Artykuł metodologiczny

Bateria testów behawioralnych oceniających ogólną lokomocję, siłę mięśni i koordynację u myszy

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55491

⸱

23 stycznia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Neuroscience Studies, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3Medical Genetics/ Department of Pediatrics, Kingston General Hospital, Centre for Neuroscience Studies, and Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University

W tym artykule

Podsumowanie

Testy behawioralne są używane w badaniach przedklinicznych do oceny fenotypowych skutków choroby lub leczenia na samopoczucie zwierzęcia. Aby globalnie ocenić funkcjonowanie motoryczne, wybraliśmy testy ogólnej lokomocji, siły mięśniowej i koordynacji: odpowiednio test otwartego pola, test siatki i test rotarod.

Streszczenie

Testy behawioralne są używane w badaniach przedklinicznych do oceny efektów fenotypowych i wyników, jakie dana choroba lub leczenie ma na samopoczucie i zdrowie zwierzęcia. Istnieje wiele testów behawioralnych, które można zastosować. Wybraliśmy test na ogólną lokomocję, test w terenie otwartym (OFT); badaniu siły mięśniowej, badaniu siatki (MT); oraz test koordynacji, test rotarodu (RR). Testowanie może odbywać się co tydzień lub co miesiąc. Jako test ogólnej lokomocji, OFT działa poprzez obiektywne monitorowanie parametrów ruchu, gdy mysz znajduje się w aparacie na otwartym polu. Pole jest zazwyczaj pudełkiem o wymiarach 2 'x 2', a ruchy są rejestrowane za pomocą czujników laserowych lub przechwytywania wideo. Mysz jest umieszczana na środku otwartego pola i pozwala jej się swobodnie poruszać na czas testu. MT wykorzystuje opóźnienie, w którym mysz spada z odwróconego ekranu, jako miarę siły mięśni. Mysz jest umieszczana na ekranie, który jest odwrócony nad przezroczystym polem i jest mierzona w czasie, aby zmniejszyć jej opóźnienie. Przeprowadzane są trzy próby, z których najlepsza jest oceniana w danym dniu. Wynik 60 s to maksymalny czas, przez jaki mysz pozostaje odwrócona. Myszy mają 5-minutowy okres odpoczynku między próbami testu siatki. Wreszcie, przyspieszony protokół na RR ocenia koordynację ruchową i wytrzymałość. Podczas próby mysz chodzi po obracającym się pręcie, zwiększając prędkość z 4 obr./min do 40 obr./min w ciągu 5 minut. Próba kończy się, gdy mysz dotknie namagnesowanego czujnika nacisku po upadku. Każda mysz przechodzi trzy próby, a najlepsza próba jest oceniana dla tego dnia. Te połączone dane behawioralne pozwalają na globalną ocenę mobilności, koordynacji, siły i ruchu badanych zwierząt. Co najmniej dwa z trzech wskaźników testów behawioralnych muszą wykazać poprawę, aby zwierzę mogło zostać zakwalifikowane jako mające ogólną poprawę funkcji motorycznych.

Wprowadzenie

Celem testów behawioralnych jest zmierzenie charakterystyki fenotypowej, czy to w badaniach nad nowym mysim modelem chorób wpływających na ośrodkowy układ nerwowy, czy też w próbie nowego leczenia. Do wyboru jest wiele testów behawioralnych. Uzasadnieniem dla stosowania kombinacji testów behawioralnych jest często pełna ocena wyników leczenia przedklinicznego. Zestaw testów behawioralnych w niniejszym dokumencie obejmuje test otwartego pola (OFT), test siatki (MT) i test rotarodu (RR).

OFT jest używany jako miara ogólnej aktywności lokomotorycznej1,2,3,4,5,6,7. Ocena ta pozwala myszy na swobodne poruszanie się w otwartym polu, a wykonane pomiary są ruchami myszy w trakcie badania behawioralnego. Analizy ilościowe wykonane za pomocą OFT obejmują odchów, przebyty dystans, czas spędzony w ruchu (np. chodzenie i bieganie) oraz zmiany aktywności w czasie (np. skakanie i wolniejsze/nadpobudliwe ruchy), dlatego jest to przydatna i dokładna analiza zachowania gryzoni.

