Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55503

⸱

13 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Centre for Prions and Protein Folding Diseases & Department of Biochemistry, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Streszczenie

Aby zbadać podobne do prionów zachowanie nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny, potrzebne są modele mysie, które umożliwiają szybkie i proste przekazywanie prionoidów alfa-synukleinowych, które powodują neuropatologię w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Tutaj opisujemy, że dojęzykowe lub dootrzewnowe wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny do bigenicznych myszy Tg (M83 +/-: Gfap-luc +/-), które wykazują nadekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z mutacją A53T z promotora białka prionowego i lucyferazy świetlika z promotora kwaśnego białka fibrylarnego gleju (Gfap), jest wystarczające do wywołania choroby neuropatologicznej. W porównaniu z homozygotycznymi myszami Tg(M83+/+), u których rozwijają się poważne objawy neurologiczne rozpoczynające się w wieku 8 miesięcy, heterozygotyczne zwierzęta Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) pozostają wolne od spontanicznej choroby do osiągnięcia wieku 22 miesięcy. Co ciekawe, wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny drogą dootrzewnową wywołało chorobę neurologiczną z paraliżem u czterech z pięciu myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-) z medianą czasu inkubacji wynoszącą 229 ±17 dni. Chore zwierzęta wykazywały poważne złogi fosforylowanej alfa-synukleiny w mózgach i rdzeniu kręgowym. Nagromadzenie alfa-synukleiny było nierozpuszczalne w sarkozylu i kolokalizowane z ubikwityną i p62, a towarzyszyła im reakcja zapalna skutkująca glejozą astrocytową i mikroglejozą. Co zaskakujące, inokulacja włókienek alfa-synukleiny do języka była mniej skuteczna w wywoływaniu choroby, a tylko jedno z pięciu wstrzykniętych zwierząt wykazywało patologię alfa-synukleiny po 285 dniach. Nasze odkrycia pokazują, że inokulacja drogą dojęzykową, a tym bardziej drogą dootrzewnową, jest odpowiednia do wywołania choroby neurologicznej z istotnymi cechami synukleinopatii u myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-). Zapewnia to nowy model do bardziej szczegółowego badania patogenezy podobnej do prionów indukowanej przez prionoidy alfa-synukleiny.

Wprowadzenie

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że alfa-synukleina ma cechy podobne do białek prionowych, szczególnie w zakresie zdolności do samosiewu i rozprzestrzeniania się nieprawidłowego fałdowania między komórkami i wzdłuż ścieżek neuronalnych. Ta właściwość alfa-synukleiny jest również określana jako "podobna do prionu" lub "prionoidowa" i jest poparta obserwacjami w eksperymentach transplantacyjnych, które sugerują zdolność przenoszenia nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny z chorych neuronów do nowo przeszczepionych zdrowych neuronów1,2,3,4. Również bezpośrednie wstrzyknięcie nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny do mózgu lub obwodu, np. mięśnia kończyny tylnej lub ściany jelita, powoduje rozprzestrzenianie się patologii alfa-synukleiny na dystalne części OUN 5,6,7,8,9,10. Bardziej szczegółowo przeanalizowaliśmy transmisję prionoidów alfa-synukleiny drogami obwodowymi i odpowiedzieliśmy na pytanie, czy nieprawidłowo sfałdowana alfa-synukleina może neuroinatakować OUN po pojedynczym wstrzyknięciu dojęzykowym lub dootrzewnowym, cechę, którą wcześniej wykazano dla prionów, ale nie dla nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny. Po wstrzyknięciu prionów do języka, neuroinwazja OUN jest osiągana poprzez propagację wzdłuż nerwu podjęzykowego języka, który prowadzi do jądra nerwu podjęzykowego, które znajduje się w pniu mózgu11. Jako model mysi wybraliśmy myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-), które nadmiernie eksprymują mutant A53T ludzkiej alfa-synukleiny z promotora prionów i lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora Gfap w celu monitorowania aktywacji astrocytarnej przez bioluminescencję, jak wcześniej wykazano w mózgu myszy zakażonych prionami12. W naszych rękach bigeniczne myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) nie rozwinęły choroby do 23 miesiąca życia, jak wykazały inne13. Pojedyncze wstrzyknięcie ludzkich włókienek alfa-synukleiny drogą dojęzykową lub dootrzewnową wywołało chorobę neurologiczną z patologią w mózgach i rdzeniach kręgowych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) wspierających hipotezę, że prionoidy alfa-synukleiny mają ważne cechy wspólne z prionami14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury, w tym dotyczące zwierząt, zostały przeprowadzone za zgodą komitetu ochrony zwierząt Krajowej Agencji Ochrony Środowiska Nadrenii Północnej-Westfalii (LANUV). Zwierzęta były trzymane w pomieszczeniach i opiekowane zgodnie ze standardowymi warunkami z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność oraz swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

