Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

DOI:

10.3791/55488

⸱

22 maja 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2PhD Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 3Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W mózgu, systemy transportu błonowego odgrywają ważną rolę w regulacji funkcji neuronalnych, takich jak morfologia neuronów, plastyczność synaptyczna, przeżycie i komunikacja glejowa. Do tej pory liczne badania wykazały, że defekty w tych układach powodują różne choroby neuronalne. Tak więc zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw dynamiki pęcherzyków może dostarczyć ważnych wskazówek, które mogą pomóc w leczeniu kilku zaburzeń neuronalnych. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków, takich jak ruchliwość, odległość i szybkość ruchu, przy użyciu wtyczki programowej do platformy ImageJ. Aby uzyskać obrazy do kwantyfikacji, oznaczyliśmy neuronalne struktury endosomy-lizosomów białkami markerowymi pęcherzyków znakowanymi EGFP i obserwowaliśmy ruch pęcherzyków za pomocą mikroskopii poklatkowej. Metoda ta jest bardzo przydatna i upraszcza pomiar ruchliwości pęcherzyków w neurytach, takich jak aksony i dendryty, a także w somie zarówno neuronów, jak i komórek glejowych. Ponadto metoda ta może być stosowana do innych linii komórkowych, takich jak fibroblasty i komórki śródbłonka. Takie podejście może stanowić cenny postęp w naszej wiedzy na temat transportu błonowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjna kontrola transportu endosomu z lizosomem jest niezbędna do regulacji funkcji neuronów. Warto zauważyć, że dynamiczne ruchy tych pęcherzyków są kluczowym czynnikiem leżącym u podstaw regulacji morfologii, rozwoju i przeżycia neuronów. Defekty w tym systemie powodują poważne zaburzenia neuronalne1,2. Mechanizmy molekularne, które łączą transport pęcherzyków z chorobami neuronalnymi, są uważane za skomplikowane, a kilka grup starało się zbadać to znaczenie. Na przykład doniesiono, że zaburzona późna ruchliwość endosomów jest istotnie związana z chorobą Niemanna-Picka C3, dziedziczną chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną defektami lizosomów. Innym przykładem jest mutacja w lizosomalnym kanale Ca2+, trpml1, która upośledza ruchliwość lizosomalną, powodując lizosomalne choroby spichrzeniowe4,5,6. Nasza grupa poinformowała, że rozregulowanie obrotu PtdIns(3,5)P2 hamuje ruchliwość endosomów i lizosomów w neuronach, prowadząc do wzrostu podatności na reakcję na stres7,8. Regulacja metaboliczna PtdIns(3,5)P2, która głównie lokalizuje się na późnych endosomach i lizosomach, odgrywa ważną rolę w wielu różnych funkcjach komórkowych, w tym w transporcie pęcherzyków i procesach fuzji-rozszczepienia9,10. Ponieważ upośledzony obrót PtdIns(3,5)P2 powoduje ciężką neurodegenerację11,12, nieprawidłowa regulacja ruchliwości endosomu i lizosomów może być kluczowym czynnikiem dla zrozumienia patogenezy neurodegeneracji. Badanie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw ruchliwości pęcherzyków, może zatem dostarczyć obiecujących wskazówek, które mogą pogłębić naszą wiedzę na temat kilku zaburzeń neuronalnych.

W tym artykule przedstawiamy cenną metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą darmowego pakietu oprogramowania o nazwie Ręczne Śledzenie. Celem było opracowanie metody szybkiej kwantyfikacji do analizy ruchliwości pęcherzyków. Ta kwantyfikacja jest kierowana za pomocą standardowego podejścia polegającego na klikaniu punktu odniesienia w każdej klatce filmu poklatkowego. Korzystanie z oprogramowania do ręcznego śledzenia sprawia, że to podejście jest dość proste i ma szeroką użyteczność, w przeciwieństwie do innych aplikacji. Co więcej, podejście to ma również zastosowanie do innych komórek, takich jak komórki glejowe. Chociaż metoda ta jest prymitywna, można ją zastosować do różnych analiz, w tym ruchliwości komórek i zmian morfologicznych. Na przykład, po zdefiniowaniu punktu odniesienia w sekwencji obrazów, informacje o położeniu punktów odniesienia i czasie w każdej pozycji mogą być wydobyte z obrazów sekwencyjnych za pomocą oprogramowania do analizy danych i przetwarzania obrazów. Podsumowując, metoda ta jest prosta, ale skuteczna i przyczynia się do poprawy efektywności w badaniach opartych na transporcie błonowym, takich jak te badające funkcję endosom-lizosom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tsukuba (IACUC).

