Method Article

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/55505

⸱

June 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to małe niekodujące RNA, które regulują ekspresję informacyjnego RNA po transkrypcji. Profil ekspresji miRNA został zbadany w różnych narządach i tkankach szczurów. Jednak standardowe metody oczyszczania miRNA i wykrywania ich ekspresji w błonie otrzewnowej szczura nie zostały dobrze ugruntowane. Opracowaliśmy skuteczną i niezawodną metodę oczyszczania i ilościowego oznaczania miRNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) w błonie otrzewnowej szczura. Protokół ten składa się z czterech etapów: 1) oczyszczenia próbki błony otrzewnej; 2) oczyszczanie całkowitego RNA, w tym miRNA, z próbki błony otrzewnej; 3) odwrotna transkrypcja miRNA w celu wytworzenia cDNA; oraz 4) qRT-PCR w celu wykrycia ekspresji miRNA. Korzystając z tego protokołu, udało nam się ustalić, że ekspresja sześciu miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 i miRNA-34a-5p) znacznie wzrosła w błonie otrzewnej modelu zwłóknienia otrzewnej szczura w porównaniu z tymi w grupach kontrolnych. Protokół ten może być wykorzystany do badania profilu ekspresji miRNA w błonie otrzewnowej szczurów w wielu stanach patologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące RNA, które po transkrypcji regulują ekspresję informacyjnego RNA (mRNA)1. Zmiany w ekspresji miRNA regulują ekspresję wielu mRNA, które odgrywają kluczową rolę w różnych stanach patologicznych, w tym raku, zapaleniu, zaburzeniach metabolicznych i zwłóknieniu2,3,4,5,6,7,8. Dlatego miRNA mają potencjał jako nowe biomarkery i cele terapeutyczne2,3,4,5,6,7,8. Profil ekspresji miRNA został określony w różnych narządach i tkankach szczura, w tym w wątrobie, sercu, płucach i nerkach9. Jednak standardowe metody oczyszczania i wykrywania miRNA w błonie otrzewnowej szczura nie zostały dobrze ugruntowane.

Ogólnym celem tego protokołu jest skuteczne oczyszczanie i wykrywanie miRNA w błonie otrzewnowej szczura. Najpierw próbkę błony otrzewnowej homogenizowano za pomocą homogenizatora szklanego, a następnie poddano działaniu systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki10. Następnie całkowite RNA, w tym miRNA, oczyszczono z próbki błony otrzewnej za pomocą kolumny spinowej opartej na błonie krzemionkowej10. Następnie cDNA zsyntetyzowano z oczyszczonego całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT11. Wreszcie, ekspresję miRNA określono za pomocą qRT-PCR przy użyciu barwnika interkalacyjnego 11. Uzasadnienie tego protokołu opiera się na wcześniejszych badaniach, które wykazały znaczne oczyszczanie i wykrywanie miRNA w tkankach w prostym procesie8,10,11. Doniesiono, że zastosowanie systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki i kolumnie wirowej opartej na membranie krzemionkowej może oczyścić wysokiej jakości całkowite RNA z tkanek10. Metoda syntezy cDNA z oczyszczonego całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT oraz metoda wykrywania ekspresji miRNA za pomocą qRT-PCR przy użyciu barwnika interkalacyjnego w tym protokole wykazały wysoką dokładność i czułość11. Ponadto jest to prosty proces, który oszczędza czas i zapobiega błędom technicznym. Dlatego protokół ten jest przydatny w badaniach, które wymagają bardzo dokładnego i czułego wykrywania miRNA w błonie otrzewnowej szczura w szerokim zakresie stanów patologicznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Medycznego Jichi i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Jichi.