1. Model zwierzęcy

  1. Krzyżuj hemizygotyczne myszy Tg(Gfap-luc+/-) z hemizygotycznymi myszami Tg(M83+/-) w celu wygenerowania hemizygotycznych bigenicznych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) class<="xref">15,16.
  2. Genotyp potomstwa za pomocą PCR w czasie rzeczywistym pod kątem obecności transgenu kodującego ludzką alfa-synukleinę oraz za pomocą standardowego PCR dla lucyferazy świetlika12,17.
  3. Zaszczepić zwierzęta w wieku od sześciu do ośmiu tygodni.

2. Przygotowanie inokulum

  1. Przygotować monomeryczną rekombinowaną ludzką alfa-synukleinę z mutacją A53T w buforze soli fizjologicznej buforowanym trisem (TBS) zawierającym 150 mM NaCl w 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), jak opisano wcześniej14.
  2. Przygotować fibrylarną alfa-synukleinę do inokulacji, mieszając 3 μg/μl monomerycznej rekombinowanej ludzkiej alfa-synukleiny w wytrząsarce orbitalnej przy 800 obr./min i temperaturze 37 °C przez 5 dni.
  3. Rozcieńczyć zespoły fibryli w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μg/μl w przypadku inokulacji dootrzewnowej lub 2 μg/μl w przypadku inokulacji dojęzykowej.
  4. Fragmentuj fibryle alfa-synukleiny za pomocą sonikatora pręcikowego przez 1 minutę (40 impulsów o czasie trwania 0,5 s z jednosekundową przerwą między każdym impulsem i amplitudą ustawioną na 50%) na lodzie. Aby uniknąć zanieczyszczenia przez siew krzyżowy. Użyj czystych sond sonicznych, aby przygotować różne inokulum.

3. Iniekcje dojęzykowe

.
  1. Znieczulenie zwierząt za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie. Użyj maści weterynaryjnej na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Ostrożnie przymocuj narkotyzowane zwierzęta taśmą klejącą do płyty grzewczej w pozycji leżącej grzbietowej, z głowami skierowanymi w stronę badacza.
  3. Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o pojemności 27 g 5 μl sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS.
  4. Użyj jednego kleszczyka do kciuka z nosem i ząbkowanymi końcówkami, aby przytrzymać usta zwierzęcia otwarte, a drugiej mniejszej pary kleszczy, aby ostrożnie wyciągnąć język, aby dolna strona języka była dostępna do wstrzyknięcia.
  5. Wstrzyknąć igłę strzykawki w prawą lub lewą dolną stronę języka, w pobliżu nerwu podjęzykowego. Powoli wstrzyknąć inokulum po 5 sekundach. Powoli wycofaj igłę po 5 sekundach, aby upewnić się, że inokulum wniknęło w tkankę i nie zostało utracone podczas cofania igły.
  6. Uwolnij zwierzę z fiksacji i pozostaw je na płycie grzewczej pod stałym nadzorem aż do całkowitego wyzdrowienia.

4. Iniekcje dootrzewnowe

  1. W przypadku wstrzyknięć dootrzewnowych należy krótko narkotyzować zwierzęta w komorze anestezjologicznej poprzez inhalację izofluranem/tlenem, przy natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.
  2. Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o pojemności 27 g 50 μl sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS.
  3. Należy wstrzykiwać bezpośrednio do otrzewnej myszy i unikać przenikania do jelita cienkiego lub jelita ślepego znajdującego się za ścianą jamy brzusznej, trzymając zwierzę w pozycji grzbietowej z głową skierowaną w kierunku przeciwnym do badacza i w dół pod kątem około 45°. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia.