MT służy do oceny siły myszy1,2,8,9,10,11. Użycie wszystkich czterech kończyn do zwisania z siatki drucianej pozwala na nieinwazyjny pomiar zdolności myszy do wykazywania trwałego napięcia kończyn przy jednoczesnym przeciwstawianiu się skutkom grawitacji. Ta ocena jest wykonywana poprzez umieszczenie myszy na odwróconej siatce i ustawienie czasu jej opóźnienia na spadek. Ten test ocenia siłę mięśni myszy, mierząc, jak długo może ona utrzymać się na odwróconym ekranie, zanim spadnie.

RR ocenia koordynację myszy podczas korzystania z protokołu akceleracji1,2,7,8,9,12,13. Aparat Rotarod składa się z cylindrycznej belki, która obraca się w powietrzu od 4 obr./min. Mysz może nauczyć się tej umiejętności koordynacji ruchowej, a następnie jest wyzywana przez powolne, stopniowe zwiększanie prędkości do 40 obr./min. Klasycznie protokół stałej prędkości jest miarą siły mięśniowej, podczas gdy protokół przyspieszania dla RR ocenia koordynację, wytrzymałość i siłę mięśni1,2,7,14.

Zaletą tych trzech testów behawioralnych jest to, że są one powszechnie akceptowane w całej społeczności testującej zachowanie gryzoni2,7,8,9, a gdy są traktowane nie tylko jako suma poszczególnych testów, ale łącznie, mogą być używane jako globalna ocena zachowania fenotypowego podczas badania różnych wyników eksperymentu Zabiegi. OFT jest jednym z niewielu testów na ogólną aktywność lokomotoryczną2. RR jest również jednym z niewielu sposobów oceny koordynacji2, poza użyciem oprogramowania do analizy chodu, które nie będzie tutaj omawiane. Istnieje kilka sposobów, w jakie można ocenić siłę mięśni myszy; jednak użycie MT, czyli testu zwisu drutu, jest powszechnie stosowane w literaturze i jest akceptowane jako wiarygodna metoda testowania siły mięśniowej2,8,9,10,11. Wiele innych technik pomiaru ogólnej lokomocji i koordynacji jest niezwykle czasochłonnych i może nie dawać wiarygodnych danych (np. ręczne mierzenie czasu ruchów myszy lub ręczne malowanie łap w celu analizy chodu). Zautomatyzowane systemy dla OFT i RR zwiększają wiarygodność i ważność generowanych danych oraz oszczędzają czas i wysiłek.

Na przykład, biorąc pod uwagę neurodegenerację mysiego modelu choroby Sandhoffa, podczas wykonywania tej serii testów, OFT byłby pierwszym z tych testów używanych do oceny nieprawidłowości motorycznych, które zwykle obserwuje się w tym modelu myszy, począwszy od 3 miesiąca życia. Deficyty w koordynacji ruchowej powinny również uwidocznić się już od 12 tygodnia życia. Deficyty siły mięśniowej powinny rozpocząć się około 14 tygodnia życia, ale ostatecznie stają się znacznie bardziej znaczące do 16 tygodnia.

Te testy są przydatne podczas badania chorób powodujących znaczne upośledzenie motoryczne, w tym chorób neurodegeneracyjnych9 takich jak choroba Sandhoffa1,8,13, choroba Parkinsona7, choroba Huntingtona, stwardnienie rozsiane. Testy mogą być również wykorzystywane do badania starzenia się oraz do dokonywania porównawczych ocen geriatrycznych lub pomiarów stanu zdrowia. Zaburzenia chodu oraz zmiany w lokomocji i równowadze są obserwowane w wielu z tych stanów chorobowych. Przydatność tych badań nie ogranicza się jednak do chorób z przeważającymi objawami nerwowo-mięśniowymi.