1. Sekcja

  1. Aby przygotować płody ICR lub C57BL/6 w dniu 13-14 embrionalnym, należy poddać eutanazji ciężarne myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Usuń macicę i włóż ją na szalkę Petriego ze zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS). Dobrze spłucz, aby usunąć krew.
  2. Za pomocą kleszczy przenieś macicę na nową szalkę Petriego z 70% etanolem w celu sterylizacji.
  3. Przenieś macicę na nową szalkę Petriego za pomocą HBSS. Usuń płody z macicy za pomocą wysterylizowanych kleszczy preparacyjnych i nożyczek chirurgicznych.
  4. Odetnij głowę płodowi za pomocą nożyczek chirurgicznych. Umieść je na nowej szalce Petriego z HBSS.
  5. Usuń skórę i czaszkę i wyjmij mózgi za pomocą wysterylizowanych kleszczy preparacyjnych. Umieść je na szalce Petriego z HBSS.
    UWAGA: Od tego kroku najlepiej jest przeprowadzać zabieg na czystej ławce.
  6. Usuń opony mózgowe za pomocą wysterylizowanych kleszczy preparacyjnych pod mikroskopem stereoskopowym. Odetnij zwoje podstawy, hipokamp i móżdżek za pomocą kleszczy. Za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką przenieś korę na nową szalkę Petriego za pomocą HBSS.
  7. Zbierz całą korę za pomocą jednorazowego zakraplacza lub pipety o pojemności 25 ml. Umieścić je w probówce o pojemności 15 ml, a następnie usunąć HBSS za pomocą pipetowania.
  8. Dodać 3 ml roztworu enzymu kory mózgowej do probówki zawierającej korę. Umieścić probówkę w łaźni wodnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    UWAGA: Przygotuj enzym do hodowli kory mózgowej składający się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 0,25% trypsyny i 1 mM EDTA. Sterylizuj filtrem 0,22 μm.
  9. Dodać kolejne 3 ml roztworu enzymów kory mózgowej do probówki zawierającej korę mózgową i inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez dodatkowe 5 minut.
  10. Usunąć roztwór enzymu kory mózgowej za pomocą pipety o pojemności 5 ml i dodać 5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  11. Oddzielić korę, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml ze sterylną końcówką P1000. Ponownie odpipetować za pomocą pipety o pojemności 5 ml z końcówką P200.
  12. Umieść nylonowe sitko o pojemności 40 μm na probówce o pojemności 50 ml i przefiltruj zawiesinę, aby usunąć zanieczyszczenia.
  13. Wirować przy 420 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć pożywkę DMEM.
  14. Dodać 5 ml pożywki do hodowli kory mózgowej i delikatnie zawiesić osad komórkowy.
    UWAGA: Przygotuj pożywkę hodowlaną kory mózgowej składającą się z podłoża podstawowego neuronów uzupełnionego 1x suplementami B-27, 2 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny streptomycyny.
  15. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek (w razie potrzeby) za pomocą pożywki do hodowli kory mózgowej.
  16. Płytka 3.0 × 106 neuronów korowych w 2,0 ml na powlekane naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
    UWAGA: Przed posiewem pokryj naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm 0.1 mg/ml bromowodorkiem poli-D-lizyny (PDL) lub 0.01% poli-L-ornityną (PLO). Inkubować przez 3 godziny – O/N w temperaturze 37 °C i przemywać PBS co najmniej 3 razy.