5. Obrazowanie bioluminescencyjne

  1. Obraz Tg (M83 +/-: Gfap-luc +/-) myszy co 2-4 tygodnie przy użyciu systemu obrazowania bioluminescencyjnego.
  2. Przed obrazowaniem należy krótko znieczulić myszy w komorze izofluranowo-tlenowej o natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.
  3. Ogol i wypiluj głowy myszy kremem do depilacji. Pokoloruj uszy na czarno niedrażniącym markerem, aby zablokować niespecyficzną bioluminescencję.
  4. Rozcieńczyć sól potasową D-lucyferyny, substrat lucyferazy, w PBS do roztworu podstawowego o stężeniu 30 mg/ml. Przechowywać w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C. Chronić rozpuszczoną D-lucyferynę przed ekspozycją na światło.
  5. Zważyć zwierzęta przed wstrzyknięciem. Oblicz dokładną objętość D-lucyferyny do wstrzyknięcia 150 mg/kg masy ciała. Dootrzewnowo wstrzyknąć D-lucyferynę i zwrócić zwierzę do komory anestezjologicznej.
  6. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Gdy system obrazowania osiągnie temperaturę roboczą, zainicjuj go, klikając przycisk "Zainicjuj" na panelu sterowania.
  7. Wybierz przyciski "Luminescencyjny" i "Fotografia". Ustaw czas ekspozycji na 60 s, binning na "Średni", przysłonę przysłony na "1", a wzmocnienie EM na "Wył.".
  8. Upewnij się, że filtr wzbudzenia jest ustawiony na "Blok", a filtr emisji na "Otwarty" i ustaw wysokość obiektu na 1.50 cm.
  9. Dziesięć minut po wstrzyknięciu D-lucyferyny umieść zwierzęta na płycie grzewczej w komorze obrazowania i upewnij się, że ich pyski są prawidłowo umieszczone w wylocie znieczulenia. Zamknąć przepływ izofluranu/tlenu z komory inhalacyjnej i otworzyć przepływ do komory obrazowania o natężeniu przepływu 0,25 l/min i parowaniu 2%. Prawidłowo zamknij drzwiczki komory obrazowania.
  10. Kliknij przycisk "Pobierz", aby zmierzyć bioluminescencję, która trwa 60 s. Zatrzymaj przepływ izofluranu i monitoruj zwierzęta do momentu, aż całkowicie wyzdrowieją po powrocie do klatek.
  11. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo bioluminescencję. W "Palecie narzędzi" wybierz "Narzędzia ROI". W sekcji "Typ" w "Narzędziach ROI" wybierz "Pomiar ROI".
  12. W "Narzędziach ROI" kliknij narzędzie "kółko" i wybierz liczbę ROI do narysowania z menu rozwijanego – najlepiej "3" dla trzech myszy.
  13. Na obrazie kliknij prawym przyciskiem myszy każdy ROI i w sekcji "Właściwości" dostosuj szerokość i wysokość do 1,25 cm. Umieść każdy ROI nad obszarem mózgu, który jest określany ilościowo.
  14. W lewym górnym rogu obrazu ustaw panel jednostek na "promieniowanie (fotony)".
  15. W "Palecie narzędzi" wybierz "Dostosuj obraz" i dostosuj minimum i maksimum "Skali kolorów", na przykład od 0,20e6 do 1,00e6.
  16. W sekcji "Plik" zapisz dane za pomocą opcji "Zapisz".

