Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

17.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55465

⸱

5 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Streszczenie

Wdychanie alergenów i patogenów wywołuje wiele zmian w różnych typach komórek odpornościowych w płucach. Cytometria przepływowa jest potężną techniką analizy ilościowej białek powierzchniowych komórek na komórkach odpornościowych, ale nie dostarcza żadnych informacji na temat lokalizacji i wzorców migracji tych komórek w płucach. Podobnie testy chemotaksji można przeprowadzić w celu zbadania potencjału komórek do reagowania na czynniki chemotaktyczne in vitro, ale testy te nie odtwarzają złożonego środowiska nienaruszonego płuca. W przeciwieństwie do tych wyżej wymienionych technik, lokalizację poszczególnych typów komórek w płucach można łatwo zobrazować, generując precyzyjnie cięte plastry płuc (PCLS), barwiąc je dostępnymi na rynku, fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami i wizualizując skrawki za pomocą mikroskopii konfokalnej. PCLS może być stosowany zarówno do żywej, jak i utrwalonej tkanki płucnej, a plastry mogą obejmować obszary tak duże, jak przekrój poprzeczny całego płata. Wykorzystaliśmy ten protokół, aby z powodzeniem zobrazować lokalizację szerokiej gamy typów komórek w płucach, w tym różnych typów komórek dendrytycznych, makrofagów, neutrofili, limfocytów T i limfocytów B, a także komórek strukturalnych, takich jak komórki limfatyczne, śródbłonka i nabłonka. Zdolność do wizualizacji interakcji komórkowych, takich jak te między komórkami dendrytycznymi a limfocytami T, w żywej, trójwymiarowej tkance płucnej, może ujawnić, w jaki sposób komórki poruszają się w płucach i oddziałują ze sobą w stanie stacjonarnym i podczas stanu zapalnego. Tak więc, w połączeniu z innymi procedurami, takimi jak cytometria przepływowa i ilościowy PCR, PCLS może przyczynić się do kompleksowego zrozumienia zdarzeń komórkowych, które leżą u podstaw chorób alergicznych i zapalnych płuc.

Wprowadzenie

Po wdychaniu bodźców prozapalnych, takich jak lipopolisacharyd (LPS), następuje skoordynowany ruch komórek odpornościowych do, wewnątrz i z płuc. Na przykład neutrofile są szybko rekrutowane do miąższu płuc i dróg oddechowych. Ponadto niektóre profesjonalne komórki prezentujące antygen, znane jako konwencjonalne komórki dendrytyczne (cDC), przechodzą stosunkowo złożony wzorzec migracji1,2. cDC można zidentyfikować za pomocą cytometrii przepływowej, częściowo na podstawie wyświetlania znacznika powierzchniowego, CD11c. Odrębne podzbiory DC można rozróżnić na podstawie różnicowego wyrażenia powierzchni CD103 i CD11b3. Po nabyciu wziewnego antygenu niektóre cDC opuszczają płuca i migrują przez naczynia limfatyczne do węzłów chłonnych drenujących płuca (LN), gdzie prezentują peptydy limfocytom T specyficznym dla antygenu4. Jest to krytyczne wczesne zdarzenie w inicjacji adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Jednak z nieznanych przyczyn nie wszystkie cDC, które nabywają wdychane antygeny, opuszczają płuca, a wiele z tych komórek pozostaje w tym narządzie przez kilka miesięcy5,6. Obserwację tę można częściowo wyjaśnić pochodzeniem rozwojowym tych komórek, ponieważ komórki CD11c+ pochodzące z monocytów pozbawione receptora chemokiny, CCR7, nie są w stanie migrować do regionalnych LNs7,8. Wydaje się prawdopodobne, że potencjał migracyjny cDC jest również zdeterminowany, przynajmniej częściowo, przez ich anatomiczne położenie w płucach. Jednak dokładna lokalizacja tych różnych populacji cDC w płucach nie jest w pełni scharakteryzowana. Lepsza wiedza na temat lokalizacji komórek odpornościowych w płucach i cząsteczek, które nimi kierują, jest potrzebna do lepszego zrozumienia, w jaki sposób układ odpornościowy płuc zostaje aktywowany.