1. Pobieranie próbek z otrzewnej

  1. Zbierz następujące przedmioty: probówkę wirówkową o pojemności 50 ml z bawełną nasączoną izofluranem, arkusz korkowy, szalkę Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), nożyczki chirurgiczne i kleszcze.
  2. Poddaj szczura eutanazji z przedawkowaniem izofluoranu, a następnie spryskaj skórę brzucha szczura 70% etanolem i połóż szczura na arkuszu korka na jego grzbiecie.
  3. Wykonaj podłużne nacięcie w skórze brzucha, mięśniach i błonie otrzewnej za pomocą nożyczek i kleszczy.
  4. Podnieś błonę otrzewnową za pomocą kleszczy i wykonaj poziome nacięcia w jej górnej części wzdłuż najniższej kości żebra pod przeponą i po jej dolnej stronie w okolicy bocznej za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie wykonaj boczne nacięcia podłużne, aby usunąć błonę otrzewnową z ciała za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie umyj go za pomocą PBS na szalce Petriego.
  5. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy wyciąć i przyciąć 20 mg (3-5 mm2) próbek błony otrzewnej, które są odpowiednie do kolejnych kroków.

2. Oczyszczanie całkowitego RNA z próbek błony otrzewnowej

UWAGA: Tutaj próbki błony otrzewnowej o wadze 20 mg są homogenizowane za pomocą homogenizatora szklanego i systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki. Następnie całkowity RNA z próbki błony otrzewnowej izoluje się za pomocą kolumny wirowej opartej na błonie krzemionkowej.

  1. Zbierz następujące elementy: 1,5 lub 2,0 ml probówek do mikrowirówek, 100% etanol, chloroform, homogenizator szklany, lód, system rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki10, kolumna wirowa na bazie membrany krzemionkowej10, odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania zawierający guanidynę i etanol (bufor do płukania 1) oraz bufor do płukania zawierający etanol (bufor do płukania 2).
  2. Umieścić próbkę błony otrzewnowej o sile 20 mg w szklanym homogenizatorze i dodać 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny.
  3. Homogenizować próbkę błony otrzewnej, powoli dociskając tłuczek do próbki, przekręcając. Powtórz ten proces kilkadziesiąt razy na lodzie, aż próbka błony otrzewnowej całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy na bazie fenolu/guanidyny.
  4. W celu dalszej homogenizacji przenieść homogenizowany lizat do systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Następnie odwirować go w temperaturze 14 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieść homogenizowany lizat do nowej probówki do mikrowirówki.
  6. Dodać 140 μl chloroformu do homogenizowanego lizatu i szczelnie zamknąć probówkę. Następnie mieszaj probówkę przez odwrócenie przez 15 sekund.
  7. Próbki należy inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować je w sile 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Przenieść supernatant (zwykle 300 μl) do nowej probówki do mikrowirówki bez naruszania osadu i dodać 1,5-krotność jego objętości (zwykle 450 μl) 100% etanolu. Następnie wymieszaj próbkę przez wirowanie przez 5 s.
  9. Pobrać pipetę do 700 μl próbki do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Zamknij zaślepkę kolumny. Następnie odwiruj go w temperaturze 15 000 x g przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn do probówki zbiorczej.
  10. Dodać 700 μl buforu płuczącego 1 do kolumny wirowej na bazie membrany krzemionkowej, aby dokładnie przepłukać próbkę. Zamknij zaślepkę kolumny. Następnie odwiruj go w temperaturze 15 000 x g przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn do probówki zbiorczej.
  11. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej na bazie membrany krzemionkowej, aby usunąć wszelkie ślady soli. Zamknij zaślepkę kolumny. Następnie odwiruj go w temperaturze 15 000 x g przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn do probówki zbiorczej.
  12. Powtórz czynności 2.11.
  13. Ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej przy 15 000 x g przez 1 minutę. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn do probówki zbiorczej.
  14. Umieść kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1.5 ml. Następnie przenieś 25 μl wody wolnej od RNaz do kolumny. Zamknij zaślepkę kolumny. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na 5 minut. Następnie odwirować go w temperaturze 15 000 x g przez 1 minutę.
  15. Przenieść 25 μl eluatu zawierającego całkowite RNA do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie przed użyciem przechowywać go w temperaturze -80 °C.

3. Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA

UWAGA: Odniesienie i przestrzeganie wytycznych Minimum Informacji do Publikacji Ilościowych Eksperymentów PCR w Czasie Rzeczywistym (MIQE) zachęca do lepszej praktyki i pomocy w uzyskiwaniu wiarygodnych i jednoznacznych wyników12.
UWAGA: W tym przypadku łącznie 1,0 μg wyizolowanego RNA jest transkrybowane wstecznie przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT.