Proszę zauważyć, że nie odnotowano żadnych zmiennych zakłócających w odniesieniu do motywacji lub nowości któregokolwiek z opisanych testów behawioralnych. W przypadku niektórych stanów chorobowych i patologii konieczne jest, aby naukowcy uzyskali wstępne dane behawioralne, zanim mysz wykaże jakiekolwiek objawy fenotypowe; Badacz powinien następnie okresowo (co tydzień) upewnić się, że wszystkie zaburzenia motoryczne są uwzględniane. Wiele chorób ma szybki początek objawów fenotypowych, a bez cotygodniowych badań objawy te nie zostałyby uwzględnione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj protokoły zostały wykonane zgodnie z Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Królowej i zostały przez nie zatwierdzone. Częstotliwość testów behawioralnych może być tygodniowa lub miesięczna, lub kombinacja tych dwóch (tj. co tydzień, gdy spodziewa się zobaczyć największą różnicę, a co miesiąc w innych miejscach).

UWAGA: Badania behawioralne u myszy są w dużej mierze zależne od płci/wieku/szczepu, dlatego ważne jest, aby zebrać odpowiednie punkty czasowe i zachować spójność między grupami eksperymentalnymi. Czynniki środowiskowe (np. zapachy, hałas, temperatura, wilgotność, oświetlenie itp.) mają ogromny wpływ na zachowanie i niepokój u myszy. Staraj się jak najbardziej ograniczyć te czynniki środowiskowe.

1. Test w otwartym polu

UWAGA: Przed testami behawioralnymi, zwierzęta powinny być przyzwyczajone do pomieszczenia, w którym mają się odbyć testy, na 10 - 15 minut przed rozpoczęciem testów. Upewnij się, że odpowiednie środki ochrony osobistej i wszystkie lokalne wytyczne dotyczące obiektów są przestrzegane w protokołach testów behawioralnych.

UWAGA: Brak treningu przed testem.

  1. Upewnij się, że komputer i program OFT są włączone, uruchomione i prawidłowo podłączone do kamery lub otwartej skrzynki polowej. Kliknij program smartware, ikonę otwartego pola i "OK". Wybierz źródło "cyfrowy przetwornik analogowy" z opcji kamery. Kliknij "wykrywanie" i upewnij się, że cała otwarta przestrzeń pola jest zwizualizowana, a wymiary wynoszą 30 cm x 30 cm.
    UWAGA: Układ sprzętu może się różnić w zależności od ograniczeń przestrzennych, ale upewnij się, że komputer i aparatura w terenie otwartym znajdują się blisko siebie w dobrze oświetlonym pomieszczeniu, aby zapewnić prawidłowe nagrywanie wideo.
  2. Kliknij "kalibracja", "migawka", a następnie "OK", aby upewnić się, że mysz jest wykrywana w granicach otwartego pola. Kliknij "czas", aby wstępnie ustawić czas testowania myszy; W takim przypadku ustaw 5 min.
  3. Wprowadź tematy, klikając ikonę "tematy". Kliknij "harmonogram" i zaznacz wszystkie obiekty testowe, a następnie kliknij podwójne zielone strzałki i "faza pierwsza, sesja pierwsza; " Spowoduje to przyciągnięcie wszystkich badanych, aby rozpocząć zbieranie danych.
  4. Umieść mysz na środku otwartego pola i kliknij ikonę "start", aby wyświetlić monit o rozpoczęcie nagrywania. Testuj tylko jedną mysz na raz.
  5. Po upływie 5 minut program automatycznie przejdzie do następnego tematu. W takim przypadku usuń mysz, która ukończyła test i umieść następnego badanego w otwartym polu. Kliknij "start".
  6. Wytrzyj sprzęt. Powtórz kroki 1.3 - 1.4 dla pozostałych badanych.
  7. Aby przeanalizować dane, gdy wszyscy badani przejdą testy, kliknij ikonę "analizuj" w prawym górnym rogu ekranu. Kliknij ponownie "analizuj", a następnie "raport podsumowujący". Opcjonalnie wyeksportuj dane na USB.

2. Test siatki

UWAGA: Powierzchnia i rozmiar siatki na MT mogą wpływać na wydajność. Na MT, jeśli mysz odpadnie w ciągu pierwszych 10 sekund w ciągu pierwszych 2 punktów czasowych, zostanie natychmiast umieszczona z powrotem na siatce w celu podjęcia drugiej próby. Siatka użyta w tym artykule była siatką drucianą, z otworami siatki o średnicy około 1,5 mm.

