Artykuł metodologiczny

Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach

DOI:

10.3791/55486

⸱

16 marca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt przedstawia protokoły zastosowania nowych genetycznie kodowanych sond tlenku azotu (NO•) (geNOps) do monitorowania fluktuacji NO• pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Powstawanie NO• wywołane przez Ca2+ na poziomie pojedynczych komórek śródbłonka uwidoczniono poprzez połączenie geNOps z chemicznym czujnikiem Ca2+.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tlenek azotu (NO•) to mały rodnik, który pośredniczy w wielu ważnych funkcjach komórkowych u ssaków, bakterii i roślin. Pomimo istnienia dużej liczby metod wykrywania NO• in vivo i in vitro, monitorowanie NO• w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych komórek jest bardzo trudne. Fizjologiczne lub patologiczne skutki NO• są determinowane przez rzeczywiste stężenie i czas przebywania tego rodnika. W związku z tym metody, które pozwalają na jednokomórkowe wykrywanie NO• są wysoce pożądane. Niedawno rozszerzyliśmy paletę wskaźników NO•, wprowadzając pojedyncze sondy tlenku azotu (NO•) (geNOps) na bazie białek fluorescencyjnych, które bezpośrednio reagują na wahania komórkowego NO•, a tym samym odpowiadają na tę potrzebę. Tutaj pokazujemy zastosowanie geNOps do oceny wewnątrzkomórkowych sygnałów NO• w odpowiedzi na dwie różne chemiczne cząsteczki uwalniające NO•. Nasze wyniki potwierdzają również, że świeżo przygotowana 3-(2-hydroksy-1-metylo-2-nitrozohydrazyno)-N-metylo-1-propanamina (NOC-7) ma znacznie wyższy potencjał wywoływania zmian wewnątrzkomórkowych poziomów NO• w porównaniu z nieorganicznym donorem NO• nitroprusydkiem sodu (SNP). Ponadto przeprowadzono dwukolorowe obrazowanie żywych komórek przy użyciu zielonych geNOps (G-geNOp) i chemicznego wskaźnika Ca2 + fura-2 w celu wizualizacji ścisłej regulacji tworzenia się Ca 2 + zależnego od Ca2 + NO• w pojedynczych komórkach śródbłonka. Te reprezentatywne eksperymenty pokazują, że geNOpy są odpowiednimi narzędziami do badania generowania i degradacji sygnałów NO• w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach w różnych konfiguracjach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno opracowaliśmy nową klasę genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych NO•, zwanych geNOps1. Czujniki te składają się z prosto zbudowanej, pochodzącej od bakterii, domeny wiążącej NO• 2, która jest sprzężona z odrębnym wariantem białka fluorescencyjnego (FP) 3 (cyjan, zielony lub pomarańczowy FP). NO• wiązanie z centrum żelaza niehemowego(II) class4 w geNOps natychmiast zmniejsza intensywność fluorescencji1. Co ważne, fluorescencja geNOps szybko i w pełni się regeneruje, gdy wewnątrzkomórkowy poziom NO• spada1. W związku z tym geNOps umożliwiają obrazowanie w czasie rzeczywistym (sub)komórkowych fluktuacji NO•. Chociaż mechanizm wykrywania NO• geNOps pozostaje do tej pory niejasny, okazały się one doskonałymi reporterami NO•, a tym samym mają potencjał, aby otworzyć nową erę polichromatycznego, ilościowego bioobrazowania NO• o wysokich rozdzielczościach przestrzennych i czasowych1,5. Inne dostępne sondy fluorescencyjne NO• są oparte na małych związkach chemicznych, które muszą być załadowane do komórek i są nieodwracalnie modyfikowane przez NO•6. Dodatkowymi wadami małych fluoroforów wrażliwych na NO• są ich potencjalna cytotoksyczność i stosunkowo niska swoistość, co utrudnia ich stosowanie w sposób wiarygodny, analityczny i rozstrzygający7,8,9. Chociaż efektywne wykorzystanie genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych wymaga wydajnych technik transferu genów, genetycznie kodowane czujniki oparte na FP okazały się niezbędnymi narzędziami, które zrewolucjonizowały nasze zrozumienie wewnętrznego funkcjonowania komórek10,11. Przed opracowaniem pojedynczych geNOps opartych na FP skonstruowano czujnik NO• oparty na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET), określany jako NOA-112. Sato i in. zaprojektowali tę wyrafinowaną sondę, która składa się z dwóch podjednostek wrażliwej na NO• rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGC), obie sprzężone z czujnikami opartymi na FRET, raportującymi poziomy cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP)12. Ponieważ ta sonda reaguje na cGMP, tylko pośrednio wykrywa wewnątrzkomórkowe fluktuacje NO•12. Chociaż NOA-1 reaguje na podwyższenie NO• w zakresie nanomolowym, narzędzie to nie było do tej pory często używane, prawdopodobnie ze względu na ograniczenia dotyczące dostępności i praktyczności tego nieporęcznego czujnika dwudzielnego.

Wszechstronne funkcje NO•, które wpływają na podstawowe procesy biologiczne, zostały dobrze scharakteryzowane13,14. Wiele badań dowiodło, że stężenie NO• w komórkach i subdomenach determinuje los komórek w zdrowiu i chorobach14,15,16. U ssaków NO• jest głównie wytwarzany enzymatycznie w różnych typach komórek przez dobrze scharakteryzowaną rodzinę syntazy tlenku azotu (NOS)17. Do tej pory opisano trzy izoformy NOS: 18,19,20; są to śródbłonkowe NOS zależne od Ca2+/kalmoduliny (eNOS lub NOS-3)18 i neuronalne NOS (nNOS lub NOS-1)19 oraz Ca2+/calmodulin-independent konstytutywnie aktywny indukowany NOS (iNOS lub NOS-2)20. Co więcej, zasugerowano również istnienie mitochondrialnego NOS (mtNOS)21. Jednak mtNOS jest uważany za wariant splicingu nNOS i dlatego nie jest oddzielnie klasyfikowany jako isoform21. Inną izoformą, oprócz tych w komórkach ssaków, jest tzw. bakteryjny NOS (bNOS), występujący głównie w bakteriach Gram-dodatnich22. Enzymatyczna produkcja NO• jest ściśle kontrolowana i zależy od dostępności kilku kofaktorów, takich jak fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), tetrahydrobiopteryna (BH4), tlen cząsteczkowy i L-arginina17. Aminokwas kationowy L-arginina jest substratem, który jest przekształcany w L-cytrulinę po NO• production17. Oprócz wysoce regulowanego enzymatycznego wytwarzania NO•, postulowano, że rodnik może być redukowany nieenzymatycznie z puli azotynów przez mitochondria w warunkach niedotlenienia23. Gdy NO• zostanie wytworzony w komórce, może swobodnie dyfundować przez błony biologiczne14,15. Jednak bardzo krótki okres półtrwania tego rodnika zależy głównie od warunków środowiskowych, a różne szlaki i reakcje chemiczne skutecznie degradują poziomy NO•24. Ostatecznie powstawanie, dyfuzja i degradacja NO• zależy od różnych parametrów środowiskowych, które determinują efektywne stężenie wysoce aktywnej biologicznie cząsteczki24.