PCLS są coraz częściej używane jako podejście ex vivo do wizualizacji pozycjonowania komórkowego i interakcji komórka-komórka, przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej architektury płuc9,10. PCLS były używane do badania płuc wielu gatunków, w tym myszy, bydła, małp, owiec, koni i ludzi11. Główną zaletą tej techniki jest to, że z jednego płata płuca myszy można przygotować około 20 plastrów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do indywidualnych eksperymentów. Praktycznie wszystkie typy komórek odpornościowych, w tym DC, makrofagi, neutrofile i limfocyty T, są obecne w PCLS i utrzymują swoje normalne struktury.

PCLS może być również używany do badania sygnalizacji wapniowej i kurczliwości komórek dróg oddechowych i mięśni gładkich po leczeniu acetylocholiną12 lub metacholina13. W tym podejściu tylko niewielka część płuc jest analizowana mikroskopowo, ale jedno z badań wykazało, że pomiary skurczu dróg oddechowych w PCLS różnią się tylko o około 10% w zależności od plasterka, a wariancja ta jest porównywalna z tą obserwowaną przy użyciu testów czynnościowych płuc u nienaruszonych zwierząt14. Inni badacze wykorzystali PCLS jako podejście ex vivo do badania zmian w ekspresji cytokin i markerach powierzchni komórek po inkubacji z LPS15. PCLS stosowano również w modelu ex vivo niedotlenienia naczyń płucnych w małych tętnicach wewnątrzgroniastych. Naczynia te znajdują się w części płuca, do której nie można dotrzeć za pomocą innych procedur, w tym nagrań z wypreparowanych odcinków tętnic lub analizy naczyń podopłucnowych16. Nasze laboratorium wykorzystało przede wszystkim PCLS do wizualizacji lokalizacji komórek odpornościowych w żywej tkance płucnej w stanie stacjonarnym i po bodźcu zapalnym in vivo. Procedury, które opracowaliśmy w tym celu, są następujące.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne na zwierzętach opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIEHS (IACUC).

