Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wykrywanie za pomocą mikroskopii konfokalnej internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w komórkach ssaków. Obejmuje podstawową procedurę hodowli komórek, transfekcji i mikroskopii konfokalnej oraz zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji GPCR wyrażanego fuzją.

Streszczenie

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) to technika obrazowania optycznego do obrazowania o wysokim kontraście. Jest to potężne podejście do wizualizacji fluorescencyjnych białek fuzyjnych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP), w celu określenia ich ekspresji, lokalizacji i funkcji. Subkomórkowa lokalizacja białek docelowych jest ważna dla identyfikacji, charakterystyki i analiz funkcjonalnych. Internalizacja jest jednym z dominujących mechanizmów kontrolujących sygnalizację receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w celu zapewnienia odpowiednich odpowiedzi komórkowych na bodźce. Tutaj opisujemy eksperymentalną metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji GPCR w komórkach HEK293 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ponadto eksperyment ten dostarcza pewnych szczegółów na temat hodowli komórkowej i transfekcji. Protokół ten jest kompatybilny z wieloma powszechnie dostępnymi markerami fluorescencyjnymi i ma zastosowanie do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji większości białek, a także do internalizacji GPCR. Technika ta powinna umożliwić naukowcom skuteczne manipulowanie ekspresją genu GPCR w liniach komórkowych ssaków i ułatwić badania nad lokalizacją i internalizacją subkomórkową GPCR.

Wprowadzenie

Komórki posiadają maszynerię do transportu materiałów pozakomórkowych - takich jak ligandy, mikroorganizmy, składniki odżywcze i białka transbłonowe - do komórki w celu uzyskania informacji, energii i innych celów^1,2. Ma kluczowe znaczenie dla homeostazy komórkowej, funkcji tkanek i ogólnego przeżycia komórek. Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych oparta na komórkach jest skutecznym sposobem badania lokalizacji i internalizacji receptorów transbłonowych, takich jak receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), w szlakach sygnałowych³.

Ekspresja białek fuzyjnych oznaczonych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) meduzy Aequorea victoria, w połączeniu z technikami bezpośredniego wykrywania fluorescencji, zyskała szeroką akceptację w badaniach nad białkami4^,5^,6. Detekcja oparta na GFP ma tę zaletę, że umożliwia obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym przy jednoczesnym uniknięciu artefaktów fiksacji⁷. Seria wszechstronnych wektorów klonowania została skonstruowana w celu ułatwienia ekspresji fuzji białek z GFP w różnych komórkach^8,9. Wektor pEGFP-N1 jest szeroko stosowanym i skomercjalizowanym wektorem plazmidowym kodującym ulepszone białko zielonej fluorescencji (EGFP), które zostało zoptymalizowane z GFP typu dzikiego w celu uzyskania jaśniejszej fluorescencji i wyższej ekspresji w komórkach ssaków. Aby zaobserwować sygnał fluorescencyjny EGFP wyrażony w komórkach ssaków, należy przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną ze wzbudzeniem przy 488 nm i emisją przy 507 nm, najlepiej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Monitorowanie subkomórkowej lokalizacji i internalizacji receptorów za pośrednictwem ligandów jest powszechną techniką badania transdukcji sygnału i funkcji GPCRs^10,11. W większości przypadków internalizacja prowadzi do odczulania GPCR (tłumienie odpowiedzi na bodziec pomimo obecności agonistów)^12,13. Zinternalizowane receptory mogą zostać włączone do lizosomu i zdegradowane lub mogą zostać poddane recyklingowi z powrotem na powierzchnię komórki, w zależności od charakteru receptorów i linii komórkowych użytych w eksperymentach.

