Artykuł metodologiczny

Metoda powinowactwa do DNA G-quadruplex do oczyszczania enzymatycznie aktywnej resolwazy G41

DOI:

10.3791/55496

⸱

18 marca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Wake Forest School of Medicine, 2YX Genomics, 3Department of Biology, Ball State University, 4Department of Hematology and Oncology, Roper St. Francis Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G4 Resolvase1 wiąże się ze strukturami G-quadruplex (G4) o najściślejszym zgłoszonym powinowactwie do białka wiążącego G4 i reprezentuje większość aktywności odwijania G4-DNA w komórkach HeLa. Opisujemy nowatorski protokół, który wykorzystuje powinowactwo i zależną od ATP aktywność odwijania G4-Resolvazy1 do specyficznego oczyszczania katalitycznie aktywnego rekombinowanego G4R1.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktury kwasów nukleinowych wyższego rzędu zwane G-kwadrupleksami (struktury G4, G4) mogą tworzyć się w bogatych w guaninę regionach zarówno DNA, jak i RNA i są wysoce stabilne termicznie. W ludzkim genomie znajduje się > 375 000 przypuszczalnych sekwencji tworzących G4, które są wzbogacone w regiony promotorowe, regiony nieulegające translacji (UTR) oraz w powtórzeniach telomerowych. Ze względu na potencjał tych struktur do wpływania na procesy komórkowe, takie jak replikacja i transkrypcja, komórka wyewoluowała enzymy, aby nimi zarządzać. Jednym z takich enzymów jest resolwaza G4 1 (G4R1), która została biochemicznie scharakteryzowana przez nasze laboratorium i Nagamine et al. i stwierdzono, że bardzo ściśle wiąże się zarówno z G4-DNA, jak i G4-RNA (Kd w zakresie niskiego pM). G4R1 jest źródłem większości aktywności rozdzielczej G4 w lizatach komórek HeLa i od tego czasu uważa się, że odgrywa rolę w metabolizmie telomerów, rozwoju limfy, transkrypcji genów, hematopoezie i nadzorze immunologicznym. Zdolność do efektywnej ekspresji i oczyszczania aktywnego katalitycznie G4R1 ma znaczenie dla laboratoriów zainteresowanych uzyskaniem dalszego wglądu w oddziaływanie kinetyczne struktur G4 i enzymów rozdzielczych G4. Tutaj opisujemy szczegółową metodę oczyszczania rekombinowanego G4R1 (rG4R1). Opisana procedura obejmuje tradycyjne, oparte na powinowactwie oczyszczanie C-końcowego enzymu znakowanego histydyną, ulegającego ekspresji w ludzkich bakteriach zoptymalizowanych pod kątem kodonów, z wykorzystaniem zdolności rG4R1 do wiązania i rozwijania G4-DNA w celu oczyszczenia wysoce aktywnego enzymu w etapie elucji zależnym od ATP. Protokół obejmuje również etap kontroli jakości, w którym mierzy się aktywność enzymatyczną rG4R1 poprzez badanie zdolności oczyszczonego enzymu do rozwijania G4-DNA. Opisano również metodę, która pozwala na ilościowe oznaczenie oczyszczonego rG4R1. Omówiono alternatywne adaptacje tego protokołu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G4 struktury są wysoce stabilnymi drugorzędowymi strukturami kwasu nukleinowego, które tworzą się w bogatych w guaninę regionach DNA i RNA. Struktury G4 są stabilizowane poprzez oddziaływania wiążące Hoogsteena i koordynują wiązanie w centralnej jamie z kationami jednowartościowymi (tj.K+ i Na+), które znacząco przyczyniają się do niezwykłej stabilności termicznej struktur G41,2. Wczesne badania bioinformatyczne sugerowały, że ludzki genom zawiera > 375 000 "potencjalnych motywów tworzących G4"3,4. Nowsze szacunki badań sugerują, że liczba motywów G4 jest wyższa o czynnik 2-55, podczas gdy inne badanie przewiduje 716 310 różnych potencjalnych sekwencji tworzących G4 w ludzkim genomie6. Sekwencje tworzące G4 są ewolucyjnie konserwatywne i nie są losowo rozproszone w genomie. Motywy G4 są wzbogacone w regiony kodujące geny, a ponad 40% wszystkich promotorów genów zawiera motywy G47. Co ciekawe, wykazano, że stopień wzbogacenia motywów G4 w genie sugeruje funkcję genu. Na przykład protoonkogeny i geny biorące udział w rozwoju mają znacznie większe wzbogacenie struktur G4 niż geny supresorowe nowotworów8,9.

Dzięki wysokiej stabilności termicznej, niemal wszechobecnej obecności w całym genomie i możliwości znaczącego wpływu na główne procesy komórkowe, nie jest zaskakujące, że komórka wyewoluowała enzymy do zarządzania tymi strukturami. Jednym z takich enzymów jest resolwaza G4 (G4R1; zwana również RHAU i DHX36), którą scharakteryzowaliśmy jako źródło większości tetramolekularnej aktywności rozdzielczej G4-DNA w komórkach ludzkich (HeLa)10. Od tego czasu wykazano, że G4R1 ściśle wiąże i katalitycznie rozwija tetramolekularne i jednocząsteczkowe G4-DNA i G4-RNA z najściślej zgłoszonymi KD dla białka wiążącego G411,12,13. Dodatkowo, aktywność G4R1 w zakresie rozpoznawania G4 jest zaangażowana w szeroki zakres procesów biochemicznych i komórkowych, w tym biologię telomerów/telomerazy11,14,15,16, transkrypcja i splicing17,18,19,20, development21, hematopoiesis21, oraz regulacja immunologiczna22,23. Z przewagą sekwencji G4 specyficznie rozmieszczonych w całym genomie i różnorodnymi procesami komórkowymi, w które ostatnio zaangażowano G4R1, zdolność do ekspresji i skutecznego oczyszczania wysoce aktywnego rG4R1 będzie miała ogromne znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów biochemicznych i zachowań tego białka.