6. Analiza biochemiczna

  1. Odizoluj mózg i rdzeń kręgowy zgodnie z ustalonymi protokołami18,19.
  2. Homogenizować próbki całego mózgu i całego rdzenia kręgowego oddzielnie w PBS w obecności inhibitorów proteazy i fosfatazy (rozcieńczonych do 1x w PBS) w dwóch cyklach 30-sekundowych z prędkością 6,000 obr./min w homogenizatorze tkankowym. Upewnij się, że próbki mózgu i rdzenia kręgowego są homogenizowane do końcowego stężenia 20% (wag./obj.).
  3. Dwukrotnie poddaj próbki działaniu sonikacji, utrzymując je na lodzie ze stałym impulsem 10 s i amplitudą ustawioną na 50%.
  4. Dostosuj homogenaty do 10% w PBS i 750 mM NaCl, rozcieńczając je 1:1 z 1,5 M NaCl w PBS.
  5. Aby oddzielić resztki komórkowe, odwirować homogenaty w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zachowaj supernatanty do następnych kroków i wyrzuć granulki.
  6. Zmierzyć stężenie białka w homogenatach za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować 1,0 mg białka całkowitego z homogenatów mózgu lub 0,8 mg z homogenatów rdzenia kręgowego w N-laurylosarkozylu w końcowym stężeniu 10% (wag./obj.) przez 15 minut na lodzie.
  7. Nałożyć homogenaty na 3 ml poduszki z sacharozą o stężeniu 10% (wag./obj.) w wodzie destylowanej i ultraodwirować je w temperaturze 465 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  8. Zawiesić granulki w buforze zawierającym 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 2% β-merkaptoetanolu, 192 mM glicyny, 25 mM trisu i 5% (wag./obj.) sacharozy.
  9. Gotować próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut i umieścić je w żelach poliakryloamidowych SDS do elektroforezy w układzie buforowym kwasu morfolinowo-etanosulfonowego (MES).
  10. Przenieść oddzielone białka do membran z polifluorku winylidenu (PVDF) w systemie półsuchym.
  11. Inkubować błony w 0,4% (obj./obj.) roztworze formaliny w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wirniku z prędkością 35 obr./min, aby usieciować białka z błoną.
  12. Zablokuj membrany w buforze TBS zawierającym 0,05% (obj./obj.) mleka Tween 20 i 5% (wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  13. Inkubować bloty z pierwszorzędowym przeciwciałem w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.
  14. Przemyć błony trzykrotnie w buforze TBS i inkubować je z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą lub fluoroforem w TBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  15. Wizualizacja związanych przeciwciał drugorzędowych za pomocą chemiluminescencji lub fluorescencji zgodnie z ustalonymi protokołami20.

