Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55495

⸱

3 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering, Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems, National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program, DUKE-NUS Graduate Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie żywych komórek krwi oznaczonych krwinek w krążeniu ocznym może dostarczyć informacji o stanie zapalnym i niedokrwieniu w retinopatii cukrzycowej oraz zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem. Opisano protokół oznaczania komórek krwi i obrazowania znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym.

Streszczenie

Dynamika przepływu krwi w siatkówkach i naczyniówkach może dostarczyć wglądu w patofizjologię i następstwa różnych chorób oczu, takich jak jaskra, retinopatia cukrzycowa, zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i inne stany zapalne oka. Może również pomóc w monitorowaniu odpowiedzi terapeutycznych w oku. Prawidłowe znakowanie komórek krwi, w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek znakowanych, pozwala na badanie dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym i naczyniówkowym. Tutaj opisujemy znormalizowane protokoły znakowania 1,5% zielenią indocyjaninową (ICG) i 1% fluoresceiną sodową odpowiednio erytrocytów i leukocytów myszy. Skaningowa oftalmoskopia laserowa (SLO) została zastosowana do wizualizacji znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym myszy C57BL / 6J (typ dziki). Obie metody wykazały wyraźne fluorescencyjnie znakowane komórki w krążeniu siatkówkowym myszy. Te metody znakowania mogą mieć szersze zastosowanie w różnych modelach chorób oczu.

Wprowadzenie

Badanie dynamiki przepływu komórek krwi w krążeniu siatkówkowym i naczyniówkowym jest niezbędne do zrozumienia patogenezy potencjalnie zagrażających widzeniu chorób oczu i innych stanów zapalnych oczu. Jednak konwencjonalne techniki angiografii, które polegają na wiązaniu barwników fluorescencyjnych z białkami osocza, nie dostarczają żadnych informacji dotyczących dynamiki erytrocytów lub leukocytów1. Dynamika przepływu siatkówki erytrocytów jest ważna dla badania metabolicznie wydajnego krążenia w siatkówce oraz dynamiki przepływu leukocytów, dla zrozumienia migracji, rozpoznawania, adhezji i niszczenia komórek w różnych stanach zapalnych2. Istnieje kilka cząsteczek fluorescencyjnych używanych do identyfikacji i charakterystyki różnych typów komórek3. Hemodynamikę komórek krwi można zmierzyć, barwiąc je odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi i stosując odpowiednie techniki obrazowania4.

Obecność reakcji zapalnych w chorobach wewnątrzgałkowych, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i retinopatia cukrzycowa (DR), wiąże się z akumulacją limfocytów w obszarze chorym5,6. Śledzenie komórek odpornościowych w tkankach może pomóc w zrozumieniu złożonych zdarzeń związanych z mechanizmem patogenezy choroby. Izotopy promieniotwórcze, takie jak 51Cr i 125I, były używane jako znaczniki komórek we wczesnych badaniach. Barwniki te są toksyczne i wpływają na żywotność komórek. Chociaż markery radioaktywne 3H i 14C są mniej toksyczne dla komórek, ze względu na ich niższe energie emisji, trudno jest wykryć ich sygnały w systemie7,8. Wprowadzono szereg barwników fluorochromowych, aby przezwyciężyć potencjalne problemy związane z markerami radioaktywnymi i śledzić migrację limfocytów in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej9,10. Hoechst 33342 i oranż tiazolowy to barwniki fluorescencyjne wiążące DNA, które są używane do śledzenia limfocytów in vivo. Hoechst 33342 wiąże się z regionami DNA bogatymi w AT, jest przepuszczalny dla błony, zachowuje sygnały fluorescencyjne przez 2 - 4 dni i jest odporny na wygaszanie9,10. Wadami Hoechst 33342 i oranżu tiazolowego są hamowanie proliferacji limfocytów11 i krótki okres półtrwania, odpowiednio9.