Tutaj demonstrujemy nowatorski schemat ekspresji i oczyszczania (Rysunek 1), który wykorzystuje zależną od ATP, rozdzielczą aktywność G4R1 RG4R1 do efektywnej izolacji aktywnego enzymu. Schemat ten można dostosować do oczyszczania innych enzymów kwasów nukleinowych zależnych od ATP, dla których produkt reakcji enzymatycznej nie jest już substratem do wiązania, jak ma to miejsce w przypadku G4R1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie struktur G4-DNA do użycia do oczyszczania rG4R1 (tworzenie biotynylowanego G4-DNA G-Quadruplex)

  1. Zamów następujący oligomer DNA, zwany Z33-Bio, w skali 1 μmol: 5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotyna 3'. Upewnij się, że ugrupowanie biotyny znajduje się na końcu 3' oligomeru.
  2. Przygotuj 10x bufor G4: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA i 2,500 mM NaCl.
  3. Zawiesić oligomer Z33 w 250 μL wody (tak, aby stężenie oligomeru wynosiło ~2,5 mM). Dodaj 25 μl 10x buforu G4 i wymieszaj. Inkubować oligomer w temperaturze 50 °C przez ~48 godzin.
  4. Krótko odkręć rurkę, aby zebrać kondensat (~1,000 x g, 10 s). Dodać ~50 μL wysokomasowego, hydrofilowego polisacharydu (30% Ficoll inH2O) i wymieszać. Wlać 10% akrylamid/1x TBE/10% żelu glicerolowego (wymiary żelu: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Po polimeryzacji żelu przemyj studzienki 1x TBE i załaduj uformowany oligomer Z33-Bio równomiernie na większości żelu (obciążenie pasa próbki można zwizualizować za pomocą linii Schlierena).
    1. Na jednym pasie na końcu żelu załaduj niewielką część oligomeru, który był podgrzewany w temperaturze 98 °C przez 10 minut (posłuży to jako kontrola nieustrukturyzowana), a także niewielką ilość barwnika ładującego żel na innym pasie, aby monitorować, jak daleko przeszedł żel.
  5. Użyj 1x TBE jako bufora do biegania żelu i uruchom żel pod napięciem 120 V, aż czoło barwnika przejdzie przez co najmniej 1/3 żelu.
  6. Umieścić płytkę do chromatografii cienkowarstwowej szorstką stroną do góry w ochraniaczu arkusza (lub przykryć folią). Zdejmij jedną ze szklanych płytek i przenieś żel na powierzchnię osłony arkusza. Wyłącz górne światła i zacienij żel promieniami UV (długa długość fali: 365 nm). Użyj świeżej żyletki i wytnij pasmo G-quadruplex-Z33-Bio, które będzie postrzegane jako biegnące wyżej w żelu (mające wolniejszą ruchliwość) w stosunku do stopionej kontroli.
  7. Umieść plasterek żelu zawierający utworzony G4-DNA w probówce o pojemności 50 ml i dodaj tylko tyle buforu do namaczania, aby pokryć plasterek żelu (bufor do namaczania składa się z 1/3 objętości 10x TBE, 1/3 objętości nasyconego octanu sodu i 1/3 objętościH2O). Umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C (nienawilżanym) i inkubować O/N.
  8. Przenieś roztwór do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 1/10 objętości glikogenu (glikogen o stężeniu 20 mg/ml w 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM EDTA pH 8 i 0,05% azydku sodu) i ~1,2x objętość izopropanolu.
    UWAGA: Azydek sodu jest bardzo toksyczny, dlatego należy go stosować ostrożnie!
    1. Wymieszać probówkę i umieścić ją w temperaturze -20 °C na co najmniej 2 godziny. Wirować probówkę o stężeniu 2 700 x g w wirówce stołowej schłodzonej do temperatury 4 °C przez 12 minut. Delikatnie zdekantować roztwór z granulowanego G4-DNA. Przemyj granulat 3 razy 70% EtOH + 50 mM NaCl (sól w praniu ma kluczowe znaczenie dla stabilności G4). Odchować nadmiar płynu niestrzępiącą się bibułą.
  9. Umyty granulat należy umieścić w lodówce na co najmniej 2 godziny, aby nawodnić osad i umożliwić łatwiejsze jego wymieszanie. Zawiesić osad w 50 μl buforu TNE (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl i 0,05 mM EDTA pH 8).
  10. Umieścić 5 μL tego utworzonego G-kwadrupleksu DNA w 495 μlH2Oi określić ilościowo za pomocą spektrofotometru, który umożliwia określenie współczynnika ekstynkcji poprzez wprowadzenie składu nukleotydowego oligomeru (współczynnik ekstynkcji oligomeru DNA Z33 o składzie zasadowym A = 8, C = 3, G = 15, a T = 7 wynosi 341,946 L/mol/cm). Wprowadź współczynnik rozcieńczenia jako 25 (nie 100), ponieważ utworzony G-kwadrupleks składa się z 4 nici DNA.
  11. Podwielokrotnić objętość odpowiadającą 3 OD (OD260 jednostek) na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C; na przykład, jeśli 5 μl, które zostało dodane do 495 μlH2O, daje odczyt OD260 równy 3, należy przygotować 5 μl podwielokrotności.

2. Przygotowanie struktur G4-DNA do wykorzystania w teście aktywności enzymatycznej rG4R1 (tworzenie znakowanego TAMRA G4-DNA)

  1. Zamów następujący oligomer DNA, zwany Z33-TAM, w skali 1 μmol: 5' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Upewnij się, że część TAMRA znajduje się na końcu 5' oligomeru.
  2. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w sekcji 1 w celu utworzenia G-quadruplex, z wyjątkiem tego, że cieniowanie ultrafioletem (UV) nie jest konieczne, ponieważ G-quadruplex znakowany tetrametylodaminą (TAMRA) będzie łatwo widoczny gołym okiem. Ponownie upewnij się, że na żelu znajduje się stopiona kontrolka.
  3. Po wykonaniu odczytu spektrofotometru G-kwadrupleksu DNA znakowanego TAMRA, jak w kroku 1, rozcieńczyć utworzony G-kwadrupleks do 0,2 pmol/μL buforem TNE. Na koniec dodać glicerol do 10% stężenia końcowego i przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Transformacja (DE3) Kompetentne komórki PlysS za pomocą pTriEx4-DHX36 (plazmid kodujący ludzki G4R1) i hodowanie/indukowanie dużych kultur bakteryjnych