Receptory hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRHRs) należą do rodziny GPCR i mają typową strukturę białka GPCR, z zewnątrzkomórkowym zakończeniem aminowym , wewnątrzkomórkowym zakończeniem -COOH i siedmioma domenami transbłonowymi (TM)¹⁴. Transfekcja rekombinowanego plazmidu SjGnRHR-EGFP (z genem GnRHR z Sepiella japonica) i wykrywanie mikroskopią konfokalną znakowanego EGFP SjGnRHR (wyrażanego w komórkach HEK293) zostało zgłoszone wcześniej, a fluorescencja GFP została ustalona jako reporter dla transbłonowych testów lokalizacji białek¹⁵. Teraz internalizacja SjGnRHR, aktywowana przez hormon uwalniający gonadotropiny S. japonica (SjGnRH), została wykazana w sposób zależny od czasu i dawki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Odzyskiwanie komórek
   1. Przenieść kriokonserwowane ludzkie komórki embrionalne nerki 293 (HEK293) ze zbiornika z ciekłym azotem do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i wstrząsać w sposób ciągły przez 1-2 minuty.
   2. Dodać 10 ml zbilansowanej pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's Eagle firmy Dulbecco (DMEM), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) i 1% roztwór penicyliny-streptomycyny) do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowej. Delikatnie dodaj rozmrożone komórki do zrównoważonej pożywki wzrostowej.
   3. Inkubować komórki w inkubatorze CO₂ z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO₂ przez 2 - 4 godziny.
   4. Po 2 - 4 godzinach sprawdź, czy ogniwa są przymocowane. Wymień zrównoważoną pożywkę wzrostową i kulturę na kolejne 24 - 48 h.
      UWAGA: Zmiana zrównoważonej pożywki wzrostowej jest przydatna, ponieważ usuwa dimetylosulfotlenek (DMSO) i chroni przed uszkodzeniem komórek.
2. Przejście komórkowe
   1. Po 24 - 48 godzinach, gdy komórki osiągną bliskie zbieżności, wyrzuć zrównoważoną pożywkę wzrostową i przemyj komórki 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Delikatnie zakręć naczyniem.
   2. Wyrzuć PBS i dodaj 1 ml trypsyny-EDTA (sól fizjologiczna, 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA). Aby całkowicie strawić komórki, ostrożnie zakręć naczyniem i odessaj roztwór trypsyny-EDTA. Umieść naczynie w inkubatorze CO₂ z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C na 3 min.
      UWAGA: W tym okresie przygotuj trzy nowe 10-centymetrowe szalki do hodowli komórkowych i dodaj do każdej z nich 10 ml zrównoważonej pożywki wzrostowej.
   3. Za pomocą mikroskopu świetlnego określ, czy komórki podniosły się z dna naczynia. Dodaj 2 ml zrównoważonej pożywki wzrostowej do naczynia. Wymieszać pipetując i natychmiast odpipetować 0,6 ml zawiesiny komórek do każdej z nowych szalek. Delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

2. Sadzenie komórek

1. Po 24 - 48 godzinach, gdy pasażowane komórki osiągną bliskie zbiegowisko, wyrzuć zrównoważoną pożywkę wzrostową i umyj komórki 2 ml PBS. Delikatnie zakręć naczyniem.
2. Wyrzuć PBS i dodaj 1 ml trypsyny-EDTA. Aby całkowicie strawić komórki, ostrożnie zakręć naczyniem i odessaj Trypsynę-EDTA. Umieść naczynie w inkubatorze CO₂ z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C na 3 min.
   UWAGA: W tym okresie przygotuj 6-dołkową płytkę, dodając 2 ml zbilansowanej pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
3. Dodać 1 ml zrównoważonej pożywki wzrostowej do szalki, jeśli pod mikroskopem obserwuje się, że komórki mają zostać podniesione z dna naczynia. Wymieszać pipetując i natychmiast odpipetować 0,1 ml zawiesiny komórek (objętość jest dostosowana do gęstości wzrostu komórek) do każdego dołka przygotowanej płytki 6-dołkowej (bezkomórkowej płytki 6-dołkowej z 2 ml zrównoważonej pożywki wzrostowej). Delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