Technologia geNOps pozwala na bezpośrednie wykrywanie fluktuacji (sub)komórkowego NO•1 i dlatego jest odpowiednia do ponownego zbadania i odkrycia mechanizmów odpowiedzialnych za gromadzenie i dekompozycję komórkowych sygnałów NO•. W tym miejscu przedstawiamy proste protokoły i reprezentatywne wyniki dotyczące wykorzystania geNOps do wizualizacji egzogennie wywołanych i endogennie generowanych profili NO• na poziomie poszczególnych komórek. Co więcej, technologia geNOps może zostać zaadaptowana do zastosowania w innych systemach modeli komórkowych w celu badania złożonych wzorców powstawania, dyfuzji i degradacji NO• w odpowiedzi na różne bodźce komórkowe i stresy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i roztworów chemicznych

  1. Przygotować bufor magazynujący zawierający 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM NaHCO3, 0,44 mM KH2PO4, 0,34 mM Na2HPO4, 10 mM D-glukozy, 2 mM L-glutaminy, 1x witaminy MEM, 1x aminokwasy MEM, 1% paciorkowiec i 1% amfoterycyna B. Rozpuść wszystkie składniki w wodzie destylowanej i mieszaj bufor przez 20 minut za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze pokojowej. Dostosować pH do 7,44 za pomocą 1 M NaOH. Po kroplowym dodaniu NaOH zmierz pH za pomocą pH-metru, ciągle mieszając.
  2. Przygotować fizjologiczny bufor zawierający Ca2+, który składa się ze 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy i 10 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH, jak opisano w kroku 1.1.
  3. Przygotuj bufor wolny od Ca2+, który składa się z tych samych składników, które wymieniono w kroku 1.2. Użyj 1 mM EGTA zamiast 2 mM.
  4. Rozpuścić Fura-2AM w DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM. Podwielokrotność roztworu podstawowego umieścić w szczelnie zamkniętych fiolkach i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego miesiąca. W przypadku zamrożenia pozostawić roztwór podstawowy do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę, chroniąc go przed światłem. Rozcieńczyć roztwór podstawowy Fura-2AM w 1 ml buforu do przechowywania (krok 1.1) do uzyskania końcowego stężenia 3,3 μM.
  5. Przygotować 1 ml 100 mM roztworu podstawowego histaminy w wodzie destylowanej (pH 7,0). Rozcieńczyć 100 mM roztworu podstawowego histaminy w 100 ml buforu fizjologicznego zawierającego Ca2+ do końcowego stężenia 100 μM histaminy.
  6. Rozpuścić Nω-nitro-L-argininę (L-NNA) w 100 ml buforu fizjologicznego zawierającego wapń, aby uzyskać końcowe stężenie 300 μM. Roztwory przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę, aż do całkowitego rozpuszczenia L-NNA.
  7. Rozpuścić 10 mg NOC-7 w wodzie destylowanej (pH 7,0) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mM. Podwielokrotność roztworu podstawowego w małych porcjach umieścić w szczelnie zamkniętych fiolkach i natychmiast przechowywać w temperaturze -70 °C. Rozcieńczyć roztwór podstawowy NOC-7 w buforze fizjologicznym do uzyskania końcowego stężenia 10 μM NOC-7,
    UWAGA: NOC-7 to mały związek chemiczny, który spontanicznie uwalnia NO z krótkim okresem półtrwania. robocze składające się z NOC-7 należy zawsze przygotowywać tuż przed każdym eksperymentem.
  8. Sporządzić 1 mM roztwór nitroprusydku sodu (SNP) w fizjologicznym buforze wapnia i przygotować rozcieńczenie 10 μM.
    UWAGA: Zawsze przygotuj małe ilości (~10 ml) roztworów NO-donor ze względu na szybkie tempo degradacji.
  9. Przygotować buforowany roztwór fosforanowy (PBS) składający się ze 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,2 mM Na2HPO4 i 1,5 mM KH2PO4. Dostosuj wartość pH do 7,44 za pomocą NaOH/HCl.

2. Przygotowanie komórek

UWAGA: Aby osiągnąć jednolitość w wydajności pomiaru tlenku azotu (NO•) w pojedynczych komórkach za pomocą geNOps, komórki muszą być wstępnie inkubowane z buforem zawierającym żelazo(II)/witaminę C przed eksperymentami obrazowania, aby przywrócić Fe2+ w domenie wiążącej NO•sond NO•. W przypadku komórek EA.hy926 i HEK293 inkubacja przez 20 minut z roztworem wzmacniającym żelazo(II) prowadzi do pełnej aktywacji czujników NO•