Calcein-AM, dioctan fluoresceiny (FDA), 2′,7′-bis-(2-karboksetylo)-5-(i-6)-karboksyfluoresceina, ester acetoksymetylowy (BCECF-AM), dioctan 5-(i-6)-karboksyfluoresceiny (CFDA) i 5-(i-6)-dioctan karboksyfluoresceiny ester acetoksymetylowy (CFDA-AM) to cytoplazmatyczne barwniki fluorescencyjne używane do badań migracji limfocytów. Jednak FDA, CFDA i CFDA-AM mają niższą retencję w komórkach9. BCECF-AM zmniejsza odpowiedź proliferacyjną i wpływa na chemotaksję i produkcję ponadtlenków9,12. Calcein-AM jest barwnikiem fluorescencyjnym i jest przydatny w krótkoterminowych badaniach migracji limfocytów in vivo. Emituje silne sygnały fluorescencyjne, nie zakłóca większości funkcji komórkowych i zachowuje sygnały fluorescencyjne przez okres do 3 dni12,13. Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) i ester sukcynimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDA-SE) są kowalencyjnymi barwnikami fluorescencyjnymi sprzęgającymi, które są stosowane do badań migracji limfocytów. FITC nie wykazuje wpływu na żywotność komórek i ma silniejsze powinowactwo do limfocytów B niż limfocytów T14,15. Limfocyty znakowane CFDA-SE mogą być śledzone in vivo przez ponad 8 tygodni i do 8 podziałów komórkowych9,16. C18 DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), DiO (nadchloran 3,3'-dioctadecyloxacarbocyjaniny), Paul Karl Horan (PKH)2, PKH3 i PKH26 to fluorescencyjne barwniki karbocyjaninowe wprowadzające błonę, używane do znakowania leukocytów i erytrocytów. C18 Dil i DiO wykazują wyższe sygnały po włączeniu do błony komórkowej i są stosunkowo nietoksyczne12,17. Komórki znakowane PKH2, PKH3 i PKH26 wykazują dobrą retencję sygnałów fluorescencyjnych przy mniejszej toksyczności18,19,20,21,22. Jednak PKH2 w dół reguluje ekspresję CD62L i zmniejsza żywotność limfocytów23.

Większość wyżej wymienionych badań została przeprowadzona w celu śledzenia migracji i proliferacji limfocytów w układzie limfatycznym oraz badania oznaczonych erytrocytów w krążeniu nieocznym. Istnieje bardzo niewiele badań, w których stosuje się techniki znakowania do badania komórek krwi w krążeniu ocznym. Zastosowanie skaningowej oftalmoskopii laserowej (SLO) ma ogromną zaletę w badaniu znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym i naczyniówkowym in vivo za pomocą angiografii dna oka24. Istnieje kilka barwników fluorescencyjnych, takich jak ICG, oranż akrydynowy, FITC, fluoresceina sodu i CFDA, które są używane do badania leukocytów w krążeniu siatkówkowym za pomocą SLO25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Fototoksyczność i rakotwórczość oranżu akrydynowego 26,27, interferencja FITC z aktywnością komórkową oraz wymóg stosowania wewnątrznaczyniowego środka kontrastowego w celu rozwiązania naczyń krwionośnych siatkówki i naczyniówki ogranicza ich zastosowanie w eksperymentach na zwierzętach in vivo29. Fluoresceina sodu i ICG są nietoksyczne, zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków oraz bezpieczne do testowania na ludziach32,35. Większość badań dynamiki przepływu jest związana z znakowaniem leukocytów lub erytrocytów i ich wizualizacją w naczyniach krwionośnych siatkówki i naczyniówki36,37,38,39. W tym miejscu opisujemy znormalizowany protokół znakowania erytrocytów ICG, znakowania leukocytów fluoresceiną sodową i śledzenia wizualizowanych znakowanych komórek w krążeniu siatkówki myszy za pomocą SLO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt SingHealth w Singapurze i są zgodne z wytycznymi Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) Oświadczenie dotyczące wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Znakowanie erytrocytów i leukocytów barwnikami fluorescencyjnymi

