Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy ilościowy i skalowalny protokół do przeprowadzania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek dla regulatorów kinaz naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego.

Streszczenie

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) mogą samoodnawiać się lub różnicować we wszystkie typy komórek, zjawisko znane jako pluripotencja. Opisano różne stany pluripotencjalne, określane jako "naiwna" i "uźródłowiona" pluripotencja. Mechanizmy, które kontrolują przejście naiwnie zagruntowane, są słabo poznane. W szczególności pozostajemy słabo poinformowani o kinazach białkowych, które określają pierwotne i pierwotne stany pluripotencjalne, pomimo rosnącej dostępności wysokiej jakości związków narzędziowych do badania funkcji kinazy. W tym miejscu opisujemy skalowalną platformę do wykonywania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek pod kątem regulatorów kinaz naiwnie zapoczątkowanego przejścia pluripotencjalnego w mysich ESC. Podejście to wykorzystuje proste warunki hodowli komórkowej oraz standardowe odczynniki, materiały i sprzęt do odkrycia i walidacji inhibitorów kinaz o dotychczas niedocenianym wpływie na pluripotencję. Omawiamy potencjalne zastosowania tej technologii, w tym badania przesiewowe innych zbiorów małych cząsteczek, takich jak coraz bardziej wyrafinowane inhibitory kinaz i pojawiające się biblioteki epigenetycznych związków narzędziowych.

Wprowadzenie

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) mają zdolność do samoodnawiania się lub różnicowania w dowolny typ komórek w organizmie dorosłego, zjawisko znane jako pluripotencja¹. Najnowsze dowody wskazują, że istnieją rozwojowo odrębne stany pluripotencjalne, określane jako "naiwne" i "pierwotne" pluripotencja². Pierwotne EKM reprezentują stan rozwoju podobny do tego, który występuje w preimplantacyjnym embryo³. W przeciwieństwie do tego, zapoczątkowane pluripotencjalne ESC są gotowe do wyjścia z pluripotencji i różnicowania się w wyspecjalizowane linie embrionalne^4,5.

Naiwne i pierwotne stany pluripotencjalne są oznaczone odrębnymi sieciami regulacji genów. Naiwna pluripotencja charakteryzuje się ekspresją kluczowych czynników transkrypcyjnych pluripotencji, takich jak Nanog, czynniki transkrypcyjne podobne do Krueppela (Klfs), Rex1² i Esrrb⁶. W mysich ESC (mESC) primeed pluripotencja charakteryzuje się zmniejszoną ekspresją naiwnych markerów i specyficzną sygnaturą ekspresji genów, która obejmuje metylotransferazę DNA de novo Dnmt3b⁷. In vivo, zagruntowane pluripotencjalne komórki macierzyste epiblastu po implantacji (EpiSCs)^4,5 dodatkowo wyrażają marker Epiblast Fgf5 i markery primingu linii, takie jak Brachyury⁸.

mESC dostarczają łatwego modelu do badania mechanizmów kontrolujących naiwnie zaszczepione przejścia pluripotencjalne in vitro. Podczas hodowli w czynniku hamującym białaczkę (LIF) i płodowej surowicy bydlęcej (FBS), mESC przechodzą dynamiczne przejście między stanami pierwotnym a pierwotnym pluripotencjalnym^9,10. Funkcje sygnalizacyjne LIF-Jak-Stat3 promujące naiwną sieć regulacji genów¹¹, podczas gdy sygnalizacja autokrynna za pośrednictwem szlaku Erk1/2 czynnika wzrostu fibroblastów 4 (Fgf4) napędza przejście do stanu pierwotnego¹². Wyzwaniem pozostaje jednak systematyczna ocena roli kinaz białkowych w określaniu odrębnych stanów pluripotencjalnych.

Tutaj opisujemy ilościową i skalowalną platformę, za pomocą której przeprowadzamy ukierunkowane badania przesiewowe małych cząsteczek dla regulatorów kinazy naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego. Używamy prostych warunków hodowli mESC oraz standardowych odczynników, materiałów i sprzętu, aby odkryć i zwalidować inhibitory kinaz o dotychczas niedocenianej zdolności do stabilizacji naiwnej pluripotencji. Ponadto omówiono potencjalne rozszerzone zastosowania tej technologii, w tym do badań przesiewowych innych zbiorów małych cząsteczek, takich jak powstające biblioteki inhibitorów ukierunkowane na regulatory epigenetyczne.