UWAGA: Zaleca się przeprowadzanie tych testów o tej samej porze dnia, ponieważ parametry fizjologiczne i biochemiczne zmieniają się w ciągu dnia. Masa ciała może mieć wpływ na wyniki w tym teście i dlatego musi być brana pod uwagę.

  1. Umieść mysz na środku siatki i odwróć siatkę co najmniej 20 cm nad przezroczystym pojemnikiem. Po odwróceniu uruchom stoper.
  2. Czas i zapisz czas opóźnienia do spadku. Jeśli mysz nie spadnie w ciągu 60 s, przyznaj jej wynik 60 s i nie przeprowadzaj dalszych prób. Pozwól myszy odpocząć przez co najmniej 5 minut. To jest koniec badania 1.
  3. Wytrzyj sprzęt i podczas 5-minutowej przerwy między próbami przetestuj drugą mysz, jeśli to konieczne. W razie potrzeby powtórz kroki 2.1 - 2.2 dla prób 2 i 3 (dopóki mysz nie uzyska 60 s, powinna przejść trzy próby).

3. Test Rotarod

UWAGA: Powierzchnia i średnica pręta na RT może wpływać na wydajność. Na RT, jeśli mysz odpadnie w ciągu pierwszych 10 sekund w ciągu pierwszych 2 punktów czasowych, natychmiast umieść ją z powrotem na pręcie na drugą próbę.

UWAGA: Zaleca się przeprowadzanie tych testów o tej samej porze dnia, ponieważ parametry fizjologiczne i biochemiczne zmieniają się w ciągu dnia. Masa ciała może mieć wpływ na wyniki w tym teście i dlatego musi być brana pod uwagę.

  1. Włącz rotarody IITC i komputer. Upewnij się, że są prawidłowo podłączone do rejestrowania danych.
  2. Upewnij się, że program korzysta z przyspieszonego protokołu. Ustaw żądaną długość testu rotarodu na xxx (prawidłowy zakres to od 000 do 999); W takim przypadku naciśnij 300*. Ustaw liczbę torów, które mają być używane, na xxx (prawidłowy zakres to od 001 do 005); W takim przypadku naciśnij 005*. Ustaw prędkość początkową na xxx obr./min (wprowadź 3005 dla 5 obr./min; prawidłowy zakres to od 001 do 045); W takim przypadku naciśnij 004*.
  3. Ustaw maksymalną prędkość na xxx obr./min (wprowadź 4,030 dla 30 obr./min; prawidłowy zakres to 001 do 045); w takim przypadku naciśnij 040*. Ustaw prędkość narastania na xxx w s (wprowadź 5,030 dla 30-sekundowej rampy do prędkości maksymalnej; prawidłowy zakres to 000 do 999); W takim przypadku naciśnij 300*. Ustaw jednostkę w trybie myszy (wprowadź 6001 dla myszy do przodu i 6002 dla myszy do tyłu); W takim przypadku naciśnij 6001*.
  4. Upewnij się, że wszystkie namagnesowane pasy ruchu są zrównoważone przed rozpoczęciem próby. Umieść po jednej myszy na każdym pasie rotarodu.
  5. Naciśnij start, aby zainicjować program. Gdy myszy upadną, natychmiast usuń je z ich pasów, aby upewnić się, że nie "potkną się" o inne pasy.
  6. Pozwól myszom odpocząć przez 10-minutową przerwę między próbami. To jest koniec badania 1. W przerwie między próbami wytrzyj sprzęt i rozpocznij próbę dla następnej grupy myszy.
  7. W razie potrzeby powtórz kroki 4 - 6. Jeśli mysz pozostanie na rotarodze przez pełne 5-minutowe próby, nie są wymagane żadne dalsze próby dla tej myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zwierzęta badawcze mogą być poddawane paradygmatowi testów behawioralnych w odstępach tygodniowych lub miesięcznych, aby dostosować się do punktów czasowych niezbędnych do analizy. Przykłady harmonogramu testów behawioralnych przedstawiono na Rysunku 1. W poniższych reprezentatywnych danych, zaczerpniętych z pracy Osmon et al. (2016), myszy poddawano serii testów behawioralnych co miesiąc, zaczynając od 12. tygodnia życia, aż do osiągnięcia punktu końcowego z prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przypadku wszystkich testów oczyść i zdezynfekuj powierzchnię, aby zminimalizować infekcje i rozpraszacze myszy. Upewnij się również, że myszy mają wystarczające okresy odpoczynku między próbami i między testami behawioralnymi podczas korzystania z OFT, RR i MT.