1. Przygotowanie płuc

  1. Myszy domowe w wieku od 6 do 12 tygodni w określonych warunkach wolnych od patogenów zgodnie z wytycznymi dostarczonymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania.
    UWAGA: Zobrazowane myszy mogą być albo naiwne, albo leczone, w zależności od konkretnych zainteresowań każdego badacza. Tutaj opisujemy lokalizację komórek odpornościowych u myszy nieleczonych wcześniej i myszy leczonych 100 μg albuminy jaja kurzego (OVA) i 0,1 μg lipopolisacharydu (LPS), używając soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako nośnika w całkowitej objętości 50 μl. Aby wkroplić OVA/LPS do dróg oddechowych, zwierzęta znieczulono inhalacją izofluranu i pionowo zawieszono za zęby za pomocą gumki. Język delikatnie chwycono kleszczami i przytrzymano z boku, aby zapobiec połknięciu, a 50 μl roztworu OVA/LPS zdeponowano z tyłu jamy ustnej, jak wcześniej opisano17.
  2. Poddaj mysz eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu (100 mg/kg) i przypnij zwierzę do podłoża polistyrenowego.
  3. Otwórz jamę brzuszną nożyczkami, przecinając skórę i otrzewną od środka brzucha do szczęki. Odciągnij jelita na bok kleszczami lub krawędzią nożyczek i odetnij żyłę główną dolną, aby odprowadzić krew z płuc. Nakłuj przeponę ostrą końcówką nożyczek, aby umożliwić rozszerzenie klatki piersiowej, uważając, aby nie przeciąć płuc.
  4. Usuń gruczoły ślinowe i inne tkanki z tchawicy, chwytając tkankę i ręcznie odciągając ją od leżącej pod nią tchawicy za pomocą kleszczy. Wykonaj małe nacięcie w tchawicy po przedniej stronie najgrubszego pasma chrząstki za pomocą cienkich kleszczy lub nożyczek, uważając, aby nie przeciąć tchawicy do końca. Nacięcie będzie wystarczająco duże, aby umożliwić przejście przez nie igły o wadze 20 G.
  5. Wsuń igłę o długości 1,5 cala i wadze 20 G na odcinek rurki polietylenowej, pozostawiając około 1 cm rurki poza końcem igły. Przeciąć rurkę pod kątem około 45°, aby ukosować koniec, przymocować igłę do strzykawki o pojemności 1 ml i załadować strzykawkę, pobierając przez igłę 0,8 ml ciepłej (40 °C) 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
  6. Umieść koniec rurki w nacięciu tchawicy i powoli wstrzyknij agarozę do płuc. Nie przesuwając igły ani strzykawki, przyklej strzykawkę do podstawy polistyrenowej, aby upewnić się, że igła pozostaje w tchawicy.
    UWAGA: Po wstrzyknięciu płuca będą większe i napompowane w klatce piersiowej. Najpierw rozszerza się prawy płat, a następnie lewy płat. Jeśli rozszerza się tylko jeden płat, oznacza to, że igła została włożona zbyt głęboko (poza oskrzela) i konieczne będzie jej lekkie wyciągnięcie przed kontynuowaniem. Ta część procedury musi być wykonana stosunkowo szybko, zanim agaroza zacznie krzepnąć.
  7. Umieść mysz z podstawą i strzykawką nadal włożoną do tchawicy w chłodni lub lodówce na co najmniej 10 minut. W razie potrzeby zwierzę może być tam trzymane do kilku godzin, nawet jeśli przystąpi do obrazowania migracji komórek za pomocą wideomikroskopii.
  8. Gdy mysz ostygnie, ostrożnie wytnij napompowane agarozą płuca za pomocą nożyczek i umieść je w 3 cm naczyniu z lodowatym PBS. Trzymaj na lodzie.
  9. Wybierz żądany płat do krojenia tkanek (np. prawy płat górny). Upewnij się, że wewnętrzna część płuca (w miejscu, w którym łączy się z tchawicą) jest w naczyniu skierowana w dół.
    UWAGA: Zastosowany płat i jego orientacja na tłoku określą rozmiar naczyń i dróg oddechowych, które będą widoczne. Opisana tutaj orientacja jest idealna do wizualizacji dużych dróg oddechowych i miąższu. Myszy mają jeden duży lewy płat i cztery mniejsze płaty po prawej. W przypadku obrazowania PCLS po wprowadzeniu alergenów do płuc poprzez aspirację ustno-gardłową lub donosową, prawy płat górny jest zwykle cięty, częściowo dlatego, że jest to dogodny rozmiar, ale także dlatego, że wdychane środki rozpraszają się w nim równomiernie. Jednak inne płaty, zwłaszcza lewy płat, mogą być również badane. Porównując szczepy myszy lub metody leczenia, ważne jest, aby porównać ten sam płat.