  1. Uzyskaj plazmid TriEx4-DHX36.
  2. Podwielokrotność bakterii podzielić na 20 μl podwielokrotności i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Podwielokrotność pożywki SOC (2% trypton, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 i 20 mM glukozy) do 80 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Przygotować płytki z karbenicyliną (CARB)/chloramfenikolem (CAM) LB-agar. Podstawowe stężenia CARB i CAM wynoszą odpowiednio 50 mg/ml w H2O i 35 mg / ml w 70% EtOH i są one 1,000 razy stężone; w związku z tym końcowe stężenia na płytkach selekcyjnych agaru LB wynoszą odpowiednio 50 μg/ml i 35 μg/ml.
  4. Umieść 1 podwielokrotność bakterii na lodzie i umieść 1 podwielokrotność pożywki SOC w RT. Dodaj 1 μg plazmidu pTriEx4-DHX36 do bakterii i delikatnie zamieszaj końcówką pipety, aby wymieszać. Inkubować na lodzie przez kolejne 5 minut, a następnie szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 30 s. Umieść na lodzie na 2 minuty i dodaj pożywkę SOC.
  5. Przekształcone bakterie należy rozszczepić na wstępnie podgrzanych płytkach selekcyjnych (zazwyczaj należy poszczepić niewielką objętość, np. 5 - 10 μl, aby zapewnić niską gęstość kolonii, tak aby pojedyncze kolonie można było łatwo zaszczepić w dużych kulturach) i inkubować w temperaturze 37 °C O/N.
  6. Przygotuj Terrific Bulth zgodnie z instrukcjami producenta24. Przygotuj 500 ml na dużą kolbę (pamiętaj, aby dodać glicerol) i autoklaw w krótkim cyklu płynnym.
  7. Dodać CARB/CAM (50 μg/ml/35 μg/ml) do bulionu, a następnie zaszczepić kultury, pobierając zatyczki agarowe (za pomocą pipety p1000) zawierające pojedynczą kolonię bakteryjną i pipetując do bulionu. Energicznie zamieszać kultury w celu ich napowietrzenia, a następnie inkubować kultury w temperaturze 37 °C O/N bez wstrząsania.
  8. Następnego dnia umieść kultury w wytrząsarce o temperaturze 37 °C i wstrząśnij z prędkością ~225 obr./min. Hoduj kultury, aż OD600 wyniesie około 0,4 - 0,6, co zwykle zajmuje około 4 - 6 godzin, w zależności od początkowej gęstości komórek.
    nuta: Będzie to wymagało okresowego monitorowania gęstości za pomocą odczytów spektrofotometrycznych i bardzo ważne jest, aby nie hodować kultur do poziomu znacznie przekraczającego 0,5 OD. Jako ślepą próbę do odczytów spektrofotometrycznych odwirować 1 ml bakterii i użyć oczyszczonego bulionu jako roztworu do zaślepiania.
  9. Po uzyskaniu odpowiedniego OD600 natychmiast umieść kultury na lodzie i szybko schłodzić je do 10 °C. Monitoruj temperaturę za pomocą termometru wytartego do czysta 70% EtOH. Przyspiesz chłodzenie poprzez szybkie obracanie kolb na lodzie, ponieważ ograniczy to dalszy rozwój bakterii przed indukcją rekombinowanego białka.
  10. Dodać IPTG do końcowego stężenia 1 mM (~120 mg/500 ml hodowli), a następnie wstrząsać z prędkością 80 obr./min w temperaturze 14 °C przez ~17 - 18 godzin. Stwierdzono, że idealna temperatura do indukcji białek wynosi 14 °C; Aby najlepiej to osiągnąć, użyj schłodzonego wytrząsarki do kąpieli wodnej znajdującej się w konwencjonalnej chłodni i ręcznie sprawdź temperaturę łaźni wodnej za pomocą termometru.
    nuta: Alternatywnie można użyć chłodzonego powietrzem shakera/inkubatora, chociaż konieczne jest sprawdzenie, jakie cyfrowo ustawione ustawienie temperatury zapewni pożądaną temperaturę cieczy (sprawdź to, inkubując kolbę z wodą z termometrem w środku i wytrząsając ją z prędkością 80 obr./min przez kilka godzin, odpowiednio dostosowując cyfrowe ustawienie temperatury, aż do osiągnięcia 14 °C).
  11. Umieść kultury na lodzie i szybko je ostudź, jak w kroku 3.9. Weź małą porcję bakterii i dokonaj odczytu OD600; Idealnie byłoby, gdyby kultury podwoiły się podczas indukcji do około 0,8 - 1,2 OD600.
  12. Przenieś bakterie do probówek wirówkowych o pojemności 500 ml i ręcznie zrównoważ je za pomocą hodowli bakteryjnej, aby wyrównać wagę między probówkami. Po zbilansowaniu odwirować je w temperaturze 3 840 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odlać oczyszczony bulion i zamrozić granulki bakteryjne w temperaturze -80 °C do czasu oczyszczenia białka.