W OFT bardzo ważne jest, aby każda mysz była umieszczona na środku otwartego pola i aby program był uruchamiany po zwolnieniu myszy do środka. Upewnij się, że nie ma żadnych ruchów ręką, które czujniki mogą zarejestrować po uruchomie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Fundacji New Hope Resarch za nieustanne wsparcie i finansowanie naszych badań. Chcielibyśmy również podziękować IITC za częściowe wsparcie finansowe tych prac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IITC Life Sciences Rotarod z oprogramowaniem obliczeniowym Series 8 IITC Life Sciences755
Kwadrat Otwarte Pole 45 x 45 x 40 cm (kolor szary). Dostępny inny kolor podłogi: biały,.Harvard Aparatus (PanLab)760190
  Wstępnie skonfigurowany moduł Open FieldHarvard Aparatus (PanLab)760688
Platforma oprogramowania Smart V3.0 Harvard Aparatus (PanLab)760681
Konwerter wideo (analogowy/cyfrowy)Harvard Aparatus (PanLab)760262
System mocowania dachu do kameryHarvard Aparatus (PanLab)760277
Analogowy aparat i obiektyw SonyNTSCHarvard Aparatus (PanLab)760505

Bibliografia

  1. Osmon, K. J., et al. Systemic Gene Transfer of a Hexosaminidase Variant Using an scAAV9.47 Vector Corrects GM2 Gangliosidosis in Sandhoff Mice. Human Gene Therapy. 27 (7), 497-508 (2016).
  2. Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nature Reviews, Neuroscience. 10, 519-529 (2009).
  3. Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Moser, P. Behavioural and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Exp. Neurol. 169, 239-254 (2001).
  4. Menalled, L. B., et al. Early motor dysfunction and striosomal distribution of huntingtin microaggregates in Huntington's disease knock-in mice. J.Neurosci. 22, 8266-8276 (2002).
  5. Grusser, C., Grusser-Cornehls, U. Improvement in motor performance of Weaver mutant mice following lesion of the cerebellum. Behav. Brain Res. 97, 189-194 (1998).
  6. De Leonibus, E., et al. Spatial deficits in a mouse model of Parkinson's disease. Psychopharmacology (Berl). 194, 517-525 (2007).
  7. Morris, M., Koyama, A., Masliah, E., Mucke, L. Tau Reduction Does Not Prevent Motor Deficits in Two Mouse Models of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6 (12), 1-7 (2011).
  8. Abo-ouf, A., et al. Deletion of tumour necrosis factor-α ameliorates neurodegeneration in Sandhoff disease mice. Human Molecular Genetics. , 1-16 (2013).
  9. Dumont, M. Behavioral Phenotyping of Mouse Models of Neurodegeneration. Neurodegeneration : Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 793, 229-237 (2011).
  10. Cabe, P. A., Tilson, H. A., Mitchell, C. L., Dennis, R. A simple recording grip strength device. Pharmacol. Biochem. 8, 101-102 (1978).
  11. Barnēoud, P., Loliver, J., Sanger, D., Moser, P. Quantitative motor assessment in FALS mice: a longitudinal study. Neuroreport. 8, 2861-2865 (1997).
  12. Lui, Y., et al. Mouse model of GM2 activator deficiency manifests cerebellar pathology and motor impairment. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8133-8143 (1997).
  13. Sango, K., et al. Mouse models of Tay-Sachs and Sandhoff diseases differ in neurologic phenotype and ganglioside metabolism. Nature Genetics. 11 (2), 170-176 (1995).
  14. Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor inco-ordination in naïve mice. Nauyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 259 (2), 211(1968).
  15. Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (76), (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test otwartego polatest siatkitest rotarodlokomocja myszykoordynacja ruchowatesty behawioralnebadania przedkliniczneocena funkcji ruchowychanaliza ruchu myszy

Powiązane artykuły