2. Krojenie płuc

UWAGA: Zrób plastry za pomocą automatycznego krajalnicy, metalowego bloku chłodzącego, tłoka i metalowej strzykawki, zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Nałóż małą kroplę uniwersalnego, niebiegnącego żelu superglue na tłok i rozprowadź klej okrężnymi ruchami, uważając, aby klej nie dotykał boków metalowej strzykawki. Jeśli klej dotknie boków strzykawki, sklei strzykawkę i tłok ze sobą.
  2. Natychmiast po pokryciu tłoka klejem delikatnie chwyć wycięty płatek kleszczami tchawicy do dołu, przetrzyj nim chusteczkę w celu usunięcia nadmiaru płynu i ostrożnie umieść go na tłoku. Odciąć wszelkie dodatkowe tkanki wystające poza krawędź tłoka.
  3. Przesuń tłok w dół, tak aby boki metalowej strzykawki przesuwały się w górę i nad tkanką, tworząc studzienkę z płucem przyklejonym na dole, o głębokości nie większej niż kilka centymetrów. Przyklej taśmę do dolnej części metalowej strzykawki, aby utrzymać tę pozycję na miejscu.
  4. Ostrożnie wlej 2% niskotopliwej agarozy w temperaturze 40 °C do studzienki, tak aby pokryła tylko górną część płata.
  5. Otocz metalową strzykawkę lodowatym blokiem chłodzącym i schładzaj płatek i agarozę przez 1 - 2 minuty
    UWAGA: Krótszy czas schładzania agarozy otaczającej tkankę może prowadzić do rozpadu agarozy podczas krojenia, co może skutkować nierównomiernym cięciem PCLS.
  6. Załaduj strzykawkę z próbką do automatycznej krajalnicy i napełnij zbiornik buforowy lodowatym PBS. Dopasuj napęd silnika krokowego do strzykawki z próbką i usuń kawałek taśmy od dołu. Przekręć przełącznik do pozycji szybkiego przewijania do przodu (FF), aż napęd silnika krokowego dotknie tylnej części tłoka.
  7. Wyrównać świeże ostrze ze strzykawką z próbką. Ustaw grubość tkanki, ciągłą/pojedynczą warstwę, oscylację i prędkość w krajalnicy. Na przykład grubość tkanki: 150 μm, cięcie ciągłe (ciąg dalszy), oscylacja: 9 i prędkość: 3 - 4. Naciśnij start. Powyższe ustawienia należy dostosować do konkretnych specyfikacji automatycznego slicera.
  8. Za pomocą cienkiej szpatułki lub pędzla zbieraj PCLS pojedynczo, gdy wpadają do zbiornika buforowego i umieść je w 24-dołkowej płytce zawierającej lodowaty PBS.
    UWAGA: Ważne jest, aby zachować plasterki, aby zachować spójność między eksperymentami. Chociaż każde płuco jest inne w zależności od wieku, płci i wagi, na przykład 10. warstwa na ogół daje drogi oddechowe o podobnej wielkości.

3. Barwienie przeciwciał

  1. Zaprojektuj panel fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w oparciu o typ komórki będącej przedmiotem zainteresowania, biorąc pod uwagę potencjalne nakładanie się widma fluorescencyjnego i możliwości wykrywania mikroskopu.
    UWAGA: Jako przykład, panel do wykrywania podzbioru DC jest następujący: CD11c/alfa X integryna - BrilliantViolet (BV) 605 (wzbudzenie: 405 nm, emisja szczytowa: 605 nm), CD324/E-kadheryna - Alexa 488 (AF488) (wzbudzenie: 488 nm, emisja szczytowa: 519 nm), CD88/C5Ra1 - fikoerytryna (PE) (wzbudzenie: 561 nm, emisja szczytu: 578 nm), integryna CD103/alfa E - allofikocyjanina (APC) (wzbudzenie: 633 nm, emisja szczytowa: 660 nm). Narzędzia do przeglądania widma fluorescencji (patrz Lista materiałów) są przydatne do projektowania paneli.
  2. Przygotuj koktajl przeciwciał zawierający pożądane przeciwciała.
    1. W przypadku statycznego obrazowania PCLS dodaj 800 μl buforu barwiącego, 100 μl blokera Fc, 50 μl normalnej surowicy myszy i 50 μl normalnej surowicy szczura do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml. Do obrazowania żywych komórek zamiast buforu barwiącego należy użyć 800 μl pożywki Leibovitz (1x) zawierającej 10% FBS (Leibovitz-10).
    2. Dodaj przeciwciała, aby dostosować pożądane końcowe stężenie każdego przeciwciała. Przenieść roztwór przeciwciał do 3 cm naczynia i przechowywać w ciemności do momentu użycia do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.
      UWAGA: Końcowe stężenia muszą być zoptymalizowane dla każdego pojedynczego przeciwciała (zwykle 1 - 5 μg/ml).
  3. Wybrać PCLS z anatomicznym obszarem zainteresowania, takim jak duże drogi oddechowe lub obrzeża płuc, i umieścić w 3-centymetrowym naczyniu zawierającym 1 ml roztworu przeciwciał
    4. .
  4. Plamić PCLS w ciemności, na lodzie, kołysząc powoli przez 30 lub 60 minut.
  5. W przypadku statycznego obrazowania PCLS należy przejść do sekcji 4. W przypadku obrazowania żywych komórek przejdź do sekcji 5.