4. Oczyszczanie ludzkiego rG4R1

  1. Rozmrozić i poddać lizie granulki bakteryjne.
    1. Rozmrozić osad bakteryjny w 3 ml buforu TN w temperaturze pokojowej (bufor TN składa się ze 100 mM Tris pH 7,5 i 50 mM NaCl). Trzymaj butelki w dłoni i obracaj, aby rozmrozić/ponownie zawiesić granulki bakteryjne. Po rozmrożeniu i względnie równomiernym zawieszeniu zwiększyć objętość do 5 ml za pomocą buforu TN (dalszą zawiesinę można uzyskać poprzez pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety 5 ml).
      nuta: Typowe jest rozmrażanie/przygotowywanie 2 lub 4 butelek w dniu przygotowania, w zależności od poziomu komfortu użytkownika podczas procedury oczyszczania.
    2. Rozpuścić 20 mg lizozymu w 250 μlH2O(na kulturę) i dodać do zawieszonych bakterii. Pozwól lizozymowi strawić bakterie przez ~ 5 - 10 minut, obracając butelki w dłoni.
      nuta: Kolor zawiesiny zacznie się nieznacznie rozjaśniać w miarę postępu trawienia, a zawiesina będzie stosunkowo nielepka. Jeśli kultury są zbyt zarośnięte (tj. znacznie większe niż 1,2 OD600), wówczas chromosomalne DNA bakteryjne może powodować niepożądaną lepkość na tym etapie.
    3. Dodać 250 μl koktajlu inhibitorów proteazy () i jedną 10 μl podwielokrotności leupeptyny. Dokładnie wymieszaj.
    4. Ułóż na lodzie i dodaj 10 ml zimnego buforu TN i 22 μl BME. Przenieść do probówki o pojemności 50 ml.
    5. Sonikuj bakterie na lodzie za pomocą cyfrowego sonikatora ustawionego na 30% amplitudy. Impuls przy 2 s ON i 2 s OFF przez 1 min. Powtórzyć sonikację 3 razy, pozwalając próbkom ostygnąć na lodzie przez co najmniej 2 minuty między etapami sonikacji.
      nuta: W przypadku wielu kultur, należy poddać sonikację każdej z nich po kolei przed powtórzeniem iteracji sonikacji. Podczas sonikacji należy uważać, aby końcówka sonikacji była wystarczająco zanurzona w lizacie bakteryjnym, ale nie dotykała boków rurki, ponieważ spowoduje to wytworzenie nadmiaru ciepła.
    6. Dodać równą objętość (15 ml) zimnego 4x SSC + 20 μL BME + 50 μL + 1 porcję leupeptyny i wymieszać.
    7. W wirówce stołowej wstępnie schłodzonej do temperatury 4 °C odwirować lizaty przy stężeniu 2 300 x g przez 20 minut. Przenieść supernatant do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 50 ml (1 probówka na przygotowywaną dużą kulturę).
  2. Przygotuj koraliki magnetyczne G4.
    1. Pobrać 1 ml zawiesiny kulek paramagnetycznych streptawidyny (SPB) (na 1 l kultury) i przenieść ją do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Granuluj SPB za pomocą magnesu i umyj 2x 2x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Ponownie zawiesić umyty SPB w 200 μl tego samego roztworu, który został użyty do mycia kulek.
    2. Dodać jedną podwielokrotność 3 OD G4-DNA (Z33-Bio G4 przygotowanego w sekcji 1) do zawiesiny SPB i szybko wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Umieść rurki na rotatorze i obracaj w czasie obrotowym przez co najmniej 30 minut (i do 60 minut).
    3. Po tym okresie rotacji zablokuj SPB związany z G4, dodając 1 ml 0,4% laktoalbuminy i trzymaj na lodzie, aż będzie potrzebny. Rozcieńczyć 0,4% laktoalbuminę z 4% laktoalbuminy za pomocą 1x Tris-glycine.
      nuta: Podstawowa 4% laktoalbumina (w/v) jest początkowo przygotowywana przez rozpuszczenie w 2 M glicynie o pH 7,5, z dalszym dodatkiem 1x i 0,05% azydku sodu.
  3. Zwiąż znakowany histydyną rG4R1 z kulkami kobaltu (CB) (ciąg dalszy od kroku 4.1).
    1. Dodać 1 ml zawiesiny CB (co odpowiada objętości kulki 0,5 ml) do każdej probówki o pojemności 50 ml zawierającej oczyszczony lizat bakteryjny. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.
      UWAGA: Na 1 l sklarowanego lizatu stosuje się objętość kulek 0,5 ml; np. jeśli przygotowywane są dwie kultury bakteryjne o pojemności 500 ml, należy dodać CB tylko do probówki o pojemności 50 ml zawierającej oczyszczony lizat z jednej z kultur w tym momencie, ponieważ lizat z drugiej kultury będzie seryjnie związany z tym samym 0,5 ml CB w kroku 4.3.3).
    2. Wirować CB przy 110 x g przez 5 minut w wirówce stołowej o temperaturze 4 °C. Ostrożnie zassać płyn i pozostawić kilka ml płynu, aby nie naruszyć granulowanego CB. Przemyć 10 - 15 ml zimnego 4x SSC + BME (0,5 μl BME/ml 4x SSC).
      nuta: W przypadku prania należy wlać 10-15 ml bezpośrednio na granulowane kulki kobaltowe zamiast pipetować, ponieważ pipetowanie spowoduje, że kulki przykleją się do wnętrza pipety i białko zostanie utracone.
    3. Ponownie zagnieździć CB przez odwirowanie, a następnie wlać następny sklarowany lizat (30 ml, reprezentujący 2 dużą indukowaną kulturę bakteryjną) na granulowany CB. Inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze, a następnie przemyć dwukrotnie 10-15 ml 4x SSC + BME. Osad w ilości 110 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Po drugim praniu odessać płyn i pozostawić około 2 ml kulek/płynu na dnie tubki. Przenieś CB związany z białkiem do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml za pomocą końcówki do pipety o "szerokim otworze" o pojemności 1 ml.