7. Analiza immunofluorescencyjna

  1. Odwodnić wypreparowane mózgi i rdzeń kręgowy w stacji przetwarzania tkanek i zanurzyć je w parafinie za pomocą stacji parafinowej.
  2. Tkanki zatopione w parafinie przeciąć mikrotomem na odcinki koronalne o grubości 8 μm i zamontować skrawki na szkiełkach
    3. podstawowych.
  3. Odparafinować skrawki tkanki, inkubując je w dwóch oddzielnych kąpielach ksylolowych przez 5 do 10 minut, a następnie ponownie nawodnić je przez serię stopniowanych kąpieli etanolowych (100%, 90%, 70%, 50%), a na koniec zH2O.
  4. Inkubować skrawki w 0,01 M buforze cytrynianowym (pH 6,0) przez 5 minut w temperaturze pokojowej i dodatkowo gotować je przez 10 minut w kuchence mikrofalowej.
  5. Pozwól skrawkom ostygnąć do temperatury pokojowej i inkubuj je z 3% roztworem nadtlenku wodoru przez 30 minut, aby zahamować endogenne peroksydazy.
  6. Zablokować skrawki tkanki przez inkubację z 20% (obj./obj.) normalną surowicą kozią, 1% (obj./obj.) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5% Tritonem X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Skrawki inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 1% (obj./obj.) normalnej surowicy koziej, 1% (obj./obj.) BSA i 0,25% Triton X-100 w PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Umyć sekcje dwukrotnie 0,25% (vol/vol) Triton X-100 w PBS i raz PBS.
  9. Wybarwić skrawki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem i barwnikiem jądrowym DAPI rozcieńczonym w 1% (obj. / obj.) normalnej surowicy koziej, 1% (obj. / obj.) BSA i PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Po dwukrotnym umyciu 0,25% (vol/vol) Triton X-100 w PBS i raz PBS, nakryć szkiełka z pożywką do zatapiania i uwidocznić barwienie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obwodowe wstrzyknięcie prionoidów alfa-synukleiny poprzez język lub otrzewną wywołało neuropatologię w OUN bigenicznych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) (Tabela 1 oraz Rysunek 1). Po pojedynczym wstrzyknięciu dootrzewnowym włókien alfa-synukleiny u czterech z pięciu myszy rozwinęła się choroba neurologiczna z medianą czasu inkubacji wynoszącą 229 ±17 dni. Co zaskakujące, tylko u jednej z pięciu myszy rozwinęła się choroba OUN po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-) stanowi łatwą metodę wywoływania choroby neurologicznej, której towarzyszy zapalenie nerwów w celu podsumowania ważnych cech synukleinopatii. Podobnie, wstrzyknięcie do języka stanowi inną drogę neuroinwazji przez prionoidy alfa-synukleiny u myszy transgenicznych, ale jest mniej skuteczne. Zdecydowaliśmy się zakończyć nasze eksperymenty po 420 dniach od wstrzyknięcia i nie możemy wykluczyć możli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Oldze Sharmie, Theresie Hundt oraz personelowi DZNE Microscopy and Animal Facilities za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciało anty-aktynoweMerck MilliporeMAB1501
anty-alfa-synukleina, przeciwciało fosfo S129 [pSyn#64]Wako015-25191
anty-alfa-synukleina, przeciwciało fosfo S129 [EP1536Y]Abcamab51253
przeciwciało anty-GFAPDakoZ0334 01
przeciwciało anty-IBA-1Wako019-19741
przeciwciało anty-sekwestrosom-1 (p62)Proteintech18420-1-AP
przeciwciało anty-ubikwityny [Ubi-1]Merck MilliporeMAB1510
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Invitrogen14190169
Ketamina Ratiopharm100 mg/kg
KsylazynaRatiopharm10 mg/kg
27 g strzykawkaVWR613-4900
Izofluran Piramal HealthcarePZN  4831850
Krem do depilacjiVeet
Secureline marker laboratoryjny Neolab25040
Sól potasowa D-lucyferynyAcrisLK1000030 mg/ml roztwór podstawowy
ThermomixerEppendorf5776671
Sonopuls Mini20 sonikatorBandelin3648
IVIS System obrazowania Lumina IIOprogramowanie PerkinElmer
Living Image 3.0 OprogramowaniePerkinElmer
Tg(M83+/-) myszy lub B6; Myszy C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/JKleszcze Jackson Laboratory004479
Standardowy wzórFine Science Tools11000-16
Kleszcze o wąskim wzorzeFine Science Tools11002-12
Ultrawirówka N-laurylasarcosylSigmaL5125-100G
Optima Max-XP Rotor Beckman CoulterTLA-110 
Grubościenne rurki poliwęglanoweBeckman Coulter362305
NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein GelsThermo Fisher ScientificWG1401BOX
Przeciwciało sprzężone HRPCaymanCay10004301-1
IR Dye 680 przeciwciało sprzężone LI-COR Biosciences926-68070
SuperSignal West Dura Extended Duration SubstrateThermo Fisher Scientific34075
Stella 3200
Odyssey LI-COR Animacja z zakresu nauk biologicznych
20 MP BiomedicalsTWEEN201
Triton X-100SigmaSA/T8787
Membrana PVDF Immobilon-FLMerck MilliporeIPFL00010
XylolSigmaRoth
Nadtlenek wodoruSigmaSA/00216763/000500roztwór roboczy 3%
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Thermo Fisher ScientificA3294-100G
Serum kozieThermo Fisher ScientificPCN5000
4,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306rozcieńczenie robocze 1:50 000
Fluoromount media OmnilabSA/F4680/000025
LSM700 konfokalny laserowy mikroskop skaningowyCarl Zeiss
HALT inhibitory proteazy i fosfatazyThermo Fisher Scientific 
Homogenizator Precellys 24-Dual Peqlab91-PCS24D
Alexa Fluor 488 przeciwciało sprzężoneThermo Fisher ScientificA31619
Alexa Fluor 594 przeciwciało sprzężoneThermo Fisher ScientificA11005
Pierce  BCA  Białko  Oznaczenie  ZestawThermo Fisher Scientific10741395
Microtome RM2255
LSM700Carl Zeiss
System obrazowania System obrazowania w podczerwieni Raytest 10516495 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Leica

Bibliografia

  1. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  2. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
  3. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  4. Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
  5. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
  6. Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  8. Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38(2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
  10. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  11. Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
  12. Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
  13. Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
  14. Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
  15. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
  16. Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
  17. Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75(2015).
  18. Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
  19. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
  20. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
  21. Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891(2016).
  22. Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
  23. Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
  24. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
  25. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
  26. Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38(2013).
  27. Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Monitorowanie neurostan w zapalnychmodel myszy transgenicznychiniekcja obwodowaneurostan zapalny OUNreporter lucyferazy GFAPiniekcja doszpikowainiekcja wewn trzj zykowamodel choroby Parkinsona
Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.