4. Obrazowanie statyczne PCLS

  1. Po 60 minutach inkubacji PCLS z przeciwciałami wyjmij roztwór przeciwciała z naczynia i dwukrotnie przepłucz plastry 1 ml lodowatego PBS.
  2. Odpipetować 50 μl PBS na okrągłym naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 3 cm. Za pomocą szpatułki lub pędzla przenieś poplamione PCLS na kroplę, delikatnie manipulując plasterkiem, aż będzie płaski i rozprowadzony. Wyjmij PBS za pomocą pipety. Plasterek powinien leżeć tak płasko, jak to możliwe. Powyższe procedury należy wykonać szybko, aby uniknąć fotowybielania.
  3. Umieść 1 kroplę podłoża montażowego o temperaturze pokojowej na plasterku i delikatnie wrzuć szklane szkiełko nakrywkowe do zagłębienia talerza. Przechowywać PCLS w ciemności w temperaturze 4 °C przez maksymalnie godzinę przed obrazowaniem.
  4. Podczas oglądania pod mikroskopem konfokalnym należy użyć obiektywu 20X (patrz Lista materiałów). Użyj narzędzia "kafelki", aby zlokalizować i zaznaczyć krawędzie tkanki w ustawieniu "wypukła powłoka". Pomoże to skrócić czas skanowania kafelków.
  5. Ustawiając zakres stosu z, sprawdź w wielu obszarach wycinka, zwłaszcza wzdłuż krawędzi, czy ustawione zakresy są odpowiednie.
    UWAGA: Zakres z prawdopodobnie będzie musiał być większy niż grubość samej tkanki, ponieważ bardzo trudno jest sprawić, aby tkanka leżała całkowicie płasko. Na przykład w przypadku PCLS o grubości 150 μm zakres stosów z będzie prawdopodobnie musiał być ustawiony na 200–250 μm, aby uwzględnić nierówności i krzywe w warstwie. W zależności od zakresu z-stack i wielkości tkanki, każdy pełny skan płuc zajmie od 7 do 12 godzin przy obiektywie 20X. Każde płuco jest wyjątkowe, a ustawienia muszą być dostosowane do każdego eksperymentu.