      nuta: Użyj świeżej żyletki, aby odciąć koniec końcówki przed przeniesieniem, ponieważ użycie tej końcówki do pipety o "szerokim otworze" zmniejszy utratę kulek kobaltu związanych z białkiem.
    5. Krótko odwirować kulki w probówce 2 ml z dużą prędkością (~18 000 x g) w mikrowirówce w temperaturze 4 °C (~5 - 10 s to wszystko, co jest potrzebne do szybkiego granulowania). Delikatnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipetowania, uważając, aby nie stracić CB związanego z białkiem.
  4. Elute rG4R1 firmy CB.
    1. Inkubować CB w 0,5 ml buforu elucyjnego histydyny (HEB) na rotatorze przez 5 minut w chłodni. Ponownie, dodając HEB, wystarczy odpipetować 0,5 ml na kulki (aby wyeliminować straty CB) i ponownie zawiesić kulki poprzez odwrócenie probówki. HEB wynosi 0,7 M L-histydyny pH 6 (pH reguluje się za pomocą kwasu octowego).
    2. Odwirować w temperaturze 18 000 x g w mikrowirówce o temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie usunąć i przenieść supernatant zawierający białko przez ostrożne pipetowanie, pozostawiając niewielką ilość płynu na wierzchu CB.
    3. Powtórz kroki 4.4.1 i 4.4.2, aby uzyskać łącznie 3 elucje HEB.
    4. Elute raz z 0,2 M EDTA pH 6,0; kolor CB zmieni się z różowego na biały, gdy EDTA chelatuje kobalt.
    5. Po przeniesieniu czwartej i ostatniej elucji do probówki o pojemności 15 ml, należy odpipetować resztkowy bufor elucyjny z CB za pomocą końcówki do napełniania żelem na końcu końcówki do pipety o pojemności 1 ml; zanurzając końcówkę na dnie probówki, można zebrać resztki buforu elucyjnego zawierającego białko.
  5. Zwiąż rG4R1 z SPB związanym z G4 i wymyj rekombinowany enzym w sposób zależny od ATP.
    1. Przygotuj 5x bufor res: 250 mM octan trisu pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2 i 50% glicerolu. Przygotuj 3x Res Buffer: 0,915 ml H2O, 2 ml 5x Res Buffer, 0,33 ml 0,4% laktoalbuminy (rozcieńczonej z 4% laktoalbuminy z 1x Tris-glicyną), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M MgCl2, 0,050 ml i 0,010 ml leupeptyny. Przechowywać na lodzie.
      nuta: Podstawowa 4% laktoalbumina (w/v) jest początkowo przygotowywana przez rozpuszczenie w 2 M glicynie o pH 7,5, z dalszym dodatkiem 1x i 0,05% azydku sodu.
    2. Osad G4-SPB z boku probówki za pomocą magnesu i wyrzuć supernatant (G4-SPB, jak przygotowano w kroku 4.2). Dodaj 1 ml 3x Res Buffer do G4-SPB i odpipetuj do wymieszania.
    3. Odpipetować 1 ml G4-SPB zawieszonego w buforze 3x Res do probówki o pojemności 15 ml zawierającej ~2 ml białka HEB/EDTA (eluat z kroku 4.4). Inkubować przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, od czasu do czasu mieszając, aby kulki nie osiadły.
    4. Na lodzie umieść G4-SPB związany z białkiem z boku rurki za pomocą magnesu. Do umycia dodaj 1 ml 4x SSC + 0,4% laktoalbuminy (+ 0,5 μL/ml BME) i odpipetuj w celu ponownego zawieszenia kulek. Koraliki pelletu z magnesem na lodzie. Powtórz to pranie, w sumie 2 prania.
      nuta: Podczas procedury prania wymagana jest cierpliwość, aby upewnić się, że wszystkie kulki magnetyczne zostały granulowane między praniami. Jest to szczególnie ważne, biorąc pod uwagę zwiększoną lepkość roztworu ze względu na glicerol zawarty w Res.
    5. Umyj G4-SPB 1x 1 ml 3x Res Buffer.
    6. Przygotuj bufor elucyjny (EB): 0,5 ml 3x Res Buffer, 0,1 ml 0,1 M ATP i 0,4 mlH2O.
    7. Podgrzej 1 ml EB do 37 °C w probówkach PCR rozprowadzonych na bloku grzewczym termocyklera ustawionego na 37 °C.
    8. Granulat G4-SPB z magnesem na lodzie i ponownie zawiesić kulki w 100 μl wstępnie podgrzanego EB. Natychmiast przenieść kulki do wstępnie ogrzanej probówki PCR i inkubować przez 30 s w temperaturze 37 °C.
    9. Natychmiast dodać 12 μl 5 M NaCl i energicznie pipetować w górę i w dół 20 - 30 razy. Połączenie wysokiej zawartości soli i ATP w EB służy do elucji rG4R1 z kulek G4.
      nuta: Bardzo ważne jest, aby zminimalizować liczbę pęcherzyków powstających podczas procesu pipetowania, ponieważ pęcherzyki mogą denaturować białko.
    10. Natychmiast otocz G4-SPB magnesem i przenieś eluat zawierający białko do świeżej probówki PCR na lodzie (oznaczonej datą).
    11. Powtórzyć elucję i transfer opisane w krokach 4.5.8-4.5.10; produktem końcowym tego procesu jest zatem ~200 μl EB zawierającego oczyszczony rG4R1. Odłożyć dwie podwielokrotności o pojemności 7 μl (w probówkach PCR oznakowanych odpowiednią datą) do użycia w teście aktywności enzymatycznej kontroli jakości, który sprawdzi, czy wysoce aktywny rG4R1 został rzeczywiście oczyszczony.
    12. Oczyszczony rG4R1 przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu oznaczenia aktywności.