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować ICG (1,5 mg/ml) rozpuszczając 3 mg ICG w 1800 μl sterylizowanej wody destylowanej. Dodać 200 μl 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Przygotuj 40% 1x PBS, dodając 4 ml 1x PBS do 6 ml wysterylizowanej wody destylowanej. Przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, dodając 100 mg BSA do 10 ml 1x PBS. Dobrze wymieszaj, aż BSA się rozpuści.
  2. Izolacja erytrocytów i leukocytów za pomocą wirowania w gradientacji gęstości
    1. Znieczulić myszy (typ dziki C57BL/6) za pomocą kombinacji chlorowodorku ketaminy (50 mg/kg) i chlorowodorku ksylazyny (0,5 mg/kg) (zgodnie z harmonogramem 1, zgodnie z wytycznymi ARVO). Potwierdź znieczulenie odruchem wycofania pedału (tj. uszczypnięciem palca u nogi).
    2. Powoli wprowadzić igłę o rozmiarze 29 (dołączoną do strzykawki o pojemności 1 ml) pod kątem żebrowym skierowanym w stronę serca. Aby upewnić się, że igła znajduje się wewnątrz serca, należy lekko odsunąć tłok i sprawdzić, czy krew została pobrana do strzykawki. Eksangwinian 0,8 - 1 ml krwi bezpośrednio z serca.
    3. Natychmiast przenieść krew do probówki z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (1,8 mg/ml krwi) zawierającej krew i delikatnie wymieszać, aby zapobiec krzepnięciu krwi.
    4. Poddaj myszy eutanazji, podając pentobarbital (80 mg / kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
    5. Ułóż krew pełną na wierzchu roztworu polisacharozy i diatrizoinianu sodu (stosunek 1:1; gęstość 1,077 g/ml) w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml i odwiruj (450 x g, 30 min), aby umożliwić oddzielenie leukocytów i erytrocytów od osocza.
    6. Usunąć i wyrzucić supernatant (osocze) za pomocą pipety. Ostrożnie przenieś kożuszek (leukocyty) i erytrocyty (warstwę czerwonych krwinek) do nowych i oddzielnych probówek za pomocą pipet.
  3. Znakowanie ICG (1,5%) erytrocytów
    1. Umyj erytrocyty 1x PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Ponownie zawieś erytrocyty w 1x PBS (1:1), aby uzyskać 50% hematokrytu. Podwielokrotność 0,5 ml 50% hematokrytu (~ 250 μL upakowanych erytrocytów) do probówek do mikrowirówek. Odwirować erytrocyty (750 x g, 5 min) i odrzucić supernatant.
    2. Dodać 200 μL 40% 1x PBS do granulowanych erytrocytów, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać 100 μL ICG (1,5 mg/ml) do zawiesiny erytrocytów, delikatnie wymieszać odwracając probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać 300 μL 1x PBS i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką przez 60 min.
    3. Odwirować erytrocyty nośnika (750 x g, 3 min) i ponownie zawiesić w 1 ml 1x PBS.
    4. Przemyć komórki ~ 3 - 5 razy 1x PBS, aż supernatant będzie klarowny (krok 1.3.3). Po ostatnim przemyciu zdekantować supernatant i dodać 1% BSA PBS (1:1) do znakowanych, wstępnie spęczniałych erytrocytów, aby uzyskać 50% hematokrytu (1,25 x 108 komórek/ml) erytrocytów znakowanych ICG.
  4. Znakowanie leukocytów fluoresceiną sodu (1%)
    1. Po oddzieleniu kożucha od krwi za pomocą wirowania w gradionym gradieniu gęstości (od kroku 1.2.6), przemyć komórki raz 10 ml 1x PBS, wirując przy 450 x g przez 10 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Zawiesić osad w 900 μL 1x PBS.
    2. Dodać 100 μl 10% fluoresceiny sodu do 900 μl zawiesiny leukocytów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. Umyć znakowane komórki trzykrotnie 10 ml 1X PBS przez odwirowanie (450 x g, 10 min). Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1x PBS.