.
  1. Nasiona 5,5 x 105 komórek EA.hy926 lub HEK293 na następny dzień lub 3,5 x 105 komórek na następny dzień, na 30-milimetrowych mikroskopowych szkłach nakrywkowych do studzienki na 6-dołkowej płytce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2,
    UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące adenowirusowego zakażenia komórek ssaków i budowy wirusa zostały opisane przez Zhang i wsp.25. Ten krok nie dotyczy komórek HEK 293 stabilnie wykazujących ekspresję G-geNOp.
  2. Weź płodową surowicę cielęcą (FCS) i wolną od antybiotyków pożywkę zmodyfikowaną orłem Dulbecco (DMEM) i dodaj wektor wirusa związanego z adenowirusem typu 5 (AAV5) przenoszący gen kodujący G-geNOp (MOI: 500 dla komórek EA.hy926 daje prawie 100% komórek dodatnich; MOI: 1 jest wydajny dla komórek HEK293).
    UWAGA: Stosowanie wektorów wirusowych związanych z adenowirusem jest przypisane do grupy ryzyka 2. Do pracy z tym wektorem zazwyczaj wymagany jest poziom bezpieczeństwa biologicznego 2. W razie potrzeby infekcja wirusowa może być również przeprowadzona w pożywce zawierającej FCS. Alternatywnie, komórki mogą być przejściowo transfekowane za pomocą nośników na bazie lipidów1.
  3. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć komórki wstępnie ogrzanym (37 °C) PBS. Dodaj 1 ml pożywki DMEM/AAV5 do każdego dołka przez 1 godzinę. Ten krok nie ma zastosowania do komórek HEK 293 stabilnie eksprymujących G-geNOp.
  4. Dodać 1 ml 20% DMEM zawierającego FCS do każdej studzienki do końcowego stężenia 10% FCS. Nie usuwaj pożywki zawierającej AAV5 z komórek. Delikatnie rozhuśtać płytkę, aby homogenizować podłoże w studzienkach. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2 . Ten krok nie dotyczy komórek HEK 293 stabilnie eksprymujących G-geNOp.
  5. Po 48 godzinach umyj komórki wstępnie podgrzanym PBS. Następnie dodać 2 ml wstępnie ogrzanego buforu do przechowywania (sekcja 1.1) do każdej studzienki i inkubować komórki w pomieszczeniu RT przez co najmniej 1 godzinę, chroniąc je przed promieniowaniem świetlnym.
  6. Zastąp bufor do przechowywania 1 ml/studzienkę roztworu wspomagającego żelazo(II) o temperaturze pokojowej (RT). Inkubuj komórki dokładnie przez 20 minut w ciemności.
    UWAGA: Nie przekraczaj ani nie skracaj optymalnego czasu inkubacji, ponieważ może to wpłynąć na reakcję sond NO•
    7. .
  7. Raz przemyć komórki buforem do przechowywania i inkubować każdą studzienkę z 2 ml buforu do przechowywania przez co najmniej 2 godziny w suchej temperaturze w celu umożliwienia zrównoważenia komórek.
  8. Wymień bufor pamięci na 3,3 μM Fura-2AM w 1 ml buforze do przechowywania przez 45 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  9. Przemyć komórki dwukrotnie buforem do przechowywania i inkubować, ponownie przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić komórkom zrównoważenie.

3. Obrazowanie na żywo sygnałów NO• i Ca2+ w poszczególnych komórkach

  1. Zamocuj 30 mm szkiełko nakrywkowe pokryte komórkami EAhy.926 lub HEK293 (od kroku 2.1) w metalowej komorze perfuzyjnej i umieść je na mikroskopie. Podłączyć rurkę dopływową do zbiorników buforowych, a wypływ do pompy próżniowej. Zapewnić stały przepływ i unikać opróżniania szkiełka nakrywkowego.
  2. Rozpocznij perfuzję sterowaną grawitacyjnie fizjologicznym buforem wapnia (od kroku 1.2) za pomocą półautomatycznego systemu perfuzyjnego.
    UWAGA: Taki system składa się ze zbiorników buforowych, odpowiednich przewodów, zaworów magnetycznych, które są sterowane elektronicznie oraz pompy próżniowej (patrz rysunek 1B). Natężenie przepływu może wynosić od 1 do 3 ml/min, w zależności od wysokości zbiorników perfuzyjnych. W celu spójnego miejscowego stosowania leków, natężenie przepływu we wszystkich używanych zbiornikach powinno być w przybliżeniu równe. Należy to przetestować przed eksperymentami obrazowymi. Weź pod uwagę, że komórki śródbłonka reagują na zwiększone naprężenie ścinające, które może być wywołane przez rygorystyczną perfuzję.
  3. Włącz system obrazowania i pozwól na rozgrzanie wszystkich urządzeń przez 30 minut.
  4. Zdefiniuj ustawienia obrazowania za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Wybierz długość fali wzbudzenia 340 nm i 380 nm dla obrazowania fura-2 oraz 480 nm dla wzbudzającego G-geNOp. Aby zminimalizować wybielanie fluorescencyjne, zwiększ binning kamery do 4 i zmniejsz intensywność wzbudzenia oraz czasy ekspozycji. Patrz także kroki 3.6-3.8.
    UWAGA: Ustawienia i parametry obrazowania zależą od zastosowanych urządzeń, wydajności ładowania fury-2 i poziomów ekspresji G-geNOp.
  5. Wybierz obszar obrazowania, przesuwając tabelę xyz mikroskopu, aż kilka komórek fluorescencyjnych znajdzie się w ognisku. Następnie zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) za pomocą odpowiedniego narzędzia programowego. Ręcznie narysuj regiony obejmujące kilka całych pojedynczych komórek fluorescencyjnych na pole obrazowania. Ponadto zdefiniuj region tła o podobnym rozmiarze.
    UWAGA: Po uzyskaniu i zapisaniu obrazów, po zakończeniu procesu obrazowania można również zdefiniować zwrot z inwestycji w celu dalszej analizy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazowania (patrz Lista materiałów).
  6. Rozpocznij zbieranie danych na odwróconym i zaawansowanym mikroskopie fluorescencyjnym z zmotoryzowanym stolikiem na próbki i monochromatycznym źródłem światła. Na przemian wzbudzić przy 340 nm i 380 nm odpowiednio dla Fura-2AM i 480 nm dla G-geNOp. Ustaw odpowiednie czasy ekspozycji, aby dla wszystkich kanałów wyraźny sygnał fluorescencyjny był wykrywalny w czasie. Patrz także krok 3.4.
    UWAGA: Zależy to od intensywności światła wzbudzenia i łączenia kamery. Na przykład użyj 15% intensywności światła wzbudzenia, binningu kamery 4 i 150 ms dla 340 nm, 50 ms dla 380 nm i 300 ms dla 480 nm. Patrz także krok 3.4.
  7. Zebrać wyemitowane światło o długości fali 510 nm dla fura-2/am, 520 nm dla G-geNOp za pomocą kamery z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) z odpowiednim zestawem filtrów składającym się z wzbudnicy 500 nm, dichroicznej 495 nm i emitera 510-520 nm. Nagrywaj jedną klatkę co 3 sekundy.
  8. Zapisać pierwsze minuty (w razie potrzeby do 3 minut) w fizjologicznym buforzeCa2+ (1.2) w celu uzyskania linii podstawowej odpowiednich sygnałów fluorescencyjnych w czasie.
  9. Po zaobserwowaniu stabilnej fluorescencji wyjściowej należy przejść na 100 μM histaminy lub ATP (1 μM lub 100 μM) zawierającej fizjologiczny bufor Ca2+, aby stymulować komórki przez 3 min.
    UWAGA: Komórki EA.hy926, które reagują na agonistów, wykazują gwałtowny wzrost stosunku fura-2 (fluorescencja wzbudzona przy 340 nm podzielona przez fluorescencję wzbudzoną przy 380 nm) i wyraźny spadek sygnału fluorescencji G-geNOp.
  10. Przełącz się z powrotem na fizjologiczny bufor Ca2+ bez histaminy lub ATP i L-NNA na 5 minut, aby usunąć związki z komórek. Ten etap może być przedłużony do czasu całkowitego odzyskania zmian fluorescencji.
  11. Podawać 10 μM NOC-7 w fizjologicznym buforze Ca2+ przez 2 minuty za pomocą systemu perfuzyjnego. Donor NO silnie wpływa na fluorescencję G-geNOp, która zwykle zmniejsza się o >20% w odpowiedzi na 10 μM NOC-7. W komórkach EA.hy926 efekt NOC-7 jest około 3 razy silniejszy w porównaniu z wygaszaniem fluorescencji G-geNOp indukowanym przez agonistę.
  12. Wypłucz związek uwalniający NO• przez około 10 minut fizjologicznym buforem Ca2+ i przestań rejestrować po odzyskaniu podstawowej fluorescencji.