Protokół

1. Zestawienie bibliotek inhibitorów kinaz drobnocząsteczkowych

1. Zestawiać biblioteki inhibitorów z publicznie dostępnych kolekcji inhibitorów kinaz, np. Library of Integrated Network-based Cellular Signatures (LINCS) z Harvard Medical School, ukierunkowaną kolekcję 228 silnych i selektywnych inhibitorów kinaz (http://lincs.hms.harvard.edu) oraz Zestaw inhibitorów kinaz białkowych (PKIS), kolekcję 376 związków zebraną przez badaczy przemysłowych (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS)¹³. Alternatywnie, skompletuj specjalną kolekcję inhibitorów kinaz z dostępnych na rynku związków.
   UWAGA: W naszym laboratorium zgromadziliśmy kolekcję 72 silnych i selektywnych inhibitorów kinaz narzędziowych obejmujących 51 głównych kinaz docelowych, z których wszystkie są dostępne ze źródeł komercyjnych.
2. Złóż inhibitory kinaz w 96-dołkowe płytki, aby uzyskać optymalne, wysokowydajne przetwarzanie w wielu stężeniach (użyj 1, 0,1 i 0,01 mM). Do każdej płytki należy dołączyć studzienki kontrolne zawierające tylko DMSO i referencyjne inhibitory kontroli PD173074 (FGFRi) i ruksolitynib (JAKi), o których wiadomo, że promują odpowiednio stany pluripotencjalne naiwne i zapoczątkowane. Dodawaj adnotacje w arkuszu kalkulacyjnym lub podobnym oprogramowaniu.

2. Warunki hodowli mESC i procedury przygotowania ekranu

1. Przygotuj 0,1% pokryte żelatyną 10 cm naczynia, dodając 5 ml 0,1% (w/v) żelatyny do 10 cm talerzy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odessać żelatynę i pozostawić płytkę do wyschnięcia na 2 minuty.
2. Wyhodować dowolną standardową linię mESC w temperaturze 37 °C 5% CO₂ na 0,1% pokrytych żelatyną 10-centymetrowych szalkach w standardowych pożywkach mESC (patrz tabela materiałów) zawierających 100 ng / mL GST-LIF, 10% surowicy płodu cielęcego i 5% wymiany surowicy nokautującej. Wymieniaj pożywki codziennie i pasuj mESC z około 80% zbiegiem co drugi dzień w rozcieńczeniu 1:5-1:10.
3. Aby przejść przez mESC, należy odessać pożywkę i przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na płytkę.
4. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny, 0,02% EDTA) na płytkę mESC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
5. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w 4 ml pożywki mESC i odwirować z prędkością 1 200 obr./min przez 5 minut.
6. Dokładnie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki mESC, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
7. Policz komórki, łącząc 10 μl zawiesiny komórek i 10 μl błękitu trypanowego (0,4%). Umieść w komorze do liczenia komórek lub użyj hemocytometru i mikroskopu świetlnego.
8. Wysiewać 3 x 10³ mESC na 0,1% pokrytych żelatyną 96-dołkowych płytkach, końcowa objętość 100 μl pożywki, za pomocą wielokanałowej pipety.
9. Inhibitory kinaz należy stosować w rozcieńczeniu 1:100 (1 μl inhibitora dodany do 100 μl pożywki) za pomocą pipety wielokanałowej. Delikatnie odpipetować pożywkę, aby wymieszać inhibitor i zawiesinę komórkową, a następnie pozostawić komórki do osadzenia się w kapturze do hodowli tkankowych przez 1 godzinę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na powierzchni posiewu. Hodowla komórek przez 48 godzin bez zmiany pożywki.
   UWAGA: Płytki standardowe 1/0,1/0,01 mM dadzą końcowe stężenie inhibitora odpowiednio 10/1/0,1 μM. zalecamy rozpoczęcie badania przesiewowego od końcowego stężenia 1 μM, aby zapewnić skuteczne hamowanie pierwotnych kinaz docelowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu efektów poza celem.

