Zastosowanie całościowej metody immunohistochemicznej do badania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus

Summary

Całościowe podejście immunohistochemiczne, do wizualizacji ekspresji białka neurofilamentu w pozawątrobowym przewodzie żółciowym u Suncus murinus. jest prezentowane tutaj. Protokół ten może być wykorzystany do analizy unerwienia wszystkich narządów trzewnych u S. murinus lub innych gatunków.

Abstract

Ta praca szczegółowo opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego całej góry, wykorzystując przeciwciało białka neurofilamentu do oznaczania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus (S. murinus ). Najpierw próbkę wypreparowano z S. murinus i utrwalono w 4% paraformaldehydzie (PFA). Po drugie, przeprowadzono obróbkę enzymatyczną i potencjalną endogenną inaktywację peroksydazy. Próbka była następnie wystawiona na działanie pierwszorzędowego przeciwciała, przeciwciała przeciwko białku neurofilamentowemu, przez 3-6 dni. Następnie inkubowano go z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową. Reakcja barwna została ujawniona przez reakcję próbki z substratem 3,3'-diaminobenzydyny (DAB). Metodę tę można zastosować do analizy unerwienia wszystkich narządów trzewnych. Co więcej, protokół ten można również dostosować do testowania innych przeciwciał neuronalnych, ale najpierw należy przeprowadzić optymalizację przeciwciał. Ta metoda została pierwotnie wprowadzona przez Kuratani i Tanaka^1,2,3.

Introduction

Ryjówka zwyczajna, Suncus murinus, należy do rzędu Insectivora i rodziny Soricidae. Ten maleńki ssak występuje w całej Azji Południowo-Wschodniej i zamieszkuje domy oraz obszary trawiaste, które znajdują się w pobliżu ludzkich siedzib lub zagród dla bydła⁴. Gatunek ten wykazuje ogólne cechy morfologiczne bardziej podobne do ludzi niż inne zwierzęta laboratoryjne, takie jak mysz, szczur i królik⁵. Wcześniej, barwienie immunologiczne w całości za pomocą markera neuronów obwodowych dla białka neurofilamentu S. murinus (NFP) było używane do oznaczania nerwów obwodowych w trzustce⁶, major duodenal papilla⁷, pylorus⁸, woreczek żółciowy⁵ i extrahepatic żółciowe drogi żółciowe⁹.

NFP to kompleks makromolekularny, który jest częścią dojrzałego cytoszkieletu neuronalnego. Białka związane z neurofilamentami pośredniczą w interakcjach między NFP a zygosomem. Zarówno funkcja enzymu, jak i struktura białek łącznikowych są regulowane przez NFP¹⁰. Kompleks NFP zbudowany jest z trzech polipeptydów: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) i NF-H (200 kDa). NFP można znaleźć w aksonach neuronalnych zarówno w ośrodkowym, jak i obwodowym układzie nerwowym. Wykazano, że przeciwciało anty-ludzkie NFP znakuje aksony ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Badania anatomiczne i elektrofizjologiczne wykazały, że zwieracz, pęcherzyk żółciowy i proksymalny przewód pokarmowy są ze sobą połączone^11,12,13,14. Jednak cechy morfologiczne ich połączeń neuronalnych nie zostały jeszcze określone.

Ta praca demonstruje użycie metody barwienia immunohistochemicznego całej góry do oznaczania unerwienia dróg żółciowych S. murinus przeciwciałem NFP.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Metropolitalnego w Tokio (IACUC). Zwierzęta były trzymane i traktowane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz Przewodnikiem opieki i wykorzystania zwierząt doświadczalnych Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Wykorzystaliśmy zwierzęta wyhodowane i utrzymywane w Laboratorium Morfologii Funkcjonalnej, Wydział Nauk o Zdrowiu w Tokio, Japonia.

1. Opieka nad zwierzętami i ich trzymanie

1. Pozyskać 7 S. murinus (3 samice i 4 samce o wadze 70-90 g) z zamkniętej kolonii hodowlanej.
2. Po odsadzeniu (20 dni po urodzeniu) należy umieścić S. murinus w klatkach z tworzywa sztucznego wyposażonych w drewnianą budkę lęgową zawierającą paski papieru. Trzymaj je w konwencjonalnie klimatyzowanym pomieszczeniu dla zwierząt: 23-27 °C, bez kontroli wilgotności i cykl 12:12 godzin światło: ciemność. Dostarczaj komercyjne pelety z pstrąga i wodę ad libitum.

