Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55463

⸱

31 marca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj jest metoda ekstrakcji, oczyszczania i kontroli jakości genomowego DNA z obligatoryjnego biotroficznego patogenu grzybowego, mączniaka prawdziwego, do użycia w długotrwałym sekwencjonowaniu genomu.

Streszczenie

Grzyby mączniaka prawdziwego to grupa ważnych z ekonomicznego punktu widzenia patogenów grzybowych roślin. Stosunkowo niewiele wiadomo na temat biologii molekularnej i genetyki tych patogenów, częściowo z powodu braku dobrze rozwiniętych zasobów genetycznych i genomicznych. Organizmy te mają duże, powtarzalne genomy, co sprawiło, że sekwencjonowanie i składanie genomu jest zbyt trudne. W tym miejscu opisano metody pobierania, ekstrakcji, oczyszczania i oceny jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jednego gatunku mączniaka prawdziwego, Golovinomyces cichoracearum. Opisany protokół obejmuje mechaniczne rozerwanie zarodników, po którym następuje zoptymalizowana ekstrakcja genomowego DNA fenol/chloroform. Typowa wydajność wynosiła 7 μg DNA na 150 mg konidiów. Genomowe DNA, które jest izolowane przy użyciu tej procedury, nadaje się do sekwencjonowania z długim odczytem (tj. > 48,5 kbp). W tej metodzie opisano również środki kontroli jakości mające na celu zapewnienie rozmiaru, wydajności i czystości genomowego DNA. Sekwencjonowanie genomowego DNA o opisanej tutaj jakości pozwoli na złożenie i porównanie wielu genomów mączniaka prawdziwego, co z kolei doprowadzi do lepszego zrozumienia i lepszej kontroli tego patogenu rolniczego.

Wprowadzenie

Mączniak prawdziwy to grupa obowiązkowych biotroficznych patogenów grzybowych roślin, które, razem wzięte, są najczęstszą przyczyną chorób roślin na świecie1. Istnieje ponad 900 opisanych gatunków mączniaka prawdziwego, które zostały taksonomicznie pogrupowane w pięć plemion w rodzinie Erisyphaceae2. Zarówno ze względu na ich znaczenie gospodarcze, jak i bliskie relacje, jakie nawiązują ze swoimi gospodarzami, choroby mączniaka prawdziwego są przedmiotem badań od > 100 lat. Po zakażeniu mączniak prawdziwy wywołuje drastyczne zmiany w strukturze komórkowej, metabolizmie i biologii molekularnej gospodarzy, z korzyścią dla tego patogenu. Jednak badanie mączniaka prawdziwego jest szczególnie trudne ze względu na ich obowiązkowy tryb życia, a wzrost grzyba w czystej kulturze nie został jeszcze opisany3,4,5,6,7,8. Niezawodna, stabilna transformacja genetyczna mączniaka prawdziwego również nie została jeszcze osiągnięta, chociaż u niektórych gatunków odnotowano przejściowe transformacje9,10.

Sekwencjonowanie i składanie genomów mączniaka prawdziwego okazało się trudne ze względu na wiele cech samego genomu. Genomy mączniaka prawdziwego są duże (120 - 180 Mbp) w stosunku do innych genomów grzybów i składają się z 60 - 90% równomiernie rozmieszczonych powtarzających się elementów11. Elementy te obejmują niedługie powtórzenia końcowe, a także nieskategoryzowane powtarzające się elementy. Zsekwencjonowano dwie formy specjalne jednego gatunku mączniaka prawdziwego, Blumeria graminis f. sp. hordei i f. sp. tritici (odpowiednio Bgh i Bgt), a także mączniaka prawdziwego winogron Erysiphe necator, a także zakończono opracowywanie genomów roboczych dla kilku innych12,13,14. Powtarzalna natura genomów utrudniła składanie, a kompletny genom Bgh został złożony w 6 989 superkontigów o L50 wynoszącym 2 Mb12.

Pomimo dużego genomu, mączniak prawdziwy wydaje się mieć niewielką liczbę genów kodujących białka, z 5,845 i 6,540 genami przewidzianymi odpowiednio w Bgh i Bgt. Sekwencjonowane mączniak prawdziwy wydaje się również nie mieć co najmniej 99 podstawowych genów, które są niezbędne dla innych grzybów, co jest zgodne z zależnością grzybów od ich rośliny żywicielskiej dla przetrwania11,12,13,14.