3. Analiza przesiewowa inhibitorów kinaz

1. Umyć 96-dołkowe płytki mESC w 200 μl PBS za pomocą wielokanałowego aspiratora i pipet.
2. Wykonaj ekstrakty komórkowe w 150 μl buforu do lizy (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v/v), 0,5% deoksycholanu sodu (w/v), 10 mM β-glicerofosforanu, 10 mM pirofosforanu sodu, 1 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets).
3. Klarować ekstrakty przez odwirowanie przy 1 500 x g przez 30 minut na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery V.
4. Unieruchomić 100 μl supernatantów na membranie nitrocelulozowej za pomocą 96-dołkowego próżniowego kolektora punktowego.
5. Wysuszyć membranę i zabarwić 40 ml Ponceau S, aby zapewnić równomierny transfer.
6. Przemyć membranę TBST i zablokować w mleku TBST/3% (w/v).
7. Inkubować w przeciwciałach Nanog i Dnmt3b w rozcieńczeniu 1:1,000 (v/v) w TBST/3% (w/v) mleku w proszku przez noc.
8. Przemyć błony przez 3 x 10 minut w TBST i inkubować w 30 ml przeciwciał drugorzędowych w rozcieńczeniu 1:10 000 (v/v) w TBST/3% (w/v) mleku.
9. Opracowywanie przy użyciu cyfrowego systemu obrazowania immunoblottingowego.
   UWAGA: Jeśli to możliwe, użyj ilościowego immunoblottingu fluorescencyjnego, aby wykryć Nanog i Dnmt3b. Jednak sygnał tła dla Dnmt3b przez immunoblotting fluorescencyjny jest zbyt wysoki. Dlatego stosuje się fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe przeciwko królikowi (Nanog) i anty-myszemu HRP (Dnmt3b) o długości fali 800 nm.

4. Analiza danych przesiewowych i walidacja inhibitorów jako prawdziwych regulatorów pluripotencji

UWAGA: To jest krytyczny krok, aby upewnić się, że identyfikowane są tylko rzeczywiste modulatory pluripotencji. Niezbędna jest selekcja inhibitorów na podstawie zarówno stosunku Nanog:Dnmt3b, jak i sygnału ogólnego, aby zapewnić, że inhibitory kinaz, które niekorzystnie wpływają na przeżycie mESC, nie zostaną wybrane do dalszej analizy.

1. Określ ilościowo sygnał Nanog i Dnmt3b za pomocą oprogramowania do analizy immunoblottingu i zaimportuj wartości do arkusza kalkulacyjnego lub podobnego oprogramowania. Obliczać Stosunek Nanog:Dnmt3b dla wszystkich próbek w porównaniu z kontrolą DMSO. Określ również całkowity sygnał Nanog i Dnmt3b, aby upewnić się, że inhibitory kinaz nie wpływają na stosunek Nanog:Dnmt3b poprzez zmianę żywotności mESC.
2. Użyj uszeregowanych proporcji Nanog:Dnmt3b, aby zidentyfikować inhibitory, które promują naiwną pluripotencję (stosunek Nanog:Dnmt3b wyższy niż kontrola) i primerowaną pluripotencję (stosunek Nanog:Dnmt3b niższy niż kontrola). Ustaw punkt odcięcia na 2-krotne odchylenie od wartości kontrolnych i odfiltruj inhibitory kinaz, które wytwarzają całkowity sygnał Nanog + Dnmt3b mniejszy niż 50% wartości kontrolnej DMSO, aby wygenerować listę inhibitorów kinaz o wysokim poziomie ufności, które stabilizują stany naiwne (wysoki stosunek Nanog: Dnmt3b) i zapoczątkowane (niski stosunek Nanog: Dnmt3b) pluripotencjalne.
3. Walidacja inhibitorów kinaz przez wysiewanie mESC w dawce 2 x 10⁵ komórek na 6 dołków w pożywce o pojemności 2 ml i dodawanie inhibitorów kinaz w ilości 1 μM przez 48 godzin, bez zmiany pożywki.
4. Lizuj mESC w buforze do lizy i analizuj ekspresję Nanog i Dnmt3b za pomocą konwencjonalnego immunoblottingu SDS-PAGE.
5. Dalsza walidacja trafień za pomocą immunoblottingu SDS-PAGE dla naiwnych markerów pluripotencji Klf2 i Klf4 oraz Oct4, aby upewnić się, że pluripotencja utrzymuje się po 48-godzinnym leczeniu inhibitorem.

Wyniki

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury (Rysunek 1), przesiewamy bibliotekę LINCS 228 silnych i selektywnych inhibitorów kinaz, aby zidentyfikować te, które modulują pluripotencję mESC. Bibliotekę przygotowuje się w stężeniu 0,1 mM do rozcieńczenia 1:100 i końcowego stężenia przesiewowego 1 μM w mESC. 48 godzin później mESC poddano lizie, a ekstrakty przygotowano do ilościowej analizy ekspresji Nanog i Dnmt3b metodą dot blot (ryc. 2, u góry). Wyniki innych stężeń przesiewowych nie są tutaj przedstawione dla zwięzłości. Stosunek Nanog:Dnmt3b określa się dla każdego uszeregowanego inhibitora kinazy i związków, a następnie stosuje się 2-krotne odcięcie (ryc. 2, na dole). Całkowity sygnał Nanog i Dnmt3b w stosunku do kontroli jest nakładany na ranking inhibitorów i poddawany 0,5-krotnemu odcięciu, aby umożliwić selekcję inhibitorów, które wykazują znaczną toksyczność mESC. Wybrane inhibitory kinaz, które stabilizują stan naiwny, są walidowane przy użyciu konwencjonalnego immunoblottingu Nanog / Dnmt3b (ryc. 3). Pierwszorzędowe cele kinaz tych inhibitorów przedstawiono w Tabeli 1. Pokazujemy również możliwość zastosowania tego ekranu do identyfikacji inhibitorów, które stabilizują stan zalany¹⁴.