3. Transfekcja komórkowa

1. Metoda transfekcji 1, z preparatami liposomowymi
   UWAGA: Proszę zapoznać się z tabelą materiałów dla odczynnika do transfekcji 1.
   1. Następnego dnia upewnij się, że komórki powinny zlewać się w 85 - 95%.
   2. Dodać 3 μg plazmidowego DNA (500 ng/μl) i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy do sterylnej probówki do mikrowirówki i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotować 9 μl odczynnika 1 i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy w innej probówce do mikrowirówek i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Połączyć rozcieńczoną mieszaninę plazmidu z rozcieńczonym odczynnikiem 1 (całkowita objętość = 215 μl). Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Odessać pożywkę z płytki z hodowli komórkowej i dodać 1,5 ml świeżego DMEM bez FBS.
   6. Dodać kroplami 215 μl mieszaniny odczynników do transfekcji DNA do każdej studzienki i delikatnie wymieszać, obracając płytkę.
   7. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 4 - 8 godzin. Zastąp świeży DMEM 10% FBS.
   8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez kolejne 24 - 48 godzin przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów.
2. Metoda transfekcji 2, z preparatami liposomowymi
   UWAGA: Proszę zapoznać się z tabelą materiałów odczynnika do transfekcji 2.
   1. Dodać 2 μg plazmidowego DNA (500 ng/μl), 4 μl odczynnika 2 i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy do sterylnej probówki mikrowirówkowej. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Dodaj mieszaninę transfekcji do komórek kroplami.
   3. Po transfekcji inkubować komórki przez 24 - 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów.

4. Hodowla komórkowa na szkiełkach nakrywkowych

1. Usuń pożywkę wzrostową z 6-dołkowej płytki hodowlanej.
2. Umyj monowarstwę komórek 1 ml PBS bez wapnia i magnezu.
3. Dodaj 0,5 ml trypsyny-EDTA. Ostrożnie zakręć naczyniem i odessaj Trypsin-EDTA. Inkubować płytkę hodowlaną przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Rzeczywisty czas inkubacji różni się w zależności od użytej linii komórkowej.
   UWAGA: W tym okresie należy przygotować nową płytkę 12-dołkową i dodać do każdej studzienki sterylne szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 mm. Szkiełka nakrywkowe pokryte lizyną, lamininą lub kolagenem mogą poprawić przyczepianie się komórek HEK293, które łatwo się odłączają.
4. Po odłączeniu komórek dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki. Wymieszać pipetując i natychmiast przenieść wymaganą liczbę komórek na płytkę 12-dołkową ze szkiełkami nakrywkowymi. Dodaj świeżą, kompletną pożywkę wzrostową do każdej studzienki, aby dostosować całkowitą objętość do 1 ml
5. Inkubować komórki przez 16 - 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   UWAGA: Po 30 - 60 minutach większość komórek przylgnie do sterylnych szkiełek nakrywkowych.