Powtarzające się sekwencje w pobliżu telomerów, centromerów, układów genów rybosomalnego RNA i regionów wzbogaconych w elementy transpozycyjne są słabo złożone ze strategii sekwencjonowania krótkiego odczytu i często są niedostatecznie reprezentowane w składach genomu15. Uważa się, że takie regiony są odpowiedzialne za wiele luk występujących w sekwencjach genomu, a dotyczy to mączniaka prawdziwego z ich rozległą ekspansją powtarzających się elementów16. Wysoce plastyczne regiony genomu są często znajdowane w takich powtarzających się regionach3. Służą one jako miejsce rearanżacji chromosomów i często kodują geny pod silną presją selekcyjną, takie jak geny kodujące białka efektorowe i geny kodujące enzymy metabolizmu wtórnego. Postępy w technologiach sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek z długim odczytem stanowią potencjalne rozwiązanie dla sekwencjonowania w powtarzających się regionach genomów15. Na przykład Faino i in. (2015) odkryli, że włączenie technologii odczytu długich sekwencji i mapowania optycznego pozwoliło im wyprodukować sekwencję genomu bez przerw dla dwóch szczepów grzybowego patogenu roślinnego Verticillium dahlia, potrajając proporcję powtarzających się sekwencji DNA w genomie, zwiększając liczbę adnotacji genów (i zmniejszając liczbę częściowych lub brakujących adnotacji genów) i ujawniając rearanżacje genomu17.

Aby zastosować te technologie sekwencjonowania z długim odczytem, potrzebne są wysokie stężenia wysokiej jakości genomowego DNA, o minimalnych rozmiarach > 20 kbp. W tym miejscu opisujemy nasze metody zbierania konidiów, oczyszczania DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z konidiów oraz nasze oceny kontroli jakości przy użyciu gatunku mączniaka prawdziwego >Golovinomyces cichoracearum uprawianego na ogórku18. Protokół ten jest oparty na protokole opracowanym w grupie laboratoryjnej B. Keller (Uniwersytet w Zurychu, Zurych, Szwajcaria)13,19 i zawiera kilka modyfikacji, które doprowadziły do zwiększenia wydajności DNA i większego udziału DNA o rozmiarze >48,5 kbp. Protokół zawiera również kroki kontroli jakości oparte na zaleceniach Joint Genome Institute Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych20,21,22.

Funkcja każdego odczynnika zawartego w buforze do lizy oraz uzasadnienie każdego etapu oczyszczania są opisane w Henry (2008)23. Dostępne opublikowane protokoły izolacji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z tkanek roślinnych i mikrobiologicznych były również konsultowane podczas projektowania tego protokołu24,25,26,27,28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiału grzybowego

  1. Uprawa mączniaka prawdziwego
    1. Uprawiaj rośliny w komorach wzrostowych o następujących warunkach: 22 °C temperatura w dzień, 20 °C w nocy, 80% wilgotności względnej, 14-godzinna długość dnia i natężenie światła 125 μE/m2/s (zapewniane przez oświetlenie fluorescencyjne).
    2. Zainfekuj rośliny ogórka (odmiana Cucumis sativa Bush Champion) szczepem Golovinomyces cichoracearum UCSC1 zgodnie z opisem18,29.
  2. Zbiór konidiów mączniaka prawdziwego
    1. Zebrać konidia z zainfekowanych roślin po 7 - 10 dniach od zaszczepienia, używając małego podciśnienia z wbudowanym filtrem (11 μm), na którym gromadzą się konidia. Delikatnie dociskając, przesuń dyszę próżniową wzdłuż powierzchni liścia, aby zebrać konidia.
      UWAGA: Średni plon G. cichoracearum wynosi 20 mg konidiów z silnie porażonych liści ogórka o powierzchni około 130cm2.
    2. Wytrzyj około 150 mg konidiów (około 375 μl objętości lub konidiów z 7-8 zainfekowanych liści ogórka) z filtra na arkusz czystego papieru. Stąd przenieś konidia do kriowiali o pojemności 2 ml za pomocą dwóch wstępnie schłodzonych (w ciekłym azocie) stalowych kulach mielących o średnicy 5/32 cala. Natychmiast zwróć probówki do ciekłego azotu. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.
  3. Rozbijanie konidiów przez mielenie kulowe
    1. Błyskawiczne zamrażanie aluminiowych płyt młyna kulowego w ciekłym azocie. Załaduj kriowiale do stojaka młyna kulowego. Energicznie wstrząsać kriowiami z konidiami i stalowymi kulkami w młynie kulowym przez 30 s przy 30 cyklach/s (w temperaturze pokojowej). Natychmiast ponownie zamrozić kriowiale w ciekłym azocie.
      UWAGA: Początkowo uzyskaj dostęp do próbki konidiów za pomocą mikroskopii w 100-krotnym powiększeniu, aby uzyskać skuteczność pękania ściany komórkowej podczas mielenia. W razie potrzeby miel przez dodatkowe 1 - 2 rundy po 30 s przez 30 cykli/s, ale ogranicz liczbę rund do minimum. Rutynowa ocena pęknięcia konidiów za pomocą mikroskopii na tym etapie nie jest konieczna, gdy zostaną ustalone optymalne warunki.

