Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau

Podsumowanie

Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.

Streszczenie

Tutaj opisujemy etapowe, behawioralne podejście do testowania, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących in vivo skuteczność w poznawczych i funkcjonalnych zachowaniach motorycznych w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Paradygmat obejmuje testy spontanicznej przemiany w labiryncie Y, rozpoznawanie nowych obiektów i zaciskanie kończyn. Testy te zostały wybrane, ponieważ: 1) badają funkcję domen poznawczych lub motorycznych i korelują obwody neuronalne istotne dla stanu choroby człowieka, 2) mają jasno określone punkty końcowe, 3) mają łatwe do wdrożenia kontrole jakości, 4) mogą być przeprowadzane w formacie o umiarkowanej przepustowości i 5) wymagają niewielkiej interwencji badacza. Metody te są przeznaczone dla badaczy, którzy chcą badać związki pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej lub funkcjonalnych zachowań motorycznych związanych z mysimi modelami choroby Alzheimera. Opisane tutaj metody wykorzystują testy behawioralne, które angażują wiele różnych regionów mózgu, w tym hipokamp i różne obszary kory mózgowej. Badacze, którzy pragną testów poznawczych, które konkretnie oceniają funkcje poznawcze, w których pośredniczy pojedynczy region mózgu, mogą wykorzystać te techniki do uzupełnienia innych testów behawioralnych.

Wprowadzenie

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym powodującym wyniszczający spadek funkcji poznawczych, który dotyka około 44 milionów ludzi na całym świecie. Obecnie nie ma dostępnych metod leczenia choroby Alzheimera, które modyfikują przebieg choroby, co podkreśla pilną potrzebę przedklinicznego odkrycia nowych strategii terapeutycznych dla tej choroby. Stworzono wiele różnych modeli myszy transgenicznych, które podsumowują różne aspekty AD^1,2, w tym deficyty w domenach poznawczych zaburzone u pacjentów³. Te modele myszy stanowią użyteczne narzędzie ułatwiające skuteczne badania przesiewowe in vivo.

Podczas oceny związku pod kątem potencjalnej skuteczności in vivo, należy przyjąć podejście etapowe, które sprawdza skuteczność w odpowiednich domenach poznawczych, a także monitoruje zachowania, które mogą wpływać na konkretne punkty końcowe używane do oceny funkcji poznawczych. Wiele transgenicznych mysich modeli AD wykazuje nadpobudliwość i inne zachowania, które mogą zakłócać konkretny test poznawczy i zabraniają jego stosowania w badaniach przesiewowych leków⁴. Ponadto, aby podejście mogło zostać wdrożone w środowisku badań przesiewowych leków, poszczególne stosowane testy powinny utrzymywać co najmniej umiarkowaną przepustowość, mieć jasno określone punkty końcowe oraz procedurę, która wymaga minimalnej interwencji ze strony badaczy. Korzystając z tych kryteriów, można wdrożyć behawioralne badania przesiewowe, które wykazują odtwarzalność, niską wariancję wewnątrz- i międzytestową oraz wielkości efektu potrzebne do badań przesiewowych związków. Poniżej szczegółowo opisano metody, które zastosowaliśmy do badań przesiewowych pod kątem związków skutecznych w łagodzeniu fenotypów poznawczych i motorycznych obecnych w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii5^,6. Opisane metody są zaadaptowane z powszechnie stosowanych paradygmatów behawioralnych opisanych w literaturze⁷, ze specyficznymi optymalizacjami i kontrolami jakości, tak aby można je było stosować w transgenicznych modelach myszy istotnych dla AD. Protokół ten może być używany z różnymi systemami gromadzenia i analizy danych i zakłada, że badacz posiada praktyczną wiedzę na temat powiązanego oprogramowania.

Protokół

Metody opisane w tej publikacji zostały sprawdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC) w Hilltop Laboratory Animals w celu zapewnienia właściwej opieki, użytkowania i humanitarnego traktowania zwierząt zgodnie z obowiązującymi federalnymi, stanowymi i lokalnymi prawami i regulacjami, takimi jak federalne przepisy dotyczące dobrostanu zwierząt (AWR) (CFR 1985) oraz polityka publicznej służby zdrowia dotycząca humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych, lub Polityka PHS (PHS 1996).

1. Ogólne wytyczne dla wszystkich ocen zachowania

1. Przed przystąpieniem do pracy ze zwierzętami należy przykryć istniejące karty klatek nową kartą klatki, na której widnieje tylko unikalny, zaślepiony identyfikator zwierzęcia.
   UWAGA: Badacze, którzy mają do czynienia z myszami podczas rutynowego dawkowania związku/placebo, nie mogą zajmować się myszami w celu oceny behawioralnej.
2. Przyciemnij lub wyłącz górne światła i wyreguluj oświetlenie tak, aby oświetlenie na podłodze areny lub labiryntu miało 30-35 luksów.
3. W przypadku badań trwających kilka tygodni rejestruj masę ciała co tydzień jako pośrednią miarę ogólnego stanu zdrowia.
   UWAGA: Dodatkowe kontrole po stronie klatki pod kątem jakości sierści, postawy, chodu i spontanicznej lokomocji mogą być dołączone, jeśli uzasadnione są bardziej szczegółowe kontrole stanu zdrowia.

2. Przyzwyczajanie myszy do obchodzenia się z nimi przez