4. Analiza danych

  1. Eksport uzyskanych danych o średniej intensywności fluorescencji pojedynczych komórek w czasie do oprogramowania do analizy danych.
  2. Odejmij odpowiednie wartości tła i oblicz stosunek 340 nm do 380 nm odpowiednich sygnałów fura-2 każdej pojedynczej komórki w czasie.
  3. Odejmij wartości tła kanału G-geNOp, aby uzyskać rzeczywistą intensywność fluorescencji sondy NO (F) w czasie za pomocą dowolnego oprogramowania obliczeniowego.
  4. Przyjmij wyjściowe wartości fluorescencji jako F0 (F0 to fluorescencja sondy NO w czasie bez stymulacji). Patrz także krok 4.5 i rysunek 1C.
  5. Oblicz funkcję w czasie dla efektów wybielania fluorescencyjnego, korzystając z następującego równania: F0 = Fpoczątkowy•exp(-K•Czas) +F plateau. F początkowy: maksymalny sygnał fluorescencji po rozpoczęciu obrazowania; K: stała szybkości wybielania fluorescencyjnego w czasie; Plateau F: minimum fluorescencji osiągane przez wybielanie w czasie; Patrz również kroki 4.3-4.4 i rysunek 1C.
    UWAGA: W przybliżeniu można użyć wszystkich wartości fluorescencji w czasie przed i po stymulacji komórek. Dalsze szczegóły zostały określone przez Bentley i wsp.27.
  6. Aby znormalizować sygnał G-geNOp w czasie, oblicz 1-F/F0 (kroki 4.3-4.5). Zobacz rysunki 1C i 1D.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja jednokomórkowych profili NO• w odpowiedzi na przejściowo zastosowanych dawców NO

Użyliśmy klonu komórki HEK, która stabilnie wyraża G-geNOp (Rysunek 1A), aby uwidocznić sygnały NO• na poziomie pojedynczej komórki w odpowiedzi na dwa różne małe związki chemiczne uwalniające NO, NOC-7 i SNP. Dawcy NO• byli kolejno nakładani na komórki i usuwani z nich podczas obrazowania przy użyciu grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, który zapewniał ciągły przepływ (Figura 1B). Wszystkie komórki wykazujące ekspresję G-geNOp o różnej intensywności wykazały wyraźną redukcję fluorescencji w odpowiedzi na NOC-7 i SNP (Figura 1C), co wskazuje na szybką akumulację NO• w komórkach po dodaniu donorów NO•. Znormalizowane sygnały fluorescencyjne (1-F/F0) wykazały, że obaj donorzy NO• wywołali jednorodne komórkowe wzrosty NO•, które całkowicie powróciły po wypłukaniu związków uwalniających NO• (Figura 1D). Jednak 10 μM SNP indukował tylko 50% komórkowego sygnału NO• (9,63 ± 1,05%, n = 3/38), który został osiągnięty przez 10 μM NOC-7 (18,10 ± 1,20%, n = 3/38, p < 0,0001). W celu osiągnięcia równych wewnątrzkomórkowych poziomów NO• u obu donorów NO• wymagane było stężenie 1 mM SNP (ryc. 1C, 1D).

Następnie przetestowaliśmy zdolność świeżo przygotowanego i przeterminowanego NOC-7 do podniesienia wewnątrzkomórkowego poziomu NO• w komórkach HEK. W tym celu przygotowaliśmy cztery eksperymentalne zawierające 5 μM NOC-7. Dawca NO• został dodany na świeżo tuż przed pomiarem lub przechowywany w zbiornikach przez 1 godzinę, 2 godziny i 3 godziny w temperaturze pokojowej przed pomiarem. Różne były kolejno nakładane i usuwane z komórek eksprymujących G-geNOp za pomocą systemu perfuzyjnego (Figura 2B). Podejście to ujawniło stabilność wodnych roztworów NOC-7, które, zgodnie z oczekiwaniami, wykazywały z czasem zmniejszoną zdolność do podnoszenia wewnątrzkomórkowych poziomów NO• (Figury 2A, 2C). Co ciekawe, sygnały NO• odzyskiwały się znacznie szybciej po usunięciu wygasłych, w porównaniu z wewnątrzkomórkową odpowiedzią NO•, która została wywołana przez świeży NOC-7 (Figura 2C), co może wskazywać na adhezję nienaruszonych cząsteczek uwalniających NO• do składników komórkowych.