2. Oczyszczanie genomowego DNA

  1. Konidia Liza
    1. Pracując szybko, aby uniknąć rozmrożenia konidiów, usuń stalowe kulki z kriowiali za pomocą magnesu. Dodać 700 μl buforu do lizy o temperaturze 65 °C (Tabela 1) i wirować przez 5 - 10 s, aż powstanie zawiesina.
    2. Dodać 300 μl wstępnie podgrzanego (65 °C) 5% (v/v) sarkozylu i delikatnie odwrócić, aby wymieszać (1 inwersja na 3 s) pięć razy. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze 65 °C; Odwróć delikatnie 3 razy po 10, 20 i 30 minutach. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze przenieś cały roztwór do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Na wszystkich kolejnych etapach należy mieszać przez delikatną, powolną inwersję i przenosić roztwory zawierające DNA za pomocą końcówek do pipet o szerokim otworze.
  2. Ekstrakcja DNA I
    1. Dodać 1 objętość chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1 v/v) do roztworu do lizy i delikatnie odwrócić, aby wymieszać pięć razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie odwracając, aby wymieszać pięć razy w połowie inkubacji i ponownie pod koniec inkubacji. Wirować w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy 14 000 x g. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze ostrożnie przenieś warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml; Unikaj dołączania materiałów z interfejsu.
  3. Strącanie DNA I
    1. Dodaj 1 objętość 100% izopropanolu o temperaturze pokojowej (około 750 μl) i delikatnie odwróć, aby wymieszać sześć razy. Wirować w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy 14 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić.
    2. Dodać 450 μl wstępnie schłodzonego (-20 °C) 70% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 14 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić. Wirować przy 1 000 x g przez 3 s, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą drobnej końcówki pipety i wyrzucić. Suszyć granulat na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Nie suszyć dłużej niż 15 minut.
    3. Zawiesić osad w 300 μl TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, pH 8,0). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Delikatnie strzepnąć w celu ponownego zawieszenia pozostałego materiału, który nie został wprowadzony do roztworu.
  4. Aby usunąć zanieczyszczenie RNA, dodaj 10 μl RNazy A (10 mg/ml). Delikatnie odwróć, aby wymieszać trzy razy. Wirować przy 1 000 x g przez 3 s. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  5. Ekstrakcja DNA II
    1. Dodać 300 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1 v/v) i delikatnie odwrócić, aby wymieszać pięć razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie odwracając, aby wymieszać pięć razy w połowie inkubacji i ponownie pod koniec inkubacji. Wirować 15 minut w temperaturze pokojowej przy 14 000 x g. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Wytrącanie DNA II
    1. Dodać 0,01 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 (około 3 μL), delikatnie odwrócić do pięciokrotnego mieszania. Dodać 2,5 objętości wstępnie schłodzonego (-20 °C) 100% etanolu (około 750 μL). Delikatnie odwróć, aby wymieszać pięć razy. Inkubować przez noc w temperaturze -20°C.
    2. Wirować przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy 14 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić.
    3. Dodać 450 μl wstępnie schłodzonego (-20 °C) 70% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 14 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić. Wirować przy 1 000 x g przez 3 s. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą cienkiej końcówki pipety i wyrzucić.
    4. Suszyć granulat na powietrzu przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 27,5 μl TE. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Delikatnie strzepnąć w celu ponownego zawieszenia pozostałego materiału, który nie został wprowadzony do roztworu.
    5. Podaniec 2,5 μL na 22,5 μL TE (końcowa objętość 25 μL) do testów kontroli jakości (patrz poniżej). Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przekazania ich do sekwencjonowania. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C i zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec ścinaniu.
      UWAGA: Na tym etapie pipetowania należy zachować ostrożność, ponieważ prawidłowe pipetowanie genomowego DNA o dużej masie cząsteczkowej może być trudne, dlatego ważne jest, aby upewnić się, że "QC Aliquot" jest dokładnym odwzorowaniem próbki genomowego DNA.