5. Obrazowanie PCLS na żywo

  1. Po 30 minutach inkubacji PCLS z przeciwciałami wyjmij roztwór przeciwciała z naczynia i dwukrotnie opłucz plastry 1 ml zimnego Leibovitz-10.
  2. Odpipetować świeże 50 μl Leibovitz-10 do jednej szczeliny w komorze nakrywkowej (8 szczelin). Za pomocą szpatułki przenieś PCLS na podłoże, delikatnie manipulując nim, aż plasterek będzie płaski i rozłożony. Powyższe procedury należy wykonać szybko, aby uniknąć fotowybielania.
  3. Usunąć 50 μl podłoża za pomocą pipety. Plasterek ma leżeć tak płasko, jak to możliwe.
    UWAGA: Dopuszczalne jest, jeśli krawędzie plastra są odchylone pionowo do ściany komory. Ponadto, jeśli jest dostępny, metalowy platynowy ciężarek może być użyty do zakotwiczenia plastra przed przejściem do następnego kroku. Zapoznaj się z załączoną listą materiałów, aby zapoznać się z przykładem drutu platynowego, który można ciąć i zginać na małe ciężary.
  4. W chłodni o temperaturze 4 °C zmieszać 100 μl macierzy zewnątrzkomórkowej o obniżonym czynniku wzrostu, wolnej od czerwieni fenolowej, ze 100 μl Leibovitz-10. Użyj do tego wstępnie schłodzonych końcówek pipet, w przeciwnym razie macierz zewnątrzkomórkowa zestali się w końcówce.
    UWAGA: Ten stosunek matrycy i pożywki (1:1) tworzy żel wystarczająco gęsty, aby utrzymać PCLS w warunkach hodowli tkankowej.
  5. Delikatnie odpipetować matrycę, aby wymieszać, i ostrożnie pipetować na wierzchu PCLS, upewniając się, że żel znajduje się na wierzchu wycinka płuca i że plasterek nie unosi się na wierzchu żelu. Żel powinien działać jak obciążnik, zakotwiczając PCLS na dnie płytki.
  6. Ostrożnie przenieść szkło nakrywkowe z komorą do inkubatora o temperaturze 37 °C i pozostawić matrycę do zestalenia się na ~5 minut.
  7. Przenieś całe komorowe szkło nakrywkowe na wstępnie ogrzany stolik mikroskopu konfokalnego. Utrzymywać temperaturę 37 °C w komorze przez cały czas trwania obrazowania. Dostarczanie CO2 nie jest wymagane podczas inkubacji komórek przy użyciu pożywki Leibovitz.
  8. Ustaw zakres stosu z i zakres kafelków na podstawie żądanego interwału między klatkami. Podczas oglądania pod mikroskopem konfokalnym należy użyć obiektywu 20X (patrz Lista materiałów). Użyj narzędzia "kafelek", aby oznaczyć obszar zainteresowania w tkance, używając ustawienia "wyśrodkowana siatka" (np. siatka wyśrodkowana 2x2).
  9. Ustawiając zakres stosu z, sprawdź w wielu obszarach wycinka, czy ustawione zakresy są odpowiednie.
    UWAGA: Zakres z będzie prawdopodobnie równy grubości tkanki. Każde płuco jest wyjątkowe, a ustawienia muszą być dostosowane do każdego eksperymentu. Kafelki 2x2 i 10 stosów z zazwyczaj dają ~1 klatkę/2 minuty. Upewnij się, że funkcja automatycznego ustawiania ostrości jest aktywna przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zminimalizować dryf x-y i z-drift w okresie obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zidentyfikować lokalizację dwóch subpopulacji DC, CD1bhi cDCs oraz CD103+ cDCs, wykonano cięcia PCLS z myszy C57BL/6 i poddano je barwieniu przeciwciałami monoklonalnymi (mAbs) specyficznymi dla CD11c, CD8, CD103 oraz CD324 (E-kadheryna). Przeciwciała przeciwko CD324 barwią komórki nabłonka dróg oddechowych, a CD8 jest prezentowany na makrofagach i neutrofilach, ale nie na cDCs8. Pozwoliło nam to odróżnić cDCs od makrofagów CD1c+