Jednoczesna wizualizacja sygnałów Ca2+ i NO• w pojedynczych komórkach śródbłonka

W celu zbadania powstawania NO• wywołanego przez Ca2+ w komórkach śródbłonka, powszechnie stosowany śródbłonek unieśmiertelniony substytut komórkowy, linia komórkowa EA.hy926, została przejściowo transfekowana G-geNOp i załadowana Fura-2/am (patrz Protokół 2.8). Transfekcja dała około 10% komórek śródbłonka G-geNOp dodatnich (n = 6, ryc. 3A), co jest wystarczające do zarejestrowania produkcji Ca2+ wywołanego NO• na poziomie pojedynczych komórek śródbłonka. Jednak osiągnęliśmy prawie 100% komórek EA.hy926 G-geNOp dodatnich przy użyciu wektora wirusowego związanego z adenowirusem (n = 6; patrz Protokół 2.2). Przed pomiarami wielokanałowymi komórki inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej w buforze magazynowym składającym się z L-NNA, silnego nieodwracalnego inhibitora NOS26. Komórki kontrolne utrzymywano w tym samym buforze pamięci bez L-NNA (patrz Protokół 1.1) (Rysunek 3B). Traktowanie komórek kontrolnych histaminą, silnym agonistą wytwarzającym 1,4,5-trifosforan inozytolu (IP3), natychmiast podniosło poziom cytozolowego Ca2 +, po którym nastąpił stopniowy wzrost wewnątrzkomórkowego NO•, aż do usunięcia agonisty (ryc. 3C, 3D). Komórki wstępnie potraktowane inhibitorem NOS wykazywały podobne cytozolowe sygnały Ca2 +, podczas gdy wewnątrzkomórkowy poziom NO• pozostał prawie nienaruszony w odpowiedzi na histaminę (Figura 3E). Komórki EA.hy926 eksprymujące G-geNOp potraktowano również 1 μM i 100 μM agonisty ATP generującego IP3 w celu przetestowania, czy geNOpy są odpowiednie do monitorowania sygnałów NO• w odpowiedzi zarówno na niskie fizjologiczne, jak i suprafizjologiczne stężenia agonisty (Figura 3F). W linii komórek śródbłonka 1 μM ATP wywołał wyraźny cytozolowy sygnał NO•, który stanowił około połowy sygnału uzyskanego przez 100 μM ATP (ryc. 3F).

figure-results-1
Rysunek 1: Wewnątrzkomórkowe profile NO w odpowiedzi na różne cząsteczki uwalniające NO. (A) Obrazy szerokokątne komórek HEK stabilnie eksprymujących cytozolowy G-geNOp. Podziałka = 20 μm. (B) Schematyczna ilustracja półautomatycznego systemu perfuzyjnego opartego na grawitacji do kontrolowanego nakładania i usuwania NOC-7 i SNP. (C) Reprezentatywne (z 3 niezależnych eksperymentów) nieznormalizowane ślady intensywności fluorescencji pojedynczej komórki w dowolnych jednostkach w funkcji czasu komórek HEK stabilnie eksprymujących cytozolowy G-geNOp w odpowiedzi na 10 μM NOC-7, 10 μM SNP i 1 mM SNP. pogrubiona krzywa reprezentuje średnią krzywą składającą się z 26 śladów jednokomórkowych (jasnoszare krzywe). krzywa z kropkami reprezentuje F0, która została użyta do normalizacji. (D) Znormalizowane i odwrócone pojedyncze ślady (1-F/F0, jasnoszare krzywe) i krzywa średnia (pogrubiona krzywa) w czasie w odpowiedzi na 10 μM NOC-7, 10 μM SNP i 1 mM SNP wyodrębnione z panelu C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Test stabilności NOC-7 przy użyciu stabilnych komórek HEK wykazujących ekspresję G-geNOp. (A) Reprezentatywna krzywa odpowiedzi stężenia NO• w czasie stabilnie eksprymujących komórki HEK G-GeNOps po zastosowaniu świeżych i starych roztworów buforowych NOC-7. Wszystkie zawierające NOC-7 przygotowano początkowo o końcowym stężeniu 5 μM przy użyciu tego samego roztworu podstawowego (50 mM). Czas upływu poszczególnych roztworów od przygotowania do obrazowania wynosi 1 godzinę, 2 godziny i 3 godziny, zgodnie ze wskazaniami. (B) Schematyczna ilustracja półautomatycznego systemu perfuzyjnego opartego na grawitacji do kolejowego dodawania i usuwania roztworów zawierających NOC-7 podczas obrazowania. (C) Korelacje czasowe komórkowych sygnałów NO• w odpowiedzi na świeżo przygotowane i stare NOC-7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Jednoczesne wielokanałowe obrazowanie sygnałów NO• i Ca2+ w pojedynczych komórkach EA.hy926. (A) Reprezentatywne szerokokątne obrazy fluorescencyjne komórek EAhy.926 wyrażających G-geNOp (lewy panel), które są załadowane fura-2 / am (środkowy i prawy panel). Podziałka = 20 μm. (B) Schematyczna ilustracja traktowania komórek EAhy.926 500 μM Nω-nitro-L-argininą (L-NNA) przez 20 minut na płytce sześciodołkowej przed pomiarem. (C) Reprezentatywny przebieg czasowy jednoczesnego zapisu sygnałów fura-2 (wzbudzenie: 340 nm/emisja 380 nm: 510 nm) i G-geNOp (wzbudzenie: 480 nm; emisja: 520 nm) w odpowiedzi na histaminę 100 μM. Jak wskazano, histamina została usunięta po 3 minutach za pomocą systemu perfuzyjnego. (D) Krzywe reprezentują jednoczesne zapisy cytozolowych sygnałów Ca2 + (sygnały stosunku fura-2, F340 / F380 to szara ciągła linia) i NO• (znormalizowana i odwrócona krzywa, 1-F / F0 to zielona linia ciągła) w czasie pojedynczej komórki śródbłonka załadowanej fura-2 / am przejściowo eksprymującej G-geNOp. Komórki stymulowano 100 μM histaminą przez 3 minuty w buforze zawierającym Ca2+ (2 mM CaCl2) (n = 8/3). (E) Przedstawiciel zarejestrował jednocześnie sygnały Ca2+ (szara linia ciągła) i NO• (zielona linia ciągła) w czasie ogniwa EA.hy926, które przed pomiarem zostało wstępnie potraktowane 500 μM Nω-nitro-L-argininą (L-NNA) (n = 12/3). Komórki traktowano histaminą 100 μM w obecności 2 mM Ca2+. (F) Krzywe średnie reprezentujące cytozolowe sygnały NO• w odpowiedzi na 1 μM ATP, po którym następuje stymulacja drugiej komórki 100 μM ATP. Słupki reprezentują średnie wartości ± SD maksymalnych sygnałów G-geNOp w odpowiedzi na 1 μM ATP (biały pasek) i 100 μM ATP (zielony pasek) z 4 niezależnych eksperymentów; p < 0,001 w porównaniu z 1 μM ATP. Wartość p obliczono za pomocą niesparowanego testu t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu odkrycia NO• jako ważnej cząsteczki sygnałowej w biologii28, dąży się do specyficznego pomiaru rodnika w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach, tkankach i całych zwierzętach z wysoką rozdzielczością w wykonalny i wiarygodny sposób. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niedawno opracowanych genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych NO• (geNOps), które umożliwiają dokładne obrazowanie sygnałów NO• na żywych komórkach przy użyciu szerokokątnejmikroskopii fluorescencyjnej1.