5. Test aktywności enzymatycznej oczyszczonego rG4R1 do kontroli jakości

  1. Dla każdego preparatu rG4R1, który ma być oznaczony, przygotować 300 μl buforu do oznaczania resolwazy (RAB), gdzie każde 30 μl zawiera 0,2 pmol znakowanego TAMRA Z33 G4-DNA (przygotowanego w kroku 2); skład RAB jest następujący: 0,1 ml 3x Res Buffer, 0,01 ml 0,2 pmol/μL G4-Z33-TAM, 0,03 ml 0,1 M ATP, i 0,16 mlH2O. W pasku składającym się z 6 probówek do PCR odpipetować 40 μl RAB do pierwszej probówki i 30 μl RAB do pozostałych probówek (w tym momencie trzymaj probówki na lodzie).
  2. Pobrać jedną z 7 μl podwielokrotności rG4R1 (z kroku 4.5.11) i umieścić ją na lodzie. Za pomocą pipety p20 ustawionej na 5 μl, delikatnie pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby wymieszać rG4R1 z podwielokrotnością i przenieść 5 μl do pierwszej probówki paska z 6 probówkami PCR (tej, która zawiera 40 μl RAB). Następnie ustaw pipetę na 10 μl i seryjnie przenieś 10 μl do pozostałych probówek PCR zawierających RAB.
  3. Natychmiast inkubować ten pasek probówek PCR w temperaturze 37 °C przez 30 minut w termocyklerze, a następnie utrzymać go w temperaturze 4 °C. Otwórz probówki, gdy są trzymane w temperaturze 4 °C i dodaj 2 μl 0,5 M EDTA pH 8 do każdej probówki (w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej).
  4. Wlać 10% akryloamidu/1x TBE/10% żelu glicerolowego. Po wyjęciu grzebienia umyj studzienki 1x TBE. Dodać 5 μl hydrofilowego polisacharydu o dużej masie (30% Ficoll wH2O) do każdej probówki i załadować 15 μl z każdej probówki (obciążenie studzienek można ponownie zaobserwować za pomocą linii Schliarena).
    1. Jako kontrolę ruchliwości G4-DNA dodać 4 μl hydrofilowego polisacharydu o dużej masie do 20 μl RAB i załadować 15 μl; jako kontrolę dla rozwiniętego monomeru Z33 podgrzać 20 μl RAB w temperaturze 98 °C przez 10 min, dodać 4 μl hydrofilowego polisacharydu o dużej masie, i załaduj 15 μL.
  5. Uruchom żel pod napięciem 120 V przez 2 godziny z 1x TBE jako buforem roboczym. Zobrazuj żel na multimodalnym imagerze z możliwością obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu filtrów specyficznych dla TAMRA (wzbudzić zielonym laserem 532 nm i użyć filtra pasmowego 580 nm 30 (580 BP 30)).
    nuta: Wysoce aktywny preparat rG4R1 zapewni pełną rozdzielczość Z33 znakowanego TAMRA na pierwszych 3 liniach, które zostały załadowane na żel, jak pokazano na rysunku 2.

6. Łączenie wysoce aktywnych przygotowań, porcjowania i przechowywania rG4R1

UWAGA: Ten krok wymaga 2 osób. Liczba i wymagania enzymatyczne dalszych testów, w których zostanie użyty oczyszczony rG4R1, określą, ile preparatów jest potrzebnych przed porcjowaniem. Typowy duży preparat składa się z połączenia 8 wysoce aktywnych preparatów (w ten sposób przy użyciu łącznie 16 indukowanych 500 ml kultur bakteryjnych), ale jest to liczba dowolna i jest specyficzna dla laboratorium.

  1. Obliczyć całkowitą objętość wysoce aktywnego, oczyszczonego rG4R1, który ma być podzielony. Zazwyczaj w dalszych testach stosuje się podwielokrotności 7 μl. Napełnij blok termocyklera ustawionego na 4 °C probówkami do PCR z paskami (zostaną one podzielone na porcje, ponieważ stały charakter bloku przyspieszy szybkie zamykanie pasków PCR).
  2. Pobrać probówki do PCR zawierające wysoce aktywny rG4R1 z temperatury -80 °C i szybko rozmrozić probówki w ręku; gdy w probówce pozostanie niewielka ilość lodu, umieścić probówki na lodzie. Połącz wszystkie szybko rozmrożone preparaty w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 15 ml i dobrze wymieszaj, upewniając się, że minimalizujesz pęcherzyki.
  3. Za pomocą automatycznej, powtarzalnej pipety dozować żądaną porcję objętości do wstępnie schłodzonych probówek z paskami PCR w termocyklerze. Gdy tylko 1-2 paski zostaną ukończone, poproś drugą osobę, aby zamknęła pokrywki i przeniosła je do 96-dołkowych wafli, które unoszą się w ciekłym azocie (błyskawiczne zamrażanie jest konieczne, aby zachować aktywność enzymatyczną).
    nuta: Nie należy jednorazowo przyjmować więcej niż około 200 μl rG4R1 do końcówki pipety automatycznej, aby skrócić czas, w którym enzym nie znajduje się w temperaturze 4 °C.
  4. Gdy wstępnie schłodzone probówki paskowe do PCR w termocyklerze zostaną napełnione porcjami i odpowiednio zamrożone, szybko przenieś więcej wstępnie schłodzonych probówek paskowych do PCR z lodu do termocyklera i kontynuuj porcjowanie. Kontynuuj w ten sposób, aż pozostała część enzymu zostanie podzielona, błyskawicznie zamrożona w ciekłym azocie i przeniesiona do suchego lodu. Na koniec przenieść podwielokrotności do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

