Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Podsumowanie

Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.

Streszczenie

Technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zrewolucjonizowały charakter badań biologicznych. Spośród nich sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) stało się potężnym narzędziem do analizy ekspresji genów i mapowania transkryptomu. Jednak obsługa zestawów danych RNA-Seq wymaga wyrafinowanej wiedzy obliczeniowej i stanowi nieodłączne wyzwanie dla badaczy biologii. To wąskie gardło zostało złagodzone przez projekt Galaxy o otwartym dostępie, który umożliwia użytkownikom bez umiejętności bioinformatycznych analizowanie danych sekwencyjnych RNA, a także przez Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), pakiet do analizy terminów Gene Ontology (GO), który pomaga uzyskać znaczenie biologiczne z dużych zbiorów danych. Jednak dla początkujących użytkowników i amatorów bioinformatyki samodzielna nauka i zapoznanie się z tymi platformami może być czasochłonne i zniechęcające. Opisujemy prosty przepływ pracy, który pomoże badaczom C. elegans wyizolować RNA robaka, przeprowadzić eksperyment RNA-Seq i przeanalizować dane za pomocą platform Galaxy i DAVID. Protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące korzystania z różnych modułów Galaxy w celu uzyskania dostępu do surowych danych NGS, kontroli jakości, dopasowania i różnicowej analizy ekspresji genów, prowadząc użytkownika za pomocą parametrów na każdym kroku w celu wygenerowania listy genów, która może być badana pod kątem wzbogacenia klas genów lub procesów biologicznych za pomocą DAVID. Ogólnie rzecz biorąc, spodziewamy się, że ten artykuł dostarczy informacji badaczom C. elegans podejmującym po raz pierwszy eksperymenty z sekwencją RNA, a także częstym użytkownikom przeprowadzającym niewielką liczbę próbek.

Wprowadzenie

Pierwsze sekwencjonowanie genomu ludzkiego, przeprowadzone przy użyciu metody sekwencjonowania dideoksynukleotydowego Freda Sangera, trwało 10 lat i kosztowało szacunkowo 3 miliardy USD^1,2. Jednak w nieco ponad dekadę od swojego powstania technologia sekwencjonowania następnej generacji (Next-Generation Sequencing, NGS) umożliwiła zsekwencjonowanie całego ludzkiego genomu w ciągu dwóch tygodni za kwotę 1 000 USD. Nowe instrumenty NGS, które pozwalają na coraz szybsze gromadzenie danych sekwencyjnych z niesamowitą wydajnością, wraz z gwałtownym spadkiem kosztów, rewolucjonizują współczesną biologię w niebywały ....

Protokół

1. Izolacja RNA

1. Środki ostrożności
   1. Przetrzyj całą powierzchnię roboczą, instrumenty oraz pipety, używając dostępnego w handlu sprayu do usuwania RNaz, aby wyeliminować obecne RNazy.
   2. Przez cały czas należy nosić rękawiczki, regularnie wymieniając je na nowe podczas poszczególnych etapów protokołu.
   3. Należy używać wyłącznie końcówek z filtrem i przechowywać wszystkie próbki w lodzie tak długo, jak to możliwe, aby uniknąć degradacji RNA.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne dane z platform NGS, kluczowe jest rozpoczęcie pracy z wysokiej jakości RNA. Metody izolacji i przygotowania RNA różnią się w zależności od....

Wyniki

U C. elegans eliminacja komórek macierzystych linii płciowej (GSCs) wydłuża czas życia, zwiększa odporność na stres i podnosi poziom tłuszczu w organizmie^24,28. Utrata GSCs, wywołana ablacją laserową lub mutacjami takimi jak glp-1, prowadzi do wydłużenia czasu życia poprzez aktywację sieci czynników transkrypcyjnych²⁹. Jednym z takich czynników jest TCER-1, który koduje homolog u nicieni l.......

Dyskusja

Znaczenie platformy sekwencjonowania galaktyk we współczesnej biologii

Projekt Galaxy odegrał kluczową rolę w pomaganiu biologom bez wykształcenia bioinformatycznego w szybkim i wydajnym przetwarzaniu i analizowaniu danych sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ta publicznie dostępna platforma, niegdyś uważana za herkulesowe zadanie, sprawiła, że uruchamianie złożonych algorytmów bioinformatycznych w celu analizy danych NGS jest prostym, niezawodnym i łatwym procesem. Oprócz szerokiej gamy n.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RNaza w sprayu	Fisher Scientific	21-402-178
Trizol	Ambion	15596026
Sonicator	Sonics Vibra Cell	VCX130
	Chloroform Eppendorf	5415C
	Sigma Aldrich	288306
2-propanol	Fisher Scientific	A416P-4
Etanol	Decon Labs	2705HC
Woda wolna od RNaz	Fisher Scientific	BP561-1
	Agilent	G2940CA
Mac/PC

Wirówka Bioanalizator