Aby obejść skomplikowane i inwazyjne procedury transfekcji, klon komórek HEK, który stabilnie wyraża zieloną fluorescencyjną G-geNOp, został wykorzystany do ilościowego określenia egzogennie generowanych profili NO• pojedynczych komórek. Ponieważ komórki HEK zwykle nie wytwarzają NO• endogennie29, ten typ komórek nadaje się do wytwarzania linii komórek czujnikowych opartych na geNOp, która może być przydatna do wielu innych zastosowań w warunkach kohodowli z komórkami pierwotnymi wytwarzającymi NO• lub nawet u żywych zwierząt30. Jednak w tym badaniu wykazujemy zdolność różnych związków uwalniających NO•, o różnych stężeniach i stabilnościach, do wywoływania wewnątrzkomórkowych sygnałów NO• za pomocą modelu komórkowego HEK eksprymującego G-geNOp. Nasze dane ujawniły, że stężenie NO•-donora, jakość i metoda aplikacji ostatecznie determinują wzorce wewnątrzkomórkowych profili NO•. Takie informacje są niezbędne do charakterystyki farmakokinetycznej in situ różnych dawców NO•, które wskazują na kilka chorób. Warto zauważyć, że wykazano, że geNOpy stabilnie reagują na wielokrotne powtarzające się aplikacje impulsów NO•-donorowych przez bardzo długi czas1. W związku z tym przedstawione tu eksperymenty z użyciem związków uwalniających NO• pozwalają na półilościowe wnioski dotyczące różnych amplitud i kinetyki odpowiednich komórkowych sygnałów NO• (ryc. 1 i 2).

Chociaż klon komórki HEK o stabilnej ekspresji prawdopodobnie pochodzi z pojedynczej komórki, zaobserwowano szeroką niejednorodność poziomów ekspresji G-geNOps (ryc. 1). Jest to wspólna cecha stabilnych klonów komórkowych, ponieważ transkrypcja (zintegrowanego z genomem) genu będącego przedmiotem zainteresowania jest pod kontrolą wielu czynników, takich jak różnorodne stresy środowiskowe31 , które wpływają na tempo wzrostu komórek32 oraz stan cyklu komórkowego33. Pojedyncze geNOpy oparte na FP są sondami nieratiometrycznymi, a zatem utrata intensywności fluorescencji wywołana przez NO• wzrasta wraz z poziomem ekspresji geNOp1. W związku z tym normalizacja sygnałów geNOps jest niezbędna do ilościowego określenia komórkowych sygnałów NO•, szczególnie w przypadku analizy porównawczej. Jak wykazano w naszym ostatnim badaniu, stwierdzono ścisłą liniową korelację między podstawową intensywnością fluorescencji geNOps a siłą tłumienia fluorescencji indukowanej NO• w szerokim zakresie intensywności fluorescencji1. Jest to ważna cecha geNOps do bezwzględnej kwantyfikacji komórkowych sygnałów NO•. Jak pokazano na rysunku 1, normalizacja sygnałów G-geNOps w odpowiedzi na NOC-7 i SNP ujawniła jednorodne sygnały NO• w różnych komórkach HEK z tej samej płytki, co wskazuje, że komórki HEK nie różnią się pod względem zdolności do pobierania i degradacji rodnika NO•, który pochodzi od dawcy NO•. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie geNOps w komórkach HeLa wykazało wyraźną heterogeniczność komórkowych sygnałów NO• między różnymi komórkami w odpowiedzi na NOC-7. Różnice te wskazują na specyficzny dla typu komórki metabolizm i tempo rozkładu NO•, które mogą mieć wielorakie implikacje dla fizjologii i patologii komórki i mogą zostać odkryte za pomocą technologii geNOps.

Niemniej jednak należy dokładnie rozważyć dwie ważne cechy geNOps w celu prawidłowego użytkowania czujników i interpretacji danych: i) geNOps wymagają odpowiedniej ilości żelaza(II), aby w pełni reagować na NO•1 oraz ii) w zależności od wariantu FP, geNOps mogą być wrażliwe na pH1. Tutaj opisujemy protokół, który okazał się odpowiedni do nietoksycznej suplementacji żelazem(II) geNOps, które ulegają ekspresji w komórkach HEK, HeLa lub EA.hy926 (patrz Protokół 2.6). Chociaż wykazano, że leczenie komórek żelazem(II)/witaminą C nie wpłynęło na morfologię komórek, żywotność komórek i aktywność metabolicznąkomórek1, może być konieczne zoptymalizowanie tego ważnego kroku dla innych typów komórek i tkanek. Jednak w niektórych warunkach doświadczalnych wymóg obciążenia żelazem(II) może ograniczać możliwość zastosowania geNOps. W szczególności wykazano, że askorbinian może redukować NO•35, a kompleksy askorbinian-żelazo(II) są w stanie wymiatać NO•36,37. Co więcej, nadmiar żelaza(II) i askorbinianu może wywoływać reakcje zapalne39 i rozłączać eNOS41. Takie efekty należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu technologii geNOps. Wykazano, że w pewnych warunkach eksperymentalnych wewnątrzkomórkowe pH ulega znacznemu wpływowi34, co może potencjalnie wpływać na fluorescencję geNOps1. Warto zauważyć, że warianty cyjanu i zielonego geNOps są stosunkowo wrażliwe na pH, wykazując spadek fluorescencji po zakwaszeniu1. W związku z tym ostre zmiany pH (sub)komórkowego mogą symulować fałszywe sygnały NO• podczas stosowania geNOps wrażliwych na pH. Jak zasugerowaliśmy w naszej poprzedniej pracy, zaleca się równoległe stosowanie niewrażliwych na NO• geNOps (geNOpsmut) jako kontroli ujemnych w celu przeanalizowania rzeczywistego komórkowego sygnału NO• ze zmian pH1. Ponadto zmiany pH komórek można kontrolować za pomocą sond pH, takich jak SypHer34.