3. Kontrola jakości

  1. Czystość próbki
    1. Korzystając z próby ślepej TE, ocenić czystość próbki DNA, ładując 1 μl podwielokrotności kontroli jakości do spektrofotometru o małej objętości. Rejestruj odczyty A260/A280 i A260/A230. Czyste DNA będzie miało stosunek A260/A280 wynoszący około 1,8, a stosunek A260/A230 między 1,8 a 2,2.
  2. Kwantyfikacja genomowego DNA
    1. Przeprowadzić kwantyfikację podwielokrotności QC przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania ilościowego dwuniciowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Ocena jakości DNA I
    1. Załaduj około 60 ng genomowego DNA i drabinkę DNA na 0,7% żelu agarozowym w 1x TAE (40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego i 1 mM EDTA, pH 8,0). Uruchomić aparat żelowy pod napięciem 70 V przez 40 - 45 minut, aż prążki genomowego DNA znajdą się w odległości około 2 cm od studzienki i widoczne będzie oddzielenie pasm w drabince. Warunki te mogą wymagać dostosowania w oparciu o dostępny aparat do elektroforezy żelowej.
  4. Ocena jakości DNA II
    1. Załaduj około 60 ng genomowego DNA i drabinkę DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (odpowiednią do elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym) na 1% żelu agarozowym w 0,5x TBE (44,5 mM Tris, 44,5 mM kwasu borowego, 1 mM EDTA, pH 8,3) i uruchom w buforze roboczym 0,5x TBE przy użyciu protokołu elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym o kształcie fali 5 - 80 kbp przez 16 godzin.
  5. Ocena zanieczyszczeń bakteryjnych, grzybiczych i roślinnych
    1. Przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu amplifikacji odpowiednich regionów wewnętrznych transkrybowanych przekładek (ITS) genów rybosomalnych przy użyciu starterów i warunków amplifikacji wymienionych w tabeli 2. Załadować 10 μl wynikowej reakcji na żel.
      UWAGA: Pasmo reprezentujące region ITS mączniaka prawdziwego powinno być wzmocnione podkładami grzybowymi ITS. DNA z tego amplikonu i każdy amplikon wygenerowany za pomocą starterów bakteryjnych lub roślinnych powinno zostać zsekwencjonowane w celu określenia pochodzenia zanieczyszczenia. W amplikonie grzyba powinny znajdować się tylko sekwencje ITS mączniaka prawdziwego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywny przykład 60 ng oczyszczonego DNA genomowego z G. cichoracearum przeprowadzone na żelu agarozowym z wykorzystaniem elektroforezy żelowej oraz elektroforezy w polu pulsacyjnym przedstawiono w Rysunki 1 i 2odpowiednio. Przedstawiono preparaty genomowego DNA, które przeszły kontrolę jakości, przeszły ją w stopniu ograniczonym lub nie przeszły jej. Preparaty genomowego DNA, które w pełni przeszły kontrolę jakości, są i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W celu uzyskania czystego, wysokocząsteczkowego genomowego DNA z obligatoryjnych biotroficznych grzybów mączniaka prawdziwego opracowano zmodyfikowaną wersję wcześniej opisanych metod30. Średnia wydajność przy użyciu tego zoptymalizowanego protokołu wynosi 7 μg DNA na 150 mg konidiów, co stanowi podwojenie wydajności uzyskanej przy użyciu poprzedniego protokołu. Również średni rozmiar wzrósł z około 20 kbp do ponad 48,5 kbp. Protokół ten został zoptymalizowany w systemie cucumber-G. cichoracea...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten protokół został opracowany w celu wsparcia Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). Prace były częściowo wspierane przez Fundację Philomathia, Narodową Fundację Nauki (#0929226) i Instytut Nauk Biologicznych Energii dla S. Somerville'a; oraz przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (#310030_163260) do B. Kellera. Chcielibyśmy podziękować naszym kolegom, M. Figureroa i M. Millerowi (University of Minnesota), R. Panstrudze (RWTH Aachen University), C. Pedersenowi (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) i S. Xiao (University of Maryland) za ich hojne rady i za dobrowolne udostępnienie swoich protokołów, gdy opracowywaliśmy opisany tutaj protokół.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MM400 Młyn kulowyRetsch20.745.0001Lub równoważny młyn kulowy
2 mL probówki do mielenia kulowegoSarstedt 72.694.007
Kule frezarskie ze stali nierdzewnej 5/32"OPS DiagnosticsGBSS 165-5000-01
Sterowana mikroprocesorem łaźnia wodna serii 280 Wstępnie ustawiona na 65 & stopni; C Thermo Fisher Scientific2825Lub równoważna kąpiel wodna
Sterowana mikroprocesorem Łaźnia wodna serii 280 Wstępnie ustawiona na 37 & stopni; CThermo Fisher Scientific2825Lub równoważna kąpiel wodna
Eppendorf 5417R mikrowirówka z chłodzeniemKrakeler Scientific 38-022621807Lub równoważna mikrowirówka
Chlorform: IAA (24:1 v/v)Sigma-Aldrich C0549Stwarza zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą lub wdychania. Nosić rękawice nitrylowe, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i pracować w kapturze chemicznym
Fenol:Chloroform:IAA
(25:24:1 v / v)		Thermo Fisher Scientific15593031Niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą lub wdychania. Nosić rękawice nitrylowe, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i pracować w kapturze chemicznym
100% IsopropanolSigma-Aldrich 
100% etanolSigma-Aldrich 34923Schładzanie do -20 stopni; C przed użyciem
Octan soduSigma-Aldrich S2889
Rnaza, bez dnazy (10 mg/ml)Thermo Fisher ScientificEN0531
Pirosiarczyn potasuSigma-Aldrich P2522
Sacroinate Laurylu SoduSigma-Aldrich L9150
Podstawa TrisSigma-Aldrich 
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich EDS
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-Aldrich S9888
Bromek cetyltrimetyloamoniowy (CTAB)Sigma-Aldrich H6269
Gogle Uvex by Honeywell Futura S345C, UvextremeStaples423263Lub równoważne
okulary Rękawice nitrylowe High Five COBALT, DUŻENeta ScientificHFG-N193Lub równoważne rękawice
GelRed Gel Nucleic Acid Gel Stain 10 000x w wodzieBiotium41003
Bromek etydyny 10 mg/mlBiotium40042Niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą. Nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb CHEF Wzorce wielkości DNABio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172Lub równoważny żel do pomiaru pulsacyjnego
Bibuła filtracyjna jakościowa Whatman, klasa 1Sigma-Aldrich WHA1001042Lub równoważna komora wzrostowa
Percival Komora wzrostu PercivalAR66LXC9
NanoDrop 8000 Spektrofotometr UV-VisThermo Fisher ScientificND-8000-GLLub równoważny spektrofotometr
Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw do oznaczaniaThermo Fisher ScientificP11496
TAE Bufor (Tris-acetate-EDTA) (50x)Thermo Fisher ScientificB49Rozcieńczyć 1/50 wodą przed użyciem (do 1x)
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015 
Tris-Boran-EDTA, 10x Roztwór (Elektroforeza)Thermo Fisher ScientificBP13334Rozcieńczyć 1/10 wodą przed użyciem (do 1x)
Ciekły azotCiekły azot (-196 ° C) stwarza ryzyko zamarznięcia. Po podgrzaniu będzie się również szybko rozszerzał i nie powinien być przechowywany w szczelnie zamkniętym pojemniku
W29290710708976001