2. Obrazowanie ruchliwości pęcherzyków

  1. Przygotuj plazmidy, które oznaczą każdy rodzaj pęcherzyka. Na przykład użyj EGFP-Rab5 dla wczesnych endosomów, EGFP-Rab7 dla późnych endosomów, LAMP-EGFP dla lizosomów i EGFP-LC3 dla autofagosomów8,13.
    UWAGA: Te plazmidy są dostępne na żądanie w tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Zazwyczaj, 3-5 dni neurony in vitro (DIV) mogą być transfekowane tymi plazmidami za pomocą odczynników do transfekcji.
  2. Zmieszać 4,0 μg plazmidów z 200 μl pożywki bez surowicy przez pipetowanie. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) w 200 μl pożywki wolnej od surowicy. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zmieszać roztwór plazmidu i roztwór regenta do transfekcji w kroku 2.2 przez pipetowanie. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać pożywkę bez surowicy i 400 μl roztworu plazmidu z kroku 2.3 do każdego powlekanego naczynia ze szklanym dnem. Inkubować neurony w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 30 minut. Zastąp pożywkę 2 ml pożywki do hodowli kory mózgowej. Inkubować neurony w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 1-2 dni.
  5. Po 1 - 2 dniach transfekcji wybierz transfekowane komórki do akwizycji obrazu.
    UWAGA: Wcześniaki neuronów poniżej 7 DIV mają tendencję do wykazywania dynamicznej ruchliwości pęcherzyków. Wybierz neurony, które umiarkowanie wyrażają sondę fluorescencyjną, ponieważ nie można uzyskać wyraźnych obrazów, gdy wybrany jest neuron o wysokiej ekspresji. Wybierz również typowy kształt neuronu, taki jak neurony piramidowe, które mają długie aksony i skomplikowane dendryty, aby ułatwić identyfikację aksonu i dendrytów (patrz ryc. 1A).
  6. Akwizycja obrazu za pomocą systemu obrazowania poklatkowego:
    Do obrazowania należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD (Charge-Coupled Device) z soczewkami obiektywowymi 40X Plan Apo 0.95NA lub 100X Plan Apo VC NA1.4. Kontrolować temperaturę 37 °C za pomocą systemu inkubacji. Rejestruj obrazy neuronów w jednej klatce/5 s przez okres 100 sekund kontrolowany przez oprogramowanie do akwizycji obrazu. Alternatywnie, rejestruj obrazy w krótszych odstępach czasu i przez dłuższy czas, na przykład z jedną klatką na 2 s w okresie 300 sekund.
    UWAGA: Dostępnych jest wiele aplikacji do wykonywania zdjęć sekwencyjnych, z których wiele nadaje się do tej metody. Dlatego nie zaleca się żadnej konkretnej aplikacji; Zamiast tego każdy badacz powinien korzystać z dowolnej dostępnej aplikacji.