Ponadto zobrazowaliśmy endogenne enzymatyczne tworzenie się NO• w odpowiedzi na fizjologicznego agonistę mobilizującego Ca2 + w substytucie komórek śródbłonka EA.hy926. Linia komórkowa EA.hy926 jest często stosowanym systemem modelowym zapewniającym konsekwentną ekspresję eNOS38. Zastosowanie geNOpów przejściowo eksprymowanych w komórkach EA.hy926 potwierdziło, że sygnały Ca2 + za pośrednictwem IP3 wywołują głębokie tworzenie NO• w tym typie komórek, które było prawie całkowicie zablokowane przez L-NNA. W celu czasowej korelacji Ca2 + z sygnałami NO•, komórki wyrażające G-geNOp zostały obciążone pobudliwym dla promieniowania UV wskaźnikiem Ca2 + fura-2 / am. Separację widmową fluorescencji fura-2 związanej i niezwiązanej Ca2+ od sygnału G-geNOp można łatwo osiągnąć za pomocą dostępnych na rynku zestawów filtrów40. Obrazowanie obu sond ujawniło, że powstawanie enzymatycznego NO• wywołane przez Ca2+ zachodzi znacznie wolniej w porównaniu ze wzrostem cytozolowego Ca2+ w tym typie komórek śródbłonka. Podobną kinetykę sygnałów NO• pojedynczej komórki w komórkach śródbłonka z bydlęcej tętnicy płucnej po leczeniu komórek bradykininą agonistą generującym IP3, a także naprężenia ścinające zostały zgłoszone przy użyciu NOA-1, pośredniego czujnika o wysokiej czułości na NO•12. W związku z tym dane te podkreślają, że tworzenie NO • wywołanego przez Ca2+ eNOS wymaga pewnego czasu rozpoczęcia, aż zostanie osiągnięta pełna aktywność enzymatyczna. Chociaż kinetykę powstawania, dyfuzji i degradacji komórkowego NO• można wyodrębnić z innych danych, np. pomiarów relaksacji naczyń wywołanych NO• opartych na napięciu26, wielką zaletą fluorescencyjnych sond NO• jest to, że bezpośrednio przekształcają one fluktuacje komórkowego NO• w widzialne sygnały w czasie rzeczywistym. W związku z tym obrazowanie komórkowych sygnałów NO• za pomocą geNOps zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową oraz oferuje unikalne możliwości w (ponownym) badaniu homeostazy (sub)komórkowego NO•. Na przykład obrazowanie eNOS shuttling42 w połączeniu z technologią geNOps w pojedynczych komórkach śródbłonka może być odpowiednie do skorelowania tworzenia NO• z subkomórkową lokalizacją i translokacją enzymu wytwarzającego NO• lub innych istotnych białek, takich jak kalmodulina i kaweolina43.