5. Wykrywanie mikroskopii konfokalnej

1. Lokalizacja komórkowa
   1. Po 16-24 godzinach, gdy komórki osiągną bliskie zbieżność na sterylnych szkiełkach nakrywkowych na 12-dołkowej płytce, dodać sondę membranową DiI do każdej studzienki, uzyskując końcowe stężenie 5 μM. Pozostawić komórki do inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Po 30 minutach usunąć zrównoważoną pożywkę wzrostową i dwukrotnie umyć komórki w zimnym PBS (2 - 8 °C).
   3. Utrwal komórki, dodając 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu (w PBS) do każdej studzienki. Delikatnie mieszać przez 15 min.
      Uwaga: Paraformaldehyd jest umiarkowanie toksyczny w kontakcie ze skórą lub wdychaniu i jest oznaczony jako prawdopodobny czynnik rakotwórczy dla ludzi. Podczas ważenia i obchodzenia się z paraformaldehydem należy używać dygestoriów chemicznych, wentylowanych obudów wagowych lub innych środków ochronnych.
   4. Umyj stałe komórki dwukrotnie w PBS. Dodać 200-300 μl roztworu DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindolowego) (0,5 μg/ml) do każdego dołka i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Umyj komórki dwukrotnie PBS. Ostrożnie zdejmij szkiełka pokrywy z płyty i odchabnij nadmiar PBS. Odwrócić na szkiełka mikroskopowe obciążone jedną kroplą podłoża mocującego (50% v/v glicerol/woda). Usuń nadmiar medium montażowego z prowadnic.
2. Internalizacja komórkowa
   1. Po 16-24 godzinach, gdy komórki osiągną bliskie zbieżność na sterylnych szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowej płytce, należy usunąć zrównoważoną pożywkę wzrostową i dodać świeżą, ogrzaną pożywkę DMEM (37 °C). Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Traktuj komórki różnymi stężeniami liganda (0, ^10-12, ^10-9 i ^10-6 M) przez 30 minut i traktuj je ligandem ^10-6 M przez różne czasy (0, 10, 30 i 60 minut).
   3. Umyć komórki dwukrotnie w zimnym PBS (2 - 8 °C). Utrwal komórki, dodając 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu (w PBS) do każdej studzienki. Delikatnie mieszać przez 15 min.
   4. Umyj komórki dwukrotnie w PBS. Ostrożnie zdejmij szkiełka pokrywy z płyty i odchabnij nadmiar PBS. Odwrócić na szkiełka mikroskopowe obciążone jedną kroplą podłoża mocującego (50% v/v glicerol/woda). Usuń nadmiar medium montażowego z prowadnic.
3. Mikroskopia konfokalna
   1. Włącz sprzęt mikroskopu konfokalnego, w tym moc lampy rtęciowej, mikroskop komputerowy, skaner i laser. Zaloguj się na konto systemu operacyjnego, uruchom oprogramowanie, sprawdź konfigurację i wybierz laser. Włącz różne jednostki systemu mikroskopii konfokalnej w kolejności zgodnie z instrukcjami.
   2. Umieść przygotowane szkiełka na stoliku mikroskopu. Umieścić próbkę nad soczewką obiektywu za pomocą sterownika stolika. Dodaj jedną kroplę olejku cedrowego na szkiełko nakrywkowe, gdy wybrana jest soczewka zanurzeniowa z olejkiem. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach skierowanych w stronę obiektywu.
   3. Znajdź interesujące Cię komórki pod mikroskopią fluorescencyjną.
   4. Przełącz na tryb skanowania. Wybierz moc lasera i zakres spektralny fluoroforu emisyjnego. Uchwyć wysokiej jakości obrazy konfokalne, dostrajając intensywność lasera i inne parametry.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia przykład systemu mikroskopu konfokalnego. Rycina 2 przedstawia ekspresję pEGFP-N1 w komórkach HEK293. Sygnał GFP wykryto w cytoplazmie i jądrze. Rycina 3 przedstawia subkomórkową lokalizację GnRHR z S. japonica w komórkach HEK293, zgodnie z naszymi poprzednio opublikowanymi wynikami¹⁵. Białko fuzyjne ze znacznikiem EGFP na C-końcu SjGnRHR (SjGnRHR-EGFP) wydawało się ...

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji ekspresji białka fuzyjnego GPCR w komórkach HEK293. Technikę tę można łatwo dostosować do wielu różnych genów i typów komórek, takich jak lokalizacja komórkowa i internalizacja receptora korazoniny z Bombyx mori w komórkach HEK293 i BmN¹⁶.

Pomyślne zastosowanie tego potężnego testu zależy od kilku kluczowych czynników. Przede wszys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa HEK293
DMEM/Hycon o wysokiej zawartości glukozy		SH30022.01	Wysoki poziom glukozy 4,0 mM L-glutamina
Surowica bydlęca płodu (FBS)	PuFei	1101-100
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Genom	GNM10010
0,25% trypsyny i 0,02%	genomu	EDTA
Opti-MEM (1x)	GIBCO, firmy Life Technologies	31985-062	zredukowane podłoże surowicy
Lipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcji	Invitrogen	11668027	Odczynnik 1
X-tremeGENE HP DNA Odczynnik do transfekcji	Roche	6366236001	2
Roztwór do barwienia DAPI	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Medium do montażu przeciwblaknięcia	Beyotime	P0126
Paraformaldehyd	Sinopharm Chemical Reagent Co. (SCRC)	80096618
100 mm hodowla komórkowa	CORNING	430167
płytka 6-dołkowa	ExCell Bio	CS016-0092
Płytka 12-dołkowa	ExCell Bio	CS016-0093
Szkło osłonowe	NEST	801007
Szkiełka mikroskopowe	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma Inkubator CO2	Thermo	3111
TCS SP5II laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Leica