2. Obrazowanie na żywo komórek znakowanych fluorescencyjnie

  1. Obrazowanie żywych komórek erytrocytów znakowanych ICG
    1. Aby przygotować komórki do wstrzyknięcia przez żyłę ogonową lub drogę zaoczodołową, rozcieńczyć 50% hematokrytu erytrocytów znakowanych ICG 10-krotnie i 50-krotnie 1x PBS, aby uzyskać odpowiednio 5% i 1% komórek hematokrytu.
    2. Umieść mysz pod światłem podczerwonym (intensywność 250 W) na 5 minut, aby żyła ogonowa mogła się rozszerzyć. Znieczulić mysz chlorowodorkiem ketaminy (50 mg/kg) i chlorowodorkiem ksylazyny (0,5 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (tutaj, zgodnie z harmonogramem 1, zgodnie z wytycznymi ARVO).
    3. Rozszerz każdą źrenicę oczu kroplą 0,5% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny.
    4. Umieść soczewkę kontaktową na jednym oku w celu wykonania obrazowania. Żel okulistyczny należy stosować jako podłoże do obrazowania i zapobiegania wysuszeniu rogówki. Zamocuj konfokalną laserową kamerę oftalmoskopową do skaningu laserowego (SLO) z soczewką +25 dioptrii, aby skompensować załamanie oka myszy.
    5. Umieść mysz na platformie obrazowania SLO. Upewnij się, że rogówka myszy jest skierowana prosto w stronę głowicy optycznej urządzenia SLO.
    6. Włącz moduł obrazowania. Korzystając z powiązanego oprogramowania modułu obrazowania, kliknij przycisk "Nowy pacjent" i dodaj dane identyfikacyjne zwierzęcia, takie jak numer kolczyka myszy, data urodzenia, procentowa zawartość barwnika fluorescencyjnego i oznaczony typ komórki.
      1. Umieść nerw wzrokowy zwierzęcia na środku ekranu obrazowania, manewrując modułem obrazowania. Korzystając z odpowiedniego oprogramowania modułu obrazowania, kliknij przycisk "Pobierz", aby wykonać zdjęcia dna oka w podczerwieni (IR) z ustawieniem kąta widzenia 30° lub 15°. Upewnij się, że środek siatkówki, źrenica i ścieżka optyczna lasera są wyrównane, aby uzyskać obraz o najlepszej jakości.
        UWAGA: Ścieżka optyczna jest wyrównywana poprzez manewrowanie joystickiem w celu uzyskania najostrzejszego obrazu i najlepszej ekspozycji oświetlenia.
    7. Obejrzyj film na temat badania dna oka ICG.
      1. Włącz filtr ICG (790 nm), ustaw kamerę w trybie wysokiej prędkości z widokiem pod kątem 30° lub 15° i ustaw intensywność ICG na 85 dla wszystkich odczytów w celu standaryzacji. Na panelu sterowania kliknij przycisk "Pobierz", aby nagrywać wideo (kontrola podstawowa) z prędkością 8,8/15 klatek/s przez 1 minutę.
    8. Załaduj 100 μl erytrocytów znakowanych ICG do strzykawki insulinowej przymocowanej do igły o rozmiarze 30.
      1. W przypadku wstrzyknięcia przez żyłę ogonową, należy wprowadzić igłę pod kątem do żyły ogonowej. Potwierdź dostęp dożylny, sprawdzając przepływ wsteczny krwi do strzykawki i wstrzyknij znakowane komórki do krążenia.
      2. W przypadku wstrzyknięcia drogą zaoczodołową należy wprowadzić igłę przylegającą do oka do przestrzeni zaoczodołowej. Potwierdź dostęp zadoczodołowy, sprawdzając przepływ wsteczny krwi do strzykawki i wstrzyknij znakowane komórki do krążenia.
    9. Po wstrzyknięciu zmień położenie myszy i wykonaj zdjęcia dna oka w podczerwieni (patrz krok 2.1.6.1) oraz wideo za pomocą filtra ICG (patrz krok 2.1.7.1). Znakowane komórki w krążeniu siatkówkowym można uwidocznić natychmiast po wstrzyknięciu komórek.
    10. Po pobraniu klatek wideo wyodrębnij .tiff obrazy sekwencji wideo, wybierając format .tiff podczas eksportowania wideo za pomocą oprogramowania modułu wyświetlania SLO. Zapisz pliki w żądanym folderze.
    11. Zdejmij soczewkę kontaktową, umieść ją na drugim oku i dokończ obrazowanie zgodnie z opisem w krokach 2.1.4 - 2.1.7.
    12. Po zobrazowaniu umieść znieczulone zwierzę pod światłem podczerwonym (250 W), aby utrzymać temperaturę ciała do czasu powrotu do zdrowia po znieczuleniu. Gdy zwierzę w pełni wyzdrowieje, umieść mysz z powrotem w klatce.
  2. Obrazowanie żywych komórek leukocytów znakowanych 1% fluoresceiną sodu
    1. Przygotuj mysz i ustaw instrument zgodnie z opisem w rozdziale 2.1.
    2. Ustaw mysz i wykonaj zdjęcia dna oka w podczerwieni zgodnie z opisem w krokach 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Uzyskaj angiogram fluoresceinowy myszy za pomocą filtra fluoresceinowego (488 nm) w trybie szybkiej kamery z kątem widzenia 30° lub 15° i intensywnością fluoresceiny przy 85 dla wszystkich odczytów w celu standaryzacji. Nagraj wideo (kontrola linii bazowej) z prędkością 8,8/15 klatek/s (patrz krok 2.1.7.1).