3. Analiza obrazu

  1. Otwórz wszystkie sekwencyjne obrazy w oprogramowaniu ImageJ z ręcznym śledzeniem14.
    UWAGA: Do tej pory ręczne śledzenie było szeroko stosowane w eksperymentach ze śledzeniem15,16,17,18,19. Śledzenie ręczne zostało opracowane przez dr Fabrice'a Cordelièresa. Szczegółowe instrukcje w formie pisemnej są dostępne online20. Na potrzeby analizy jakość danych obrazowych poprawia się dzięki wystarczającej liczbie obrazów. Zaleca się użycie więcej niż 20 obrazów.
  2. Aby połączyć obrazy sekwencyjne, wybierz opcję → → . Kliknij przycisk .
  3. Wybierz → pojawi się okno śledzenia.
  4. Kliknij pole wyboru i zdefiniuj parametry śledzenia w sekcji parametrów.
    UWAGA: Można ustawić kilka parametrów, w tym interwał czasowy, kalibrację x/y, kalibrację z, rozmiar kwadratu wyszukiwania do wyśrodkowania, rozmiar kropki, szerokość linii i rozmiar czcionki. W tym uproszczonym teście zdefiniowano zarówno przedział czasowy, jak i kalibrację x/y. W innych warunkach eksperymentalnych może być konieczne zdefiniowanie również innych parametrów. Stosowane tutaj parametry są następujące: wynosi 5 s, a kalibracja wynosi 0,26642 μm dla obiektywu 40X Plan Apo 0,95NA lub 0,10657 μm dla soczewki obiektywowej 100X Plan Apo VC NA1.4.
  5. Po zdefiniowaniu parametrów kliknij aby rozpocząć nową ścieżkę.
  6. Po określeniu interesujących pęcherzyków (np. pęcherzyków oznaczonych niebieskimi i czerwonymi grotami strzałek na rysunku 1A (prawy panel)), kliknij środek sygnałów na sekwencyjnych obrazach, aby zapisać współrzędne xy. Wyniki zarejestrowanych współrzędnych xy, odległości i prędkości pojawiają się w nowym oknie.
    UWAGA: W przypadku lizosomów w neuronach często obserwuje się duże jasne sygnały fluorescencyjne (np. Rysunek 1A (prawy panel), pomarańczowy grot strzałki). Ponieważ sygnały te czasami wykazują nagromadzone pęcherzyki lub patologiczne żylaki, należy unikać tych sygnałów w celu ilościowego określenia ruchliwości.
  7. Powtórz krok 3.6, aby zebrać współrzędne xy pęcherzyków ze wszystkich kolejnych obrazów; każdy obraz automatycznie przechodzi do kolejnego obrazu po wybraniu punktu odniesienia.
  8. Wyeksportuj te dane do nowej tabeli (np. arkusza kalkulacyjnego). Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby utworzyć odpowiedni wykres (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Aby przeanalizować dane, wybierz kolumnę zsumuj wszystkie wartości tej kolumny i pokaż odległość ruchliwości w postaci wykresu słupkowego, tak jak na rysunku 1B. Dodatkowo powtórz ten krok, oblicz średnią całkowitej odległości ruchliwości i pokaż jako wykres słupkowy, jak na rysunku 1C. Oprogramowanie do tworzenia wykresu słupkowego i danych falowych jest pokazane w tabeli materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test został zaprojektowany do pomiaru dynamiki pęcherzyków w hodowli in vitro. Test ten został wykorzystany do określenia ruchliwości pęcherzyków związanych z morfologią neuronów i przeżyciem. Ryciny 1A i B przedstawiają reprezentatywne dane pokazujące ruchliwość lizosomów w neuronach. Neurony korowe transfekowano markerem lizosomowym LAMP-EGFP i obserwowano za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Wcześniej donoszono, że specyf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wprowadza procedurę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków. W neuronach pierwotnych endosomy i lizosomy wykazują tendencję do wykazywania wysokiej ruchliwości w młodszych neuronach (4-6 DIV). Biorąc pod uwagę, że neurony muszą dostarczyć pewne składniki do krawędzi natarcia, aby wydłużyć procesy neuronalne, transport błonowy powinien zachodzić dynamicznie na tym etapie. Dlatego ważne jest, aby używać młodszych neuronów do obserwacji dynamicznej ruchliwości dendrytów neuronalnych. Ponadto większe pęch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Ricardo Dolmetschowi (Stanford University School of Medicine; obecna afiliacja: Novartis Institutes for Biomedical Research) za pomoc w opracowaniu tej analizy oraz Dr. Matthew Woodowi, Takumie Aiharze i Dongsook Kimowi za ich krytyczne odczytanie manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka neuropodstawowaThermo Fisher21103-049
Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco (DMEM)Wako044-29765
Opti-MEMThermo Fisher31985070Podłoże wolne od surowicy
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)Thermo Fisher14170112
Penicilin StreptmycynaThermo Fisher15140122
L-GlutaminaThermo Fisher25030081
B-27 SuplementyThermo Fisher17504044
2,5% trypsynaThermo Fisher15090046
Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)SigmaP7280
Poli-L-ornityna (PLO)SigmaP4957
Nylonowe sitkodo komórekCorning431750
Lipofectamine 2000Thermo Fisher11668027Odczynnik do transfekcji
Polietylenoimina "Max" (PEI)polysciences24765Odczynnik do transfekcji. Jako alternatywę dla Lipofectamine2000 dostępne jest 0,1 mg / ml polietylenoiminy rozpuszczonej w sterylizowanej wodzie. Ale jest to niska wydajność i wysoka toksyczność.
BIOREVO BZ-9000KeyenceNA
System inkubacji INUG2-K13Tokay HitNA
GraphPad Prism wersja 6.0Oprogramowanie GraphPadNA
Excel wersja 15MicrosoftNA
ImageJ wersja 1.47NA NA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
  2. De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
  3. Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
  4. Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
  5. Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
  6. Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
  7. Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
  8. Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
  9. McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
  10. Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
  11. Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
  12. Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
  13. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  14. Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017).
  15. Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102(2011).
  16. Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105(2013).
  17. Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
  18. Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
  19. Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790(2016).
  20. Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf (2017).
  21. ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017).
  22. Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
  23. Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498(2013).
  24. Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mobilno endosom w i lizosom wilo ciowe oznaczanie mobilno ci p cherzyk wmikroskopia poklatkowar czne ledzenie w programie ImageJendosomy i lizosomy neuronalnekultura neuron w korowychanaliza transportu b onowegooprogramowanie do ledzenia p cherzyk wp cherzyki LAMP EGFP

Powiązane artykuły