardowy czas inkubacji leku, np. 20 minut).
    8. Podłącz ponownie stymulacyjne, dostosuj rozpoznawanie figur i rejestruj skurcze EHT reagujące na pierwsze stężenie leku.
    9. Dla następujących stężeń leku powtórzyć kroki 3.5.7 i 3.5.8 z płytkami 24-dołkowymi zawierającymi wyższe stężenia leku.
    10. Zapisz wszystkie nagrania w formacie PDF. Sprawdź każde nagranie pod kątem rozpoznawania figur, prawidłowego rozmieszczenia zielonych kwadratów identyfikujących piki skurczu i artefakty (patrz 3.2.1 i Rysunek 3).
    11. W razie potrzeby wykonaj dodatkową analizę w trybie offline.
      1. Wybierz odpowiedni przebieg z bazy danych "Uruchomienia" w lewym panelu, klikając "Wybierz uruchom". W zakładce "Parametr" po lewej stronie zmień parametr do analizy skurczu. Teraz wybierz "Analiza offline" w zakładce "Offline" w prawym panelu, aby ponownie przeanalizować filmy.
      2. Aby dostosować rozpoznawanie figur i tym samym nagrać nowy plik wideo, wybierz "Przykładowy przegląd" po dostosowaniu rozpoznawania figur w zakładce "Czas rzeczywisty". UWAGA: Przegląd próbki może ponownie analizować tylko jeden odwiert na raz, podczas gdy analiza offline może zastosować nowy parametr dla wszystkich dołków, klikając przycisk "Użyj parametru we wszystkich dołkach" w panelu "Parametr" po lewej stronie. Oba typy analiz offline automatycznie utworzą nowe pliki danych i pdf wyświetlający wyniki.
    12. Przeanalizuj eksperyment, łącząc wyniki kontrprób biologicznych i podsumuj dane w postaci krzywych stężenie-odpowiedź dla częstotliwości, siły skurczu, czasu skurczu i czasu relaksacji (Rysunek 5D) i/lub graficznego przedstawienia średnich pików skurczu (Rysunek 5C).
      UWAGA: Stojaki PDMS i przekładka PTFE mogą być używane wielokrotnie (stojaki PDMS max. 5 razy, a przekładka PTFE w nieskończoność). Po użyciu wyczyść je ręcznie wodą, zagotuj dwukrotnie w wodzie demineralizowanej i autoklawie. Należy pamiętać o potencjalnych skutkach przeniesienia podczas ponownego użycia stojaków, ponieważ leki mogą zostać wchłonięte przez PDMS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie serca i przygotowanie EHT

HiPSC zostały rozszerzone na zredukowaną matrycę błony podstawnej czynnika wzrostu, zdysocjowane przez EDTA i ciała embrionoidalne (EB) powstałe w kolbach przędzarki w ciągu nocy. Po indukcji mezodermalnej przez trzy dni rozpoczęto różnicowanie serca za pomocą inhibitora Wnt. Po ~ 17 dniach protokołu różnicowania, bijące EB zostały zdysocjowane na pojedyncze komórki z kolagenazą typu II (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmodyfikowana tkanka serca stanowi cenną opcję w zestawie narzędzi do badań sercowo-naczyniowych. EHT w formacie 24-dołkowym okazały się cenne w modelowaniu choroby 8,14, badaniach przesiewowych bezpieczeństwa leków 7,8,10,11,15 lub podstawowych badaniach sercowo-naczyniowych 16,17

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I.M., T.E. i A.H. są współzałożycielami EHT Technologies GmbH z siedzibą w Niemczech.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Alessandrze Moretti i Dennisowi Schade za ich uprzejmy wkład w materiał. Dziękujemy za ogromne wsparcie grupy roboczej ds. iPS i EHT w Zakładzie Farmakologii Doświadczalnej i Toksykologii UKE. Prace autorów są wspierane przez granty DZHK (Niemieckie Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym) oraz niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF), Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG Es 88/12-1, HA 3423/5-1), Brytyjskiego Narodowego Centrum Udoskonalania i Redukcji Zwierząt w Badaniach (NC3Rs CRACK-IT grant 35911-259146), British Heart Foundation RM/13/30157, Europejska Rada ds. Badań Naukowych (Advanced Grant IndivuHeart), Niemiecka Fundacja Kardiologiczna oraz Freie und Hansestadt Hamburg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Urządzenie do analizyEHT Technologies GmbHA0001Oprogramowanie jest dołączone
Stojak EHT PDMSEHT Technologies GmbHC0001
Przekładka EHT PTFEEHT Technologies GmbHC0002
Elektroda EHTEHT Technologies GmbHP0001
Adapter/stymulacyjny EHTEHT Technologies GmbHP0002
Płytka 24-dołkowaNunc144530
Płytka do hodowli komórek 6-dołkowychNunc140675
15 ml probówka sokoła, z podziałką Sarstedt62,554,502
Skrobak do komórekSarstedt831,830
Kolbaobrotowa Integra182 101
Mieszadło Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Ustaw prędkość wirnika na 40 obr./min
Kolba do hodowli komórkowych T175 Sarstedt 831,812,002
Stojak sedymentacyjny w kształcie litery V Szyte na zamówienie w UKE Hamburgna
10× DMEMGibco52100
1-tioglicerol Sigma AldrichM6145
Sól trisodowa kwasu 2-fosfo-L-askorbinowegoSigma Aldrich49752
Activin-A R& Systemy D338-AC
Agaroza Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insulina Gibco17504-044
BMP-4R& Systemy D314-BP
Kolagenaza II WorthingtonLS004176
DMEM BiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNaza II, typ V (ze śledziony bydlęcej)Sigma D8764
Dorsomorphina abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Surowica cielęca płoduGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrynogen (bydlęcy)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302Do powlekania: 1:200 rozcieńczenie
HBSS bez Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
Surowica końskaTechnologie życia26050088
Albumina surowicy ludzkiej Przemysł biologiczny05-720-1B
Insulina, ludzkaSigma AldrichI9278
L-GlutaminaGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234Do rekonstrukcji EHT.
N-Benzyl-p-ToluenesulfonamidTCIB3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Penicylina/StreptomycynaGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
Alkohol poliwinylowy Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Selenin soduSigma AldrichS5261
TGFß 1Peprotech100-21
TrombinSigma AldrichT7513
Transferyna Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCWykonane na zamówienie w UKE hamburgna
zestaw kardiomiocytów iCellCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Zestaw kardiomiocytów PluricytePluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - zestaw kardiomiocytów HiPSCAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Kardiomiocyty CellartisTakara Bio USA, Inc.Y10075
powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436(2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397(2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958(2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937(2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349(2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312(2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fibrin Gel AssemblyPDMS PostsForce MeasurementCamera Based DetectionFigure Recognition AlgorithmhERG Channel InhibitionE 4031 Drug Response

Powiązane artykuły