        UWAGA: W tym przypadku wiele ścieżek filmów (1-minutowe filmy) zostało zarejestrowanych w różnych odstępach czasu.
    3. Wstrzyknąć 100 μl znakowanych leukocytów myszy przez żyłę ogonową lub wstrzyknięcie zaoczodołowe, jak opisano w sekcji 2.1.8.
    4. Natychmiast po wstrzyknięciu należy ustawić mysz w odpowiedniej pozycji i wykonać zdjęcia dna oka w podczerwieni (patrz kroki 2.1.5 i 2.1.6) oraz angiogram fluoresceinowy myszy (patrz punkt 2.2.2).
    5. Obserwuj znakowane komórki w siatkówkach lub naczyniach krwionośnych, regulując ogniskową lasera skanującego, obracając pokrętło ostrości na module obrazowania.
    6. Zdobądź klatki wideo i obrazy za pomocą oprogramowania modułu wyświetlania SLO (patrz krok 2.1.10) i zapisz je w wybranym folderze.
    7. Po zabiegu postępuj zgodnie z krokiem 2.1.12 dotyczącym opieki nad zwierzętami.
  3. Analiza obrazu za pomocą oprogramowania MtrackJ
    1. Otwórz sekwencję obrazów w ImageJ, klikając "Plik". Wybierz "Importuj" i wybierz "Sekwencja obrazów", wybierz żądany folder obrazów i kliknij "Otwórz". Na ekranie pojawi się wyskakujące okienko o nazwie "Opcje sekwencji". Kliknij "OK"; Otworzy się sekwencja obrazów.
    2. Ustaw interwał klatek obrazu wideo, klikając "Obraz" i wybierz "Właściwości" do pomiarów prędkości. Tutaj jest to 8,8 klatki/s.
    3. Otwórz wtyczkę MTrackJ, wybierając "Wtyczki". Wybierz "Śledzenie", a następnie wybierz "MtrackJ". Powinno pojawić się menu.
    4. Aby dostosować ustawienia śledzenia, wybierz "Śledzenie" (pod menu) i zaznacz pole "Przenieś do następnego indeksu przedziału czasowego po dodaniu punktu".
    5. Śledź pierwszą komórkę.
      1. Zlokalizuj jedną komórkę i śledź tę samą komórkę w kolejnych klatkach. W menu kliknij "Dodaj", aby dodać nowy utwór.
      2. Najedź kursorem na obraz (znak +) i kliknij odpowiednią komórkę.
        UWAGA: MTrackJ automatycznie przeskoczy do następnego przedziału czasowego i doda małe kółko, oznaczające pozycję pierwszego punktu na trajektorii.
      3. Kontynuuj klikanie bieżącej pozycji komórki podczas przechodzenia przez klatki sekwencji obrazów.
        UWAGA: Czasami okręgi oznaczające poprzednie punkty trajektorii zakłócają możliwość wyświetlenia bieżącej lokalizacji. W takim przypadku przejdź do kroku 2.3.5.3.1.
        1. Zmień opcję wyświetlania trajektorii, klikając "Wyświetlanie" w menu i wybierając opcję "wyświetlaj tylko punkty trasy w bieżącym czasie". Aby wyświetlić wszystkie trajektorie, usuń zaznaczenie tej opcji.
      4. Kontynuuj klikanie, aż zobaczysz trajektorię pierwszej komórki. Następnie zapisz utwór, klikając "Zapisz".
    6. Śledź drugą komórkę.
      1. W menu kliknij "Dodaj", aby rozpocząć nowy utwór. Powtórz kroki od 2.3.5.1 do 2.3.5.4, aby śledzić nową komórkę. Kliknij "Zapisz", aby zapisać drugi utwór.
      2. Kontynuuj te kroki dla wszystkich obserwowanych komórek, które można śledzić. Po śledzeniu komórek kliknij "Zmierz" i "OK" w zakładce menu, aby uzyskać wyniki.
        UWAGA: Automatycznie otworzy się okno wyników, które można zapisać i otworzyć w arkuszu kalkulacyjnym w celu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Erytrocyty znakowane 1,5% ICG wizualizowano w krążeniu siatkówkowym myszy C57BL/6J (typ dziki). W krążeniu siatkówkowym możliwe było rozróżnienie zarówno 1%, jak i 5% hematokrytu erytrocytów znakowanych 1,5% ICG. Jednakże pojedyncze znakowane komórki były wyraźniej widoczne przy 1% hematokrycie erytrocytów znakowanych 1,5% ICG (Rysunek 1). Przy 5% hematokrycie, ze względu na dużą liczbę znakowanych komórek w naczyniach siatkówki, nie było możliwe oznaczenie p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie hemodynamiki w krążeniu siatkówkowym i naczyniówkowym jest niezbędne do zrozumienia patofizjologii wielu chorób oczu. Dynamikę przepływu krwi w krążeniu siatkówkowym można badać za pomocą optycznej koherentnej tomografii w domenie Fouriera (FD-OCT), laserowej przepływomierza plamkowego (LSFG) i oksymetrii siatkówki. Chociaż metody te wykorzystują różne podejścia do badania całkowitego przepływu krwi w krążeniu siatkówkowym 40,41,42,43,44,45, łączy je ograniczenie polegające na niemożności zbadania dynamiki przepł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Brak konfliktu finansowego lub konfliktu interesów.