Bibliografia

  1. Agrios, G. N. Plant Pathology. , 4th, Academic Press. (1969).
  2. Braun, U., Cook, R. T. Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).
  3. Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
  4. Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
  5. Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
  6. Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
  7. Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
  8. Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
  9. Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
  10. Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
  11. Hacquard, S. Advances in Botanical Research. Francis, M. M. 70, Academic Press. 109-142 (2014).
  12. Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
  13. Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092(2013).
  14. Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081(2014).
  15. Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
  16. Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
  17. Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
  18. Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
  19. Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
  20. Joint Genome Institute DNA sample submission guidelines. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf (2016).
  21. Chovatia, M., Sharma, A. Genomic DNA sample QC version 4.0. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf (2014).
  22. Daum, C. iTag sample amplification QC version 1.3. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf (2016).
  23. Plant genotyping II: SNP technology. Henry, R. J. , CABI. Oxfordshire, UK. (2008).
  24. Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
  25. Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
  26. Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105(2015).
  27. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
  28. Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470(2014).
  29. Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
  30. User Manual: Pippin Pulse Electrophoresis Power Supply. , Sage Science. http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja DNA m czniaka prawdziwegoekstrakcja fenolo chloroformowasekwencjonowanie d ugich odczyt w DNAelektroforeza w polu pulsuj cymoczyszczanie genomowego DNAizolacja DNA grzybowegokontrola jako ci DNAekstrakcja DNA z konidi wanaliza elektroforetyczna w elu
Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.