Rycina 1: Przebieg badań przesiewowych inhibitorów kinaz, które modulują przejście naiwnie zagruntowane. mESC potraktowano biblioteką inhibitorów kinaz złożonych 228 w końcowym stężeniu 1 μM. Lizaty przygotowano i przeniesiono na błony nitrocelulozowe w celu analizy immunologicznej dot-blot i określono poziomy Nanog i Dnmt3b (rysunek zaadaptowany z Williams i wsp.¹⁴). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Analiza przesiewowa pluripotencji wcześniej zagruntowanej i identyfikacja inhibitora. (Góra) Reprezentatywne obrazy immuno dot-blot Nanog i Dnmt3b. (Na dole) Wartości Nanog i Dnmt3b dla każdego inhibitora kinazy określono w odniesieniu do kontroli DMSO, a stosunki Nanog:Dnmt3b i całkowity względny sygnał Nanog + Dnmt3b określono i inhibitory uszeregowano w porównaniu z kontrolą DMSO. Inhibitory, u których stwierdzono zmianę stosunku Nanog:Dnmt3b powyżej 2-krotnego progu powyżej lub poniżej kontroli DMSO, zostały zidentyfikowane jako czynniki powodujące naiwną lub zaszczepioną pluripotencję. Próg 2x niższy od kontroli DMSO został ustawiony na triage inhibitorów, które zagrażają przeżyciu mESC. Inhibitory wybrane do dalszej walidacji są wyróżnione. (Rysunek zaczerpnięty z Williams et al.¹⁴). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Walidacja zidentyfikowanych wybranych trafionych związków. mESC leczono AZD4547 1 μM (selektywny inhibitor FGFR) lub wskazanymi inhibitorami zidentyfikowanymi na podstawie badania przesiewowego na rycinie 2. Poziomy Nanog:Dnmt3b określone za pomocą standardowej SDS-PAGE i analizy immunoblot. Wartości liczbowe względnych Nanog:Dnmt3b i Nanog+Dnmt3b przedstawiono w poniższej tabeli, a inhibitory stabilizujące naiwny stan pluripotencjalny zaznaczono na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział:

związek	Główne cele		Inne cele
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK,PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	Lck		Src
Czynnik chłodniczy R406	Syk
GW-572016	HER2		Europejski Instrument Ekonomiczno-Wydmieńczy (U
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR oraz TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2, VEGFR3
AZD-1480	JAK2

Tabela 1: Wybrane związki hitów i ich główne cele kinazy.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy szeroko dostępną metodologię badania roli szlaków sygnałowych kinazy w regulacji naiwnie zapoczątkowanego przejścia pluripotencjalnego. Jest to odpowiedź na kluczowe pytanie w dziedzinie ESC. Chociaż wysokoprzepustowa genomika i transkryptomika są rutynowo stosowane do identyfikacji kluczowych regulatorów transkrypcji w stanach naiwnych i pierwotnych pluripotencjalnych, wyjaśnienie sieci sygnalizacyjnych pluripotencji okazało się wyzwaniem. Obecnie zapewniamy elastyczną strategię wykorzystującą inhibitory chemiczne do identyfikacji kinaz, które kontrolują naiwnie zaszczepione przejście pluripotencjalne w mESC. Opiera się to na prostym sprzęcie, odczynnikach i materiałach, które są dostępne dla większości laboratoriów zajmujących się badaniem sygnalizacji komórkowej i biologii ESC. Kluczowe znaczenie dla sukcesu tej platformy ma opracowanie przez nas solidnego testu do ilościowego określenia przejścia między stanami naiwnymi i pierwotnym pluripotencjalnymi. Ustalenie tego testu wymagało znacznych iteracyjnych modyfikacji gęstości posiewu komórek, czasu inkubacji inhibitora i warunków immunoblottingu.