Podziękowania

Projekt badawczy został sfinansowany w ramach grantu dla nowych badaczy od Narodowej Rady Badań Medycznych (NMRC), Singapur. Zespół pragnie podziękować za szkolenie badawcze prowadzone przez dr Agrawala w Instytucie Okulistyki (IoO), University College London (UCL) w ramach stypendium National Medical Research Council (NMRC) Overseas Research Training Fellowship od listopada 2012 r. do października 2014 r. pod kierunkiem prof. Davida Shimy. Dr Agrawal nabył koncepcję i umiejętności znakowania komórek i obrazowania na żywo w laboratorium dr Shimy. W związku z tym zespół będzie wdzięczny za nadzór i wskazówki podczas stypendium szkoleniowego ze strony prof. Davida Shimy, pro.f Kenitha Meissnera, dr Petera Lundha i dr Daiju Iwata.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Barwnik polimetynowy Cardiogreen (zieleń indocyjaninowa)Sigma Aldrich12633-50MG
Fluoresceina 100 mg/mlNovartisU1705A/H-1330292
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) Ultra Pure Grade1st BASEBUF-2040-10X1L
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA7906-100G
Probówki mikrotainerowe z K2E (K2EDTA) - stężenie EDTA - 1,8 mg/ml krwiBD, USAREF
Roztwór histofaque 1077Wirówka Sigma Aldrich10771
5810 REppendorf05-413-401
Probówki do mikrowirówek 2 mlAxygenMCT-200-C-S
Mieszalnik wirowyInsta BioAnalytik pte. ltdFINE VORTEX
Inkubator z wytrząsarkąLab Tech
Ceva Ketamina do wstrzykiwań (Chlorowodorek ketaminy 100 mg/ml)CevaKETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (chlorowodorek ksylazyny 20 mg/ml)Troy Laboratories PTY. LimitedLI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamid 1%)Alcon  Laboratories, Inc. Stany ZjednoczoneNDC  0998-0355-15
2,5% Mydfrin 5 ml (chlorowodorek fenylefryny 2,5%)Alcon  Laboratories, Inc. Stany ZjednoczoneNDC  0998-0342-05
Strzykawka Terumo z igłą 1 cc/ml TuberculinTerumo (Philippenes) Corporation, FilipinySS-01T2613
Żel Vidisic 10 gDr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Niemcy
Waciki nasączone alkoholemAssure medyczne materiały jednorazowego użytku7M-004-L-01
Konfokalny laserowy skaningowy system angiografii (Heidelberg Retina Angiograph 2)Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Niemcy
Oprogramowanie Hiedelberg Spectralis Viewing Module, v4.0Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Niemcy
Mikroskop fluorescencyjnyZEISSModel: axio imager z1
365974

Bibliografia

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650(2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25(2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie erytrocyt wznakowanie leukocyt wskaningowa oftalmoskopia laserowaindocyjanina zielonafluoresceina sodowaizolacja kom rek krwimikroskopia fluorescencyjnaanaliza ledzenia kom rekmodele chor b oczu
Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.