7. Kwantyfikacja oczyszczonego stężenia rG4R1

  1. Wlej standardowy 5% żel do układania w stosy/12% rozdzielczego akrylamidu/SDS w celu separacji białek.
  2. Rozmrozić około 50 μl porcjowanego rG4R1, połączyć w jedną probówkę i dobrze wymieszać. Odmierz dokładną objętość za pomocą pipety i dodaj równą ilość 2x buforu do próbek Laemmli (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (w/v) glicerolu, 2,1% SDS i 0,02% błękitu bromofenolowego) + BME (50 μL/950 μL 2x bufor Laemmli). Denaturacja białka w temperaturze 98 °C przez 10 minut.
  3. Przygotować rozcieńczenia markerów MW o szerokim zakresie w 1x bufor próbki + BME, tak aby następujące ilości białka można było naładować na żel jako wzorce: 31,3, 62,5, 125, 250 i 500 ng.
    nuta: Każdy wzorzec białka zawarty w szerokim zakresie markerów MW jest obecny w ilości 0,1 μg/μl, z wyjątkiem białka 50 kDa, które występuje w ilości 0,3 μg/μl. Markery te nie muszą być denaturowane termicznie.
  4. Wyjmij grzebień z żelu i umyj studzienki standardowym buforem do pracy 1x SDS/glicyna. Załadować ekwiwalent 25 i 12,5 μl rG4R1 (co stanowi 50 i 25 μl zdenaturowanego białka), chociaż optymalna objętość enzymu do obciążenia powinna zostać określona przez użytkownika, ponieważ stężenie preparatów enzymatycznych będzie się różnić (np. 35 μl załadowano na żel na rysunku 3). Załaduj wzorce białkowe przygotowane w kroku 7.3. Upewnij się, że pipety są prawidłowo skalibrowane i upewnij się, że technika pipetowania jest tak precyzyjna, jak to tylko możliwe, aby zapewnić dokładną ocenę ilościową.
  5. Uruchom żel pod napięciem 120 V, aż czoło barwnika przejdzie przez około 2/3 żelu (aby zapewnić prawidłowe oddzielenie białek tworzących markery MW o szerokim zakresie).
  6. Usuń żel i wyrzuć część żelu, która nie będzie zawierała białka, odcinając ją żyletką. Umieść żel w szklanym naczyniu żaroodpornym lub równoważnym pojemniku. Zabarwić żel barwnikiem Coomassie (50 mg Coomassie R-250 na 100 ml 50:10:40 v/v metanol:kwas octowy:H2O, który został przefiltrowany przez lejek z bibuły filtracyjnej) O/N w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej ustawionej w celu zapewnienia odpowiedniego mieszania żelu.
  7. Odbarwić żel za pomocą 30:10:60 v/v metanol:kwas octowy:H2O, używając zwiniętej, niestrzępiącej się bibułki, aby przyspieszyć odbarwienie. W razie potrzeby zmień roztwór odbarwiający. Kontynuuj odbarwienie, aż tło będzie wystarczająco niskie, aby uwidocznić rG4R1 i wzorce białek; typowy żel na tym etapie pokazano na rysunku 3.
  8. Umieść odbarwiony żel między ochraniaczem arkusza i zeskanuj żel w rozdzielczości ≥300 dpi. Otwórz zeskanowany obraz w oprogramowaniu do analizy obrazu (takim jak Fuji Multiguage lub równoważnym) i przygotuj krzywe wzorcowe z wzorców białek, które odpowiadają 75, 100 i 150 kDa (krzywe reprezentują ilości w gramach w porównaniu z odczytami densytometrycznymi). Upewnij się, że odjąłeś tło od każdego pasa kwantyfikacji podczas procesu uzyskiwania wartości densytometrycznych.
  9. Zakładając, że objętość rG4R1, która została załadowana na żel, zawiera ilość białka, która mieści się w zakresie liniowym tych krzywych standardowych, można ekstrapolować ilość białka w gramach na mikrolitr załadowanego rG4R1.
  10. Przelicz ekstrapolowaną ilość gramową rG4R1 na ilość molową, używając masy cząsteczkowej G4R1, która wynosi 120 000 g/mol.
    nuta: Dla każdego żelu zostaną wygenerowane trzy ekstrapolowane wartości (po jednej dla każdego z trzech markerów białkowych użytych do wygenerowania krzywych wzorcowych: 75, 100 i 150 kDa). Uruchom dwa kolejne żele, wybarwić je i określić ilościowo, powtarzając kroki 7.1 - 7.10. Dzięki wynikom kwantyfikacji dla pierwszego żelu, użytkownik będzie w stanie ocenić, ile rG4R1 musi zostać załadowane na kolejne żele, aby uzyskać ilość, która mieści się w liniowym zakresie wzorców białkowych. W sumie ekstrapoluj dziewięć wartości reprezentujących stężenie wysoce aktywnego, oczyszczonego rG4R1. Uśrednić te wartości, aby uzyskać końcowe stężenie rG4R1 specyficzne dla danej partii, które zwykle mieści się w zakresie 20-100 nM. Oblicz odchylenie standardowe od tych wartości (n = 9).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół (Rysunek 1) rutynowo daje prawie czysty, katalitycznie aktywny rG4R1. Jako miarę aktywności enzymatycznej zwykle obserwuje się, że 50% z 0,2 pmol czterocząsteczkowego G4-DNA znakowanego TAMRA jest przekształcane w monomery w zakresie 0,2 - 0,013 μl rG4R1, jak oznaczono za pomocą testu aktywności G4 opisanego powyżej (Figura 2). Barwienie Coomassie oczyszczonego rG4R1 wskazuje na pojedyncze prążko o oczekiwanej wielkości 120 kDa, z niewielkim pasmem zanieczyszczającym o warto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten reprezentuje wysoce wydajny schemat ekspresji, oczyszczania i kwantyfikacji do izolacji produktu genu DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, zwanego również RHAU i DHX36) (Figura 1). Protokół ten wykorzystuje dwa etapy oczyszczania: oczyszczanie powinowactwa do znacznika Hisa na kulkach powinowactwa kobaltu i oczyszczanie enzymatyczne na kulkach sprzężonych z G4-DNA. Ten ostatni etap jest wyjątkowy, ponieważ wykorzystuje ścisłe powinowactwo, wysoką specyficzność i katalityczną aktywność odwijania, jaką...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować naszym źródłom finansowania, w tym hojnemu darowi od Fundacji Ware (dla J.P.V.), The National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (dla P.J.S.) oraz funduszom startowym Ball State University (dla P.J.S.). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TriEx4-DHX36 plazmidAddgene68368
Rosetta2(DE3)plysS kompetentne komórkiNovagen71403-4
S.O.C mediumThermo Fisher Scientific15544034 
Difco Terrific BulionBecton Dickinson243820
GlicerolSigma-AldrichG5516
ChloramfenikolSigma-AldrichC191935 µ g/ml w płytkach bakteryjnych/dużych kulturach
Karbenicylina (testowana na kulturach komórek roślinnych)Sigma-AldrichC341650 µ g/ml w płytkach bakteryjnych/dużych kulturach
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma-AldrichI6758
Lizozym (z białka jaja kurzego)Sigma-AldrichL6876
1 M Tris-HCl, pH 8Universal Scientific Supply Co. 1963-Blub ze standardowego źródła
1 M Tris-HCl, pH 7Universal Scientific Supply Co. 1966lub ze standardowego źródła
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8Do odlewania żelu rozdzielczego (do żelu do oznaczania ilości białek); Ze standardowego źródła