2. Przygotowanie tkanek

1. Aby przygotować 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA), rozpuść 40 g PFA w 1,000 ml 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4). W dygestorium mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. Przechowywać 4% PFA O/N w temperaturze 4 °C.
   Ostrzeżenie: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).
2. Aby wykonać perfuzję i utrwalić zwierzę, znieczulij je eterem, a następnie wstrzyknij dootrzewnowo somnoopentyl (pentobarbital sodu, 0,6 ml/kg masy ciała).
3. Po całkowitym narkotyzowaniu zwierzęcia otwórz jamę brzuszną skalpelem, tworząc nacięcie brzucha w linii środkowej o długości 3 cm. Podczas nacinania żyły głównej dolnej w celu wykrwawienia, wprowadzić cewnik wstecznie do aorty brzusznej na poziomie bezpośrednio powyżej rozwidlenia tej tętnicy do tętnic biodrowych wspólnych.
4. Wstrzyknąć somnopentyl (pentobarbital sodu, 1,0 ml/kg masy ciała). Po całkowitej eutanazji perfaktor z 0,01 M PBS (pH 7,4), a następnie z 4% PFA w dygestorium.
5. Po perfuzji wstrzyknij 2-3 ml białego lateksu neoprenowego (rozcieńczyć biały lateks neoprenowy 3:2 wodą destylowaną (DW)) w celu oznaczenia naczyń krwionośnych.
6. Wyodrębnij narządy jamy brzusznej, w tym wątrobę, woreczek żółciowy, wspólny przewód żółciowy, dwunastnicę i trzustkę en bloc, wraz z powiązanymi nerwami i naczyniami.
7. Wstrzyknąć około 0,1 ml niebieskiego lateksu neoprenowego (dodać kroplę niebieskiego atramentu do 10 ml rozcieńczonego białego lateksu neoprenowego) do pęcherzyka żółciowego, aby oznaczyć układ żółciowy.
8. Po utrwaleniu przez noc z 4% PFA w temperaturze 4 °C w celu barwienia immunologicznego całego wierzchodu.
   Uwaga: PFA jest toksyczny. Unikaj bezpośredniego obchodzenia się z PFA. PFA powinien być stosowany w dygestorium.

3. Immunohistochemia w całości

Uwaga: Przez cały czas trwania protokołu, w tym podczas mycia, inkubacji przeciwciał i barwienia, próbka musi pozostać na nutatorze, delikatnie kołysząc się w temperaturze RT lub 4°C^.