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół został pierwotnie opracowany w celu wizualizacji lokalizacji dwóch podzbiorów cDC w płucach. Jednak protokół ten można łatwo dostosować do badania wielu różnych typów komórek, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek i trójwymiarowej architektury płuc. Ta ostatnia cecha jest istotną zaletą w porównaniu z systemami hodowli komórkowych i ułatwia identyfikację rzadkich typów komórek. Metoda opiera się na wytwarzaniu PCLS z płuc i odpowiedniej kombinacji przeciwciał w celu identyfikacji określon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Jeffowi Tuckerowi, Erice Scappini i Agnes Janoshazi za pomoc w mikroskopii, Ligon Perrow za zarządzanie kolonią myszy, Jun Chen i Michaelowi Sandersonowi za pomoc przy wycinarce tkanek, a także Michaelowi Fesslerowi i Derekowi Cainowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez wewnętrzny oddział NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), który z kolei jest sponsorowany przez Departament Zdrowia i Opieki Społecznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy C57BL/6JJackson Laboratory000664
Transgeniczne myszy Prox1-TdTomato Laboratorium Jacksona018128B6; 129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II TCR X Nur77-GFP transgeniczne myszy specyficzne dla OVAJackson Laboratory004194, 016617B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J 
Myszy z nokautem Rag1Jackson Laboratory002216B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Albumina jaja kurzego, Low Endo, oczyszczonaWorthington Biochemical CorporationLS003059
Lipopolisacharydy z Escherichia coliSigma-Aldrich Co.L2630-25MG
Rurka polietylenowa (niesterylna) 100 ftBD Systemy diagnostyczne427421Średnica wewnętrzna 0,86 mm, średnica zewnętrzna 1,27 mm
Sito GeneMate GQA Agaroza niskotopliwaBioExpressE-3112-1252% roztwór rozpuszczony w PBS w temperaturze 70 & stopni; C i utrzymywane w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Compresstome VF-300Instrumenty precyzyjne, Inc.VF-300
Mikroskopia elektronowapodwójną krawędzią ze stali nierdzewnej72000Jednorazowe; 250 / pudełko. Ostrze należy wymieniać dla każdego płuca.
Krazy Glue Uniwersalny żel błyskawicznyVWR500033-484Powszechnie dostępny za 3 USD za tubę w lokalnych drogeriach 
Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowejThermoFisher Scientific21083027
Normalna surowica szczura (NRS)Jackson ImmunoResearch Inc.012-000-120
Normalna surowica myszy (NMS)Jackson ImmunoResearch Inc.015-000-120
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyklonSH30071.03HI
Bufor barwiącyWyprodukowany w domuNie dotyczyPBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej, 0,1% NaN3, bloker pH 7,4
Fc (przeciwciała anty-CD16/32)Wyprodukowano w domuNie dotyczySupernatant hodowlanej linii komórkowej hybrydoma 2.4G2
Anty-mysi CD11b eFluor 450 eBioscience48-0112-80Przeciw myszom CD11b eFluor 450 (klon: M1/70) 
Anty-mysz CD11c Brilliant Violet 605BioLegend101237Brilliant Violet 605 anty-mysz CD11c (klon: M1/70)
Anty-mysia CD11c FikoerytrynaeBioscience12-0114-82PE sprzężona z anty-myszą CD11c (klon: N418)
Anty-mysia CD11c AllofikocyjaninaBD Phamingen550261Anty-mysia CD11c znakowana APC 9klon: HL3)
Anty-mysia fikoerytrynaCD88BioLegend135806PE anty-mysi CD88 (klon: 20/70)
Anty-mysia CD103 AllofikocyjaninaeBioscience17-1031-82Anty-mysia CD103 APC (klon: 2E7)
Anty-mysz CD90.2/Thy1.2 eF450eBioscience48-0902-82Anty-mysz CD90.2 eFluor 450 (klon: 53-2.1)
Anty-mysz CD172a/Sirp1a AllofikocyjaninaeBioscience17-1721-82Anty-mysz CD172a APC (klon: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421BD Horizon564188 BV421 mysz anty-E Cadherin (klon: 5E8 znany również jako 5E8-G9-B4)
Anty-mysz CD324 Alexa Fluor 488eBioscience53-3249-82Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (klon: DECMA-1)
Anty-mysz CD324 Alexa Fluor 647eBioscience51-3249-82Anti-CD324 (E-Kadheryna) Alexa Flour 647 (klon: DECMA-1)
Naczynia Microwell ze szklanym dnem 35 mm szalka Petriego, 14 mm Microwell, nr 1.5 szkło osłonoweMatTek CorperationP35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Komorowa szklana osłonaThermoFisher Scientific155411PK Opakowanie 16 szt
Szkiełko nakrywkowe 15 mm, nr 1,5 Grubość szkłaMatTek CorperationPCS-1.5-15
Bare Platinum WireWorld Precision InstrumentsPTP201Średnica 0,020" (0,5 mm) pocięte na kawałki o długości ~1 cm i wygięte w kształt litery "L"
ProLong Gold AntifadeMountant ThermoFisher ScientificP36934Trzymaj w 4 & stopniach; C, przed użyciem rozgrzać do temperatury pokojowej.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Podstawna membrana membranowa, bez czerwieni fenolowej, *LDEV-FreeCorning356231
Wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy Zeiss 880Carl ZeissZen Black wersja 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0,8 M27 nadaje obiektywCarl Zeiss420650-9901-000
, z Sciences . Oprogramowanie

Bibliografia

  1. Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
  2. Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
  3. Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
  4. Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
  5. Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
  6. Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
  7. Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
  8. Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
  9. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
  10. Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
  11. Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
  12. Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
  13. Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
  14. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
  15. Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
  16. Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93(2006).
  17. Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
  18. Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
  19. Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
  20. Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
  21. Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Precyzyjnie ci te plastry p uckrojenie tkanki p ucnejmikroskopia konfokalnacytometria przep ywowalokalizacja kom rek odporno ciowychmigracja kom rek dendrytycznychbarwienie przeciwcia amiobrazowanie ywych kom rekinflacja p uc agarozprzygotowanie tkanki
Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.