  1. Zbierz następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml; ośmiodołkowe probówki paskowe; Woda wolna od RNaz; lód; Zestaw do odwrotnej transkryptazy (patrz tabela materiałów)11.
  2. Przygotuj roztwór mieszanki głównej, który zawiera 2,0 μl 10x mieszaniny kwasów nukleinowych, 2,0 μl mieszaniny odwrotnej transkryptazy (z zestawu) i 4,0 μl 5x buforu hi-spec, co daje łącznie 8,0 μl na probówkę.
  3. Dozować 8,0 μl roztworu mieszanki wzorcowej (z zestawu) do każdej probówki.
  4. Zmierzyć ilość całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru. Dodać 1,0 μg wyizolowanych całkowitych RNA oczyszczonych z próbki błony otrzewnowej do każdej probówki.
    UWAGA: qRT-PCR można przeprowadzić przy użyciu całkowitych RNA jako matrycy bez odwrotnej transkrypcji w celu kontroli jakości oczyszczonych całkowitych RNA. Jeśli jakiekolwiek DNA jest zanieczyszczone, za pomocą qRT-PCR obserwuje się nieoczekiwane produkty amplifikacji.
  5. Dodaj wodę wolną od RNaz do każdej probówki, w sumie 20 μl. Następnie dokładnie wymieszaj pipetując i odwiruj przez 15 sekund.
  6. Inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Natychmiast inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
    UWAGA: Ten krok można wykonać w termocyklerze.
  7. Przenieś cDNA do nowej probówki mikrowirówkowej i rozcieńcz dziesięć razy (1:10) wodą wolną od RNaz.
  8. Rozcieńczone cDNA należy tymczasowo przechowywać na lodzie i w temperaturze -80 °C przez długi czas przed użyciem.

4. qRT-PCR miRNA

UWAGA: qRT-PCR miRNA jest wykonywany przy użyciu barwnika interkalacyjnego. Zastosowano tu startery dla RNA, U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 i miRNA-34a-5p.