Podejścia małocząsteczkowe zyskują na popularności pod kątem racjonalnego wykorzystania w terapeutycznych zastosowaniach ESC^15,16. Główną zaletą badań przesiewowych małych cząsteczek jest to, że związki narzędziowe są projektowane i/lub modyfikowane pod kątem wydajnego wychwytu komórkowego. Wydajność transfekcji nie jest ograniczona, a stosowanie niebezpiecznych systemów dostarczania, takich jak lentiwirus, nie jest konieczne. Co więcej, inhibitory często hamują wiele izoform w rodzinie kinaz (np. Fgfr1-4, Jak1-3), co pozwala przezwyciężyć redundancję funkcjonalną, która utrudnia techniki interferencji genetycznej/genomowej, takie jak RNAi i CRISPR/Cas9. W miarę jak coraz silniejsze i bardziej selektywne związki narzędziowe stają się dostępne zarówno w programach akademickich, jak i farmaceutycznych, niedostatecznie zbadane i słabo poznane kinazy zostaną wypchnięte na czoło badań ESC. W związku z tym proponujemy, aby to wysokoprzepustowe podejście do badań przesiewowych otworzyło nowe możliwości badawcze w zakresie podstawowych sieci regulacyjnych ESC.

Jednym z drobnych ograniczeń tej technologii jest to, że nawet najsilniejsze i najbardziej selektywne inhibitory małocząsteczkowe angażują i hamują wiele niepowiązanych ze sobą kinaz in vivo. Jednak coraz bardziej kompleksowe dane dotyczące profilowania inhibitorów kinaz pozwalają na łatwą identyfikację funkcjonalnych celów inhibitorów kinaz (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase-inhibitors). Wreszcie, w zasadzie nasza platforma może być stosowana do badania dowolnego zbioru małych cząsteczek i/lub testu komórkowego, dla którego dostępne są wysokiej jakości przeciwciała immunoblottingowe. Pozwoli to na badanie wielu systemów regulacyjnych w regulacji pluripotencji i ułatwi identyfikację małocząsteczkowych inhibitorów, które modyfikują różne procesy komórkowe. W szczególności przewidujemy, że zastosowanie pojawiających się kolekcji małych cząsteczek, takich jak sondy epigenetyczne opracowywane przez Konsorcjum Genomiki Strukturalnej (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics), może potencjalnie odkryć dalsze nowe regulatory przejść pluripotencjalnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
mESC media
CCE mESC	ATCC	ATCC  SCRC-1023
DMEM Media	Gibco	11965092
L-glutamina	Gibco	25030081	Finał: 2 mM
Penicylina/Streptomycyna	Gibco		15140122 Finał: 50 U/ml
2-merkaptoetanolu	Sigma	M6250	Finał: 0,1 mM
hamujący białaczkę (fuzja GST)	Odczynniki i usługi		Finał: 100 ng/ml
czynnika hamującego białaczkę	Thermo	PMC9484	Final: 100 ng/ml
aminokwasów endogennych	Gibco		11140050 Final: 0,1 mM
pirogronianu sodu	Gibco	11360070	Final: 1 mM
surowicy nokautującej	Invitrogen	10828-028	Final: 5%
Defined Surowica bydlęca płodu	Fisher	10703464	Finał: 10%
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
TC materiały
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Thermo	25300054
Żelatyna ze skóry świni	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytki	Thermo	156545
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14190136
96-dołkowe płytki z dnem w kształcie litery V	Greiner Bio-one	651261
Nazwa	Company	< strong>Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do lizy
Tris Bufor	VWR	103157P
Chlorek sodu	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
1% NP-40	Sigma	9016-45-9
Sód Deoksycholan	Sigma	D6750-100g
β-glicerofosforan	Sigma	G9422
Pirofosforan sodu	Sigma	13472-36-1
Fluorek sodu	Sigma	450022
Ortowanadan sodu	Sigma	450243
Roche Complete Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe	Sigma	CO-RO
strong>Nazwa<	strong>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemicals
Tween	Sigma	P1379-1L
Mleko w proszku	Marvel
Name	Company	Numer katalogowy	Uwagi
Western Blotting
Protran BA 85 Nitroceluloza 0,45 &micor; M  Rozmiar porów (arkusze 20 cm x 20 cm) (25 arkuszy)	GE	10401191
Pąsek S	Sigma	P7170-1L
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Sprzęt laboratoryjny
Minifold I System	GE	10447850
ChemiDoc imager	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
Nazwa	Firma	>Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciała
Anti-mouse Nanog	Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW Donkey Anti-Rabbit	Licor	926-32213
Anti-mouse-HRP	Cell Signalling Technology	7076S
Anti-Klf2	Millipore	09-820
Anti-Klf4	R& D Systems	AF3158
Anti-Oct4	Santa Cruz	sc-5279