1 M Tris-HCl, pH 6,8Do odlewania żelu do układania w stosy (do żelu do oznaczania ilości białka); Ze standardowego źródła
1 M Tris-Acetate, pH 7,8Universal Scientific Supply Co. 1981lub ze standardowego źródła
70% EtanolZe standardowego źródła
Chlorek magnezu (1  M solution)Life TechnologiesAM9530G
Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Octan soduSigma-AldrichS8750
20x SSCUniversal Scientific Supply Co. 1665lub ze standardowego źródła
β-merkaptoetanol (2-BME)Sigma-Aldrich63689
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP8849
Hemisulfian leupeptynySigma-AldrichL8511
Streptawidyna Koraliki paramagnetycznePromegaZ5482
0,5 M EDTA, pH 8 Universal Scientific Supply Co. 0718lub ze standardowego źródła
0,2 M EDTA, pH 6Universal Scientific Supply Co. Ze standardowego źródła; najpierw dostosuj pH za pomocą NaOH, a następnie dostosuj pH z powrotem za pomocą HCl.   
A-laktoalbumina (typ 1 z mleka krowiego)Sigma-AldrichL5385
Koraliki powinowactwa do metalukobaltowego Clonetech635502
L-histydynaSigma-AldrichH8000
Kwas octowy, lodowatyFisher ScientificA38-500
Adenozyno-5'-trifosforan (ze źródła bakteryjnego)SigmaA7699
40% roztwór akryloamidu/Bis (37,5:1)Biorad161-0148
GlicynaSigma-Aldrich50046do produkcji żelu białkowego bufor do biegania (192 mM glicyna, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS)
10% Dodecylosiarczan sodu (SDS)Universal Scientific Supply Co. 1667do produkcji buforu do biegania w żelu białkowym (192 mM glicyny, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); lub ze standardowego źródła
10x TBE Sigma-Aldrich11666703001lub ze standardowego źródła
Tris baseFisher ScientificBP152-1do produkcji żelu białkowego bufor do biegania (192 mM glicyny, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); Ze standardowego źródła
TEMEDSigma-Aldrich411019
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma-AldrichA3678
Szeroki zakres markerów białkowych MWPromegaV8491
Biotynylowany oligo Z33 ("Z33-Bio")Oligos Etc5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA GGA TTC GGA CCT-biotyna 3'
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")Oligos Etc 5' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'
Powlekana fluorem płyta TLCLife TechnologiesAM10110
FicollSigma-AldrichF263730% w H2O
Coomassie R-250Sigma-Aldrich27816
MetanolFisher ScientificA412
Wielopasmowa lampaZdolna do emitowania światła UV o długości fali 365 nm
Wirówka stołowa (z wahliwym wirnikiem kubełkowym)Możliwość chłodzenia do 4 stopni C
MikrowirówkaMożliwość chłodzenia do 4 & stopni; C
Digital SonfierBransonLub równoważny zdolny do dostarczania impulsów dźwiękowych (30% amplitudy, 2 s WŁ./2 s WYŁ.)
50 ° C łaźniaDo formowania Z33 w kwadrupleks
37 & deg; Inkubator C dla bakteriiDo przemian bakteryjnych i początkowego wzrostu w ciągu nocy dużych kultur Rosetta2 E. coli transformowanych za pomocą TriEx4-DHX36
37 ° Nr kat. C/14  ° Inkubator z wytrząsaniem C dla bakteriiDo wzrostu i indukcji białek dużych kultur Rosetta2 E. coli transformowanych za pomocą TriEx4-DHX36
Spektrofotometrzdolny do odczytu OD600; zdolny do odczytu stężeń oligomerów na podstawie sekwencji zasad (np. Biorad SmartSpec 3000)
TermometrZe standardowego źródła
ProbówkiZ standardowego źródła
15 i 50 ml probówek wirówkowych (polipropylen)Ze standardowego źródła
Probówki do mikrowirówek (2,0 ml)Z standardowego źródła
500 ml butelek wirówkowych (polipropylen)Thermo Scientific3141-0500
Standardowy zestaw końcówek do pipet i pipetZe standardowego źródła
do ładowania żeluZe standardowego źródła
Automatyczna pipetaDo szybkiego porcjowania rG4R1; Ze standardowego źródła
TermocyklerZe standardowego źródła
Ciekły azotZe standardowego źródła
Suchy lódZe standardowego źródła
Bufor do próbek Laemlli Biorad161-0737
Aparatura do uruchamiania żeli do dużych płytBioradUżyliśmy aparatu komórkowego Protean II xi firmy Biorad
MagnetLife Technologies12301DUżywamy magnesu firmy One Lambda (obecnie marka Thermo Fisher Scientific); a Life jest również spółką zależną Thermo, a zatem wymieniony tutaj magnes powinien być odpowiednim zamiennikiem
ŻyletkiZe standardowego źródła
Bibuła filtracyjna i lejekZe standardowego źródła
Szklane naczynieZe standardowego źródła
WytrząsarkaZe standardowego źródła
KimwipesZe standardowego źródła
Przezroczyste ochraniacze arkuszyZe standardowego źródła
Skaner i powiązane OprogramowanieZe standardowego źródła
Oprogramowanie, takie jak Fuji Multiguage lub równoważny
Microsoft ExcelLub równoważny 
UV wodna paskowe do PCR serologicznych Końcówki powtarzalna żaroodporne orbitalna TWAIN do analizy obrazu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
  2. Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
  3. Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
  4. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
  5. Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
  6. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  7. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
  8. Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
  9. Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
  10. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  11. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
  12. Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
  13. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  14. Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
  15. Sexton, A. N., Collins, K. The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
  16. Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).
  17. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
  18. Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
  19. Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
  20. Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).
  21. Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
  22. Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
  23. Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
  24. BD Biosciences. , Available from: http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf (2016).
  25. Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
  26. Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ATP dependent purificationHistidine tagged enzymeCobalt bead chromatographyStreptavidin paramagnetic beadsEnzymatic activity assayRecombinant protein purificationBacterial expression systemQuality control step

Powiązane artykuły