  1. Zbierz następujące elementy: probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml, 96-dołkową płytkę reakcyjną do qRT-PCR, folię samoprzylepną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, startery specyficzne dla miRNA, zestaw PCR na bazie zielonego barwnika (patrz tabela materiałów)11 oraz przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym.
  2. Przygotuj mieszankę wzorcową zawierającą 12,5 μl 2x mieszanki głównej PCR, 2,5 μl 5 μM każdego startera miRNA rozpuszczonego w wodzie wolnej od nukleaz i 1,25 μl 10x uniwersalnego startera dla każdej studzienki.
  3. Dozować 22,5 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
  4. Dodaj 2,5 μl matrycowego cDNA do każdej studzienki.
  5. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Następnie odwirować płytkę o masie 1 000 x g przez 30 s.
  6. Uruchom program cykliczny PCR z urządzeniem do PCR w czasie rzeczywistym i oprogramowaniem w następujący sposób.
    1. Ustaw płytkę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. W oprogramowaniu do PCR w czasie rzeczywistym zdefiniuj właściwości eksperymentalne (wprowadź nazwę eksperymentu, wybierz "96-dołkowe" dla eksperymentalnego typu instrumentu, wybierz "2−ΔΔCT method" dla metody oznaczania ilościowego, wybierz "SYBR green reagents" dla odczynnika, aby wykryć sekwencję docelową, wybierz "standardowa prędkość rampy" dla uruchomienia instrumentu).
    2. Następnie przypisz nazwy próbkom i docelowym miRNA w każdym dołku. Próbki są zawsze badane w dwóch lub trzech egzemplarzach, aby uzyskać wystarczającą ilość danych do walidacji wyników. Wybrać próbkę referencyjną i kontrolę endogenną. Wybierz "brak" dla barwnika, który ma być używany jako odniesienie pasywne.
    3. Wprowadzić objętość reakcji "20 μl" i następujące warunki cykliczne PCR w oprogramowaniu do PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami: preinkubacja w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 70 °C przez 30 s.
  7. Analizuj dane qRT-PCR za pomocą oprogramowania urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Upewnij się, że próg i linia bazowa, które są automatycznie określane przez oprogramowanie, są odpowiednie w każdym dołku.
  8. Sprawdź cykl progowy docelowych miRNA w każdej próbce. Cykl progowy to przecięcie krzywej wzmocnienia i linii progowej. Następnie znormalizuj poziom ekspresji docelowych miRNA przeciwko RNU6-2 jako kontroli endogennej i oblicz względny poziom ekspresji docelowych miRNA za pomocą metody 2−ΔΔCT 13.
    UWAGA: Należy zauważyć, że należy zweryfikować stabilność poziomu ekspresji endogennego kontrolnego miRNA. W tym eksperymencie potwierdzono, że RNU6-2 ulega ekspresji na wysokim poziomie i jest stosunkowo niezmienny w każdej grupie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj wyniki są oparte na naszym wcześniej zgłoszonym badaniu8. Zbadaliśmy profil ekspresji miRNA w zwłóknieniu otrzewnej. Zwłóknienie otrzewnej jest poważnym powikłaniem dializy otrzewnowej. Charakteryzuje się utratą monowarstwy komórek międzybłonka i nadmierną akumulacją składników macierzy zewnątrzkomórkowej i jest związany z niewydolnością błony otrzewnej14,15. Model szczura zwłóknienia ot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z protokołu przedstawionego w tym manuskrypcie, miRNA w błonie otrzewnowej szczura udało się oczyścić i wykryć za pomocą qRT-PCR. Wiarygodność analizy danych qRT-PCR zależy od jakości oczyszczonych miRNA. W związku z tym czystość miRNA można sprawdzić przed qRT-PCR za pomocą stosunku absorbancji przy 260 nm do absorbancji przy 280 nm, którą można zmierzyć za pomocą spektrofotometru. Gdy nie można uzyskać znaczącej amplifikacji miRNA za pomocą qRT-PCR, stężenie matrycowego cDNA może być zwiększone. Stężenie ka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Miyako Shigeta za doskonałe wsparcie techniczne. Prace te były częściowo wspierane przez JSPS KAKENHI (grant nr 25461252).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Niszczarka QIAQiagen79654system rozdrabniania biopolimerów w mikrowirówce
kolumna wirowa miRNeasy Mini zestawQiagen217004kolumna wirowa na bazie membrany krzemionkowej
Odczynnik do lizy QIAzolQiagen79306odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny
Bufor RLTQiagen79216bufor do płukania 1
Bufor RWTQiagen1067933wash buffer 2
miScript II RT kit Qiagen218161zawiera 10 razy; Mieszanka nukleikowa zawierająca deoksynukleotydy, trifosforany rybonukleotydów i startery oligo-dT; miScript Mieszanka odwrotnej transkryptazy zawierająca polimerazę poli(A) i odwrotną transkryptazę oraz; Bufor miScript HiSpec
zestaw miScript SYBR Green PCRQiagen218073zawiera QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix i podkład miScript Universal Primer
RNU6-2   QiagenMS00033740nieujawniony
starter miRNA-142-3pQiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUAUGGA-3'   
starter miRNA-21-5pQiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p
starterQiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p
starterQiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p
starterQiagenMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327
starterQiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'MicroAmp
Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-dołkowa płytka reakcyjna
Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp Termo Fisher Scientific 4311971folia samoprzylepna do 96-dołkowej płytki reakcyjnej
System QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR ThermoFisher Scientific4472380przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym
Oprogramowanie QuantStudio 12K Flex w wersji 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380oprogramowanie instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym
methylglyoxalSigma-AldrichM0252
MidpericTerumonie przypisać płyn do dializy otrzewnowej
Sprague– Szczury DawleySLC nie są przypisane 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
  2. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  3. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  4. Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
  9. Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005(2014).
  10. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  11. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  12. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
  15. Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
  16. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
  17. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59(2005).
  18. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MicroRNA ExpressionQuantitative Real time PCRPeritoneal MembraneRNA PurificationReverse TranscriptionmiRNA DetectionPeritoneal FibrosisRat ModelTotal RNA IsolationqRT PCR Protocol

Related Articles