Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W mózgu, systemy transportu błonowego odgrywają ważną rolę w regulacji funkcji neuronalnych, takich jak morfologia neuronów, plastyczność synaptyczna, przeżycie i komunikacja glejowa. Do tej pory liczne badania wykazały, że defekty w tych układach powodują różne choroby neuronalne. Tak więc zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw dynamiki pęcherzyków może dostarczyć ważnych wskazówek, które mogą pomóc w leczeniu kilku zaburzeń neuronalnych. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków, takich jak ruchliwość, odległość i szybkość ruchu, przy użyciu wtyczki programowej do platformy ImageJ. Aby uzyskać obrazy do kwantyfikacji, oznaczyliśmy neuronalne struktury endosomy-lizosomów białkami markerowymi pęcherzyków znakowanymi EGFP i obserwowaliśmy ruch pęcherzyków za pomocą mikroskopii poklatkowej. Metoda ta jest bardzo przydatna i upraszcza pomiar ruchliwości pęcherzyków w neurytach, takich jak aksony i dendryty, a także w somie zarówno neuronów, jak i komórek glejowych. Ponadto metoda ta może być stosowana do innych linii komórkowych, takich jak fibroblasty i komórki śródbłonka. Takie podejście może stanowić cenny postęp w naszej wiedzy na temat transportu błonowego.
Wprowadzenie
Precyzyjna kontrola transportu endosomu z lizosomem jest niezbędna do regulacji funkcji neuronów. Warto zauważyć, że dynamiczne ruchy tych pęcherzyków są kluczowym czynnikiem leżącym u podstaw regulacji morfologii, rozwoju i przeżycia neuronów. Defekty w tym systemie powodują poważne zaburzenia neuronalne1,2. Mechanizmy molekularne, które łączą transport pęcherzyków z chorobami neuronalnymi, są uważane za skomplikowane, a kilka grup starało się zbadać to znaczenie. Na przykład doniesiono, że zaburzona późna ruchliwość endosomów jest istotnie związana z chorobą Niemanna-Picka C3, dziedzi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tsukuba (IACUC).
1. Sekcja
- Aby przygotować płody ICR lub C57BL/6 w dniu 13-14 embrionalnym, należy poddać eutanazji ciężarne myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Usuń macicę i włóż ją na szalkę Petriego ze zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS). Dobrze spłucz, aby usunąć krew.
- Za pomocą kleszczy przenieś macicę na nową szalkę Petriego z 70% etanolem w celu sterylizacji.
- Przenieś macicę na nową szalkę Petriego za pomocą HBSS. Usuń płody z macicy za pomocą wysterylizowanych kleszczy pr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy test został zaprojektowany w celu pomiaru dynamiki pęcherzyków w hodowli in vitro. Test ten wykorzystano do określenia ruchliwości pęcherzyków powiązanej z morfologią i przeżywalnością neuronów. Rysunek 1A oraz B przedstawiają reprezentatywne dane obrazujące ruchliwość lizosomów w neuronach. Neurony korowe przetransfekowano markerem lizosomów, LAMP-EGFP, a następnie obserwowano za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Wcze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten wprowadza procedurę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków. W neuronach pierwotnych endosomy i lizosomy wykazują tendencję do wykazywania wysokiej ruchliwości w młodszych neuronach (4-6 DIV). Biorąc pod uwagę, że neurony muszą dostarczyć pewne składniki do krawędzi natarcia, aby wydłużyć procesy neuronalne, transport błonowy powinien zachodzić dynamicznie na tym etapie. Dlatego ważne jest, aby używać młodszych neuronów do obserwacji dynamicznej ruchliwości dendrytów neuronalnych. Ponadto większe pęch.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Dr. Ricardo Dolmetschowi (Stanford University School of Medicine; obecna afiliacja: Novartis Institutes for Biomedical Research) za pomoc w opracowaniu tej analizy oraz Dr. Matthew Woodowi, Takumie Aiharze i Dongsook Kimowi za ich krytyczne odczytanie manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka neuropodstawowa | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Podłoże wolne od surowicy |
| Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycyna | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamina | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Suplementy | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2,5% trypsyna | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poli-L-ornityna (PLO) | Sigma | P4957 | |
| Nylonowe sitko | do komórekCorning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Odczynnik do transfekcji |
| Polietylenoimina "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Odczynnik do transfekcji. Jako alternatywę dla Lipofectamine2000 dostępne jest 0,1 mg / ml polietylenoiminy rozpuszczonej w sterylizowanej wodzie. Ale jest to niska wydajność i wysoka toksyczność. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| System inkubacji INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism wersja 6.0 | Oprogramowanie GraphPad | NA | |
| Excel wersja 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ wersja 1.47 | NA NA |
Bibliografia
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