1. Dzień 1: Leczenie enzymatyczne i inaktywacja potencjalnej endogennej peroksydazy
   1. Przygotowany preparat należy przemyć za pomocą DW 4x przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w szklanej fiolce o odpowiedniej wielkości. Delikatnie kołysz próbką na nutatorze, aby usunąć PFA. Unikaj uszkodzenia próbki podczas wymiany roztworów.
   2. Aby przygotować 1% (w/v) kwasu ortoperiodycznego, rozpuść 1 g kwasu ortoperiodycznego w 100 ml DW.
   3. Inkubować próbkę w 1% kwasie ortoperiodycznym przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zapobiec jakiejkolwiek wewnętrznej reakcji peroksydazy.
   4. Przygotować 0,004% (w/v) papainy, rozpuszczając 0,004 g papainy w 100 ml buforu Tris-HCl o stężeniu 0,025 mol/l (pH 7,6).
   5. Myć próbkę DW przez 10 minut w temperaturze suchej temperatury.
   6. Inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 0,004% papainie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w kąpieli o stałej temperaturze z delikatnym kołysaniem.
   7. Myć próbkę DW przez 50-60 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Przechowywać próbkę w 4% PFA w temperaturze 4 °C O/N.
2. Dzień 2: Leczenie enzymatyczne
   1. Przechowywaną próbkę przemyć DW 4 razy po 1 godzinie w temperaturze pokojowej.
   2. Inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 0,004% papainie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w kąpieli o stałej temperaturze z delikatnym kołysaniem.
   3. Umyć próbkę DW przez 50-60 minut w temperaturze pokojowej. Przechowywać próbkę w 4% PFA w temperaturze 4 °C O/N.
3. Dzień 3: Zabieg zamrażania
   1. Przechowywaną próbkę przemyć DW 4x przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, jak wyżej.
   2. Przygotować 2,5% (w/v), 5% (w/v) i 10% (w/v) sacharozy, rozpuszczając odpowiednio 2,5 g, 5 g i 10 g sacharozy w 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
   3. Zanurz próbkę w 2,5% (w/v), 5% (w/v) i 10% (w/v) sacharozie na 30 minut każdy.
   4. Zamrażać próbkę w temperaturze -20 °C przez 30-60 minut, a następnie całkowicie rozmrozić ją w temperaturze pokojowej; powtórzyć cykl 3 razy.
   5. Aby przygotować 2% Triton X-100 (v/v), dodaj 2 ml Triton X-100 do 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
   6. Przechowywać próbkę w 2% Triton X-100 w temperaturze 4 °C O/N.
4. Dzień 4: Inkubacja przeciwciał pierwotnych
   1. Przygotować roztwór rozcieńczający przeciwciała pierwszorzędowego, rozpuszczając 0,2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,3 ml Triton X-100 i 0,1 g azydku sodu w 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
      Uwaga: Azydek sodu jest silnie toksyczny. Należy unikać wdychania i dotykania. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
   2. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (NFP) w stosunku 1:600 w powyższym buforze do rozcieńczania (krok 3.4.1). Inkubować próbkę z przeciwciałem NFP w temperaturze 4 °C przez 3-6 dni, delikatnie kołysząc próbkę na nutatorze. Większe okazy będą wymagały wydłużenia czasu inkubacji.
5. Inkubacja przeciwciał wtórnych
   1. Przemyć próbkę w PBS 4x przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.
   2. Przygotować roztwór rozcieńczający dla przeciwciała drugorzędowego, rozpuszczając 0,2 g BSA i 0,3 ml Triton X-100 w 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
   3. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (sprzężone z peroksydazą, oczyszczone z powinowactwa owcze przeciwciało anty-mysie IgG-HRP) w stosunku 1:600 w buforze rozcieńczającym (etap 3.5.2). Inkubować próbkę z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze 4 °C przez 3 dni i delikatnie kołysać próbkę na nutatorze.
6. Zabarwienie
   1. Przygotować roztwór barwiący DAB, dodając 0,002 g czterochlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) do 100 ml buforu Tris-HCl o stężeniu 0,05 mol/l (pH 7,6) pod dygestoriami, utrzymując roztwór w ciemności.
   2. Umyć próbki w RT w PBS 4x przez 1 godzinę każda.
   3. Dodać 10 μl 30%_H2O2do świeżo przygotowanego roztworu barwiącego DAB i inkubować z roztworem w temperaturze 4 °C O/N lub przez 3 dni, delikatnie kołysząc nutatorem.
   4. Zatrzymaj reakcję, umieszczając próbkę w PBS z 0,04% azydkiem sodu po osiągnięciu optymalnej intensywności barwienia.
      UWAGA: Do tego etapu należy unikać stosowania azydku sodu, ponieważ hamuje on peroksydazę chrzanową.
7. Obrazowanie zabarwionej tkanki
   1. Ostrożnie przenieść próbkę do naczynia ze szkła Petriego (5 cm wysokości, 10 cm średnicy) zawierającego PBS. Rejestruj obrazy z pełnym zamontowaniem za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym.
      UWAGA: Cała zabarwiona tkanka powinna być obrazowana, gdy jest całkowicie zanurzona w PBS na przezroczystym szklanym naczyniu.

Results

Rysunki 1-4 pokazują typowe wyniki dla NFP-dodatnich włókien nerwowych w pozawątrobowych drogach żółciowych u S. murinus. Przeciwciało przeciwko NFP w sposób powtarzalny oznaczało unerwienie na całym obrazie pozawątrobowych dróg żółciowych (Ryc. 1), pęcherzyka żółciowego (Ryc. 2), górny przewód żółciowy (Ryc. 3) i obszar brodawki dwunastnicy (Ryc. 4), z wysoką swoist...

Discussion

W pracy opisano eksperymentalną procedurę wizualizacji unerwienia pozawątrobowych dróg żółciowych za pomocą przeciwciała przeciwko białku neurofilamentu. Protokół ten został zaadaptowany z protokołu opisanego przez Kuratani i Tanaka ^1,2,3.

W tym eksperymencie zaplanuj harmonogram każdego z eksperymentów, ponieważ barwienie całego mocowania trwa przez 2-3 tygodnie. Naczynie zawierające tkankę musi być ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
kwas ortoperiodyczny	Wako	162-00732
papaina	Wako	164-00172
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Wako	010-15131
azydek sodu	Nacalai Tesque	312-33
przeciwciało przeciwko białku neurofilamentu (NFP)	Dako	M0762, partia 089, klon: 2F11
sprzężona z peroksydazą Oczyszczone powinowactwem owce anty-mysie IgG-HRP	MBL	Code 330
Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)	Wako	349-00903
imidazol	Sigma	I-0125