Tutaj opisujemy praktyczne zastosowanie komórek HEK i EA.hy926 z ekspresją G-geNOp do wizualizacji egzogennie i endogennie generowanych komórkowych sygnałów NO• na poziomie pojedynczej komórki oraz w czasie rzeczywistym na konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym o szerokim polu. Nasze dane sugerują, że geNOpy są odpowiednie do specyficznego śledzenia dynamiki (sub)komórkowego NO• w różnych warunkach eksperymentalnych przy użyciu wszelkiego rodzaju interesujących typów komórek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.E, M.W., R.M. i W.F.G., pracownicy Uniwersytetu Medycznego w Grazu, złożyli wniosek patentowy w Wielkiej Brytanii (zgłoszenie patentowe numer WO2015EP74877 20151027, numer priorytetowy GB20140019073 20141027), który opisuje części badań w tym manuskrypcie. Licencje związane z tym patentem są udzielane firmie Next Generation Fluorescence Imaging (NGFI) GmbH (http://www.ngfi.eu/), spółce spin-off Uniwersytetu Medycznego w Grazu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA za dostarczenie komórek EA.hy926. Autor E.E. jest wspierany przez firmę Nikon Austria w ramach Centrum Doskonałości Nikon w Grazu i jest stypendystą programu doktoranckiego z medycyny molekularnej na Uniwersytecie Medycznym w Grazu. Naukowcy są również wspierani przez program doktorancki Choroby metaboliczne i sercowo-naczyniowe (DK-W1226) Uniwersytetu Medycznego w Grazu. Prace te zostały również sfinansowane przez projekt FWF P 28529-B27. Mikroskopijny sprzęt jest częścią Centrum Doskonałości firmy Nikon w Grazu, które jest wspierane przez austriacki program infrastrukturalny 2013/2014, Nikon Austria Inc. i BioTechMed w Grazu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy3957.20chlorek sodu
KClCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy6781.1chlorek potasu
CaCl2· 2H2OCarl Roth, Karlsruhe, NiemcyT885.1dwuwodny chlorek wapnia
MgCl2· 6H2OCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy2189.2sześciowodny chlorek magnezu
HEPESCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy9105.3Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy
NaHCO3Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy8551.1wodorowęglan sodu
KH2PO4Merck, Darmstadt, Niemcy104873diwodorofosforan potasu
Na2HPO4· 2H2OCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy4984.1wodorofosforan sodu dwuwodny
D(+)-Glukoza monohydratCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy6780.1>99.5%; do hodowli komórkowych, wolny od endotoksyn
EGTACarl Roth, Karlsruhe, Niemcy3054.2glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N⁠,⁠ N⁠,⁠ N⁠ ′ ⁠,⁠ N⁠ ′ ⁠ -tetraoctowy; czynnik chelatujący wapń
NaOHCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy6771.1wodorotlenek sodu
HClCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy4625.1kwas solny, dymiący, 37% (~10 N)
DMSOCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy4720.1dimetylosulfotlenek;   wysoce polarny, aprotonowy rozpuszczalnik organiczny
chlorowodorek kwasu L-glutaminowego Sigma Aldrich, Wiedeń, AustriaKwas G2128(S)-2-aminoglutarynowy
DMEM, niska glukozaSigma Aldrich, Wiedeń, AustriaD5523Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni - niski poziom glukozy; z 1 000 mg/L glukozy i L-glutaminą, bez wodorowęglanu sodu, w proszku, odpowiedni do hodowli komórkowych 
Roztwór witaminowy MEM (100x)Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA11120037100x więcej witamin znajdujących się w standardowym roztworze Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Roztwór aminokwasów (50x)Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA1113003650x więcej aminokwasów egzogennych (z wyjątkiem L-glutaminy) znajdujących się w standardowym pożywce Minimum Essential (MEM)
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15140122.00antybiotyki zapobiegające skażeniu bakteryjnemu kultur komórkowych
Amfoterycyna BGibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15290026.00Gibco Amfoterycyna B zawiera 250 &mikro; g amfoterycyny B (Fungizone) i 205 &mikro; g deoksycholanu sodu; zapobiega zanieczyszczeniu kultur komórkowych drożdżami i grzybami wielokomórkowymi
FCSGibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270106Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej
PBS, pH 7,4Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10010031.00sól fizjologiczna buforowana fosforanami
Fura-2 (AM)Teflabs, Austin, TX, USA102fluorescencyjne cytozolowe wskaźniki wapnia
Dihydrochlorek histaminySigma Aldrich, Wiedeń, AustriaH7250dichlorowodorek 2-(4-Imidazolylo)etyloaminy; Agonista generujący IP3 
Nω-Nitro-L-argininaSigma Aldrich, Wiedeń, AustriaN5501Kwas N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminotanowy; L-NNA;   inhibitor syntazy tlenku azotu
NOC-7Calbiochem/Merck, Darmstadt, Niemcy4879523-(2-hydroksy-1-metylo-2-nitrozohydrazyno)-N-metylo-1-propanaminy; donor tlenku azotu (NO) krótki okres półtrwania uwalniania NO
Dwuwodny nitroprusydek soduSanta Cruz Biotechnology, Teksas, USAsc-203395Adwuwodny nitrożelazocyjanek(III) sodu; związek uwalniający tlenek azotu
30 mm SzkiełkanakrywkoweKarl Hecht, Sondheim v. d. Rhö n, Niemcy41001130szkiełka nakrywkowe, HECHT "Assistent", rozmiar 1, okrągłe, 30 mm, (VE: 100 szt.) 
Roztwór wzmacniający żelaza(II)Obrazowanie fluorescencyjne nowej generacji (NGFI), Graz, Austrian.a.Żelazo(II) zawierające fizjologiczny bufor do nietoksycznego obciążenia komórek żelazem(II);   http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
Plazmid G-geNOpObrazowanie fluorescencyjne nowej generacji (NGFI), Graz, Austrian.a.plasmidDNA kodujący zieloną NO czułą sondę (G-geNOp);   http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5Obrazowanie fluorescencyjne nowej generacji (NGFI), Graz, Austrian.a.adenoviruskodujący zieloną sondę czułą na NO (G-geNOp);   http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
Linia komórkowa czujnika G-geNOp Obrazowaniefluorescencyjne nowej generacji (NGFI), Graz, Austrian.a.ludzka linia komórek embrionalnych nerki (HEK293) stabilnie eksprymująca zieloną sondę wrażliwą na NO (G-geNOp);   http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A linia komórkowaInvitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR70507subklon ludzkiej embrionalnej linii komórkowej nerki (HEK293) 
Linia komórkowa EA.hy926American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, NiemcyCRL-2922hybrydowy klon komórek somatycznych ludzkiej linii komórkowej żyły pępowinowej z odpornym na tioguaninę klonem A549
TILL iMICTill Photonics, Graefling, Niemcyn.a.cyfrowy
Monochromator Polychrome VTill Photonics, Graefling, Niemcyn.a.ultraszybkie przełączanie
AVT Stingray F145BAllied Vision Technologies, Stadtroda, Niemcyn.d.Uniwersalnakamera CCD z czujnikiem Sony ICX285 EXview HAD, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40Zeiss, Gö ttingen, Niemcyn.a.40Xobiektywowe
filtry dichroiczneChroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USAEmiter n.a.GFP 514/3 nm (515dcxr)
Kontroler ValveBank8AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, Kalifornia, USA01-08programowalna jednostka sterująca systemem perfuzji
Sterowanie BVCVacuubrand, Wertheim, Niemcy727200Chemia pompa membranowa ME 1C; pompa próżniowa do systemu perfuzyjnego
Oprogramowanie ImageJ  Obraz NIH Program do przetwarzania obrazów Java inspirowany obrazem NIH. http://imagej.net/Welcome
mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623(2016).
  2. Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
  3. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  4. D'Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. Poole, ed.P. oole,R. .K. .,(ed)., 437, 1st edition, Elsevier textbooks, s.l. 235-251 (2008).
  5. Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288(2016).
  6. Auten, R. L. Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812(2011).
  7. Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
  8. Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
  9. Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
  10. Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
  11. Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
  12. Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
  13. Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
  14. Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
  15. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  16. Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
  17. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  18. Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
  19. Zhou, L., Zhu, D. -Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
  20. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
  21. Ghafourifar, P., Cadenas, E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).
  22. Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. Bacterial nitric oxide synthases. Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).
  23. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  24. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  25. Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
  26. Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
  27. Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
  28. Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
  29. Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
  30. Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
  31. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  32. Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
  33. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  34. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  35. Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
  36. Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
  37. Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
  38. Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
  39. Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
  40. Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917(2012).
  41. Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
  42. Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
  43. Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie tlenku azotusondy genetycznie kodowanedetekcja NO w czasie rzeczywistymanaliza pojedynczych kom rekfluorescencyjne sondy bia kowetechnologia geNOpsobrazowanie wapnia z u yciem Fura 2system perfuzji ywych kom rekdonor tlenku azotu NOC 7sygnalizacja kom rek r db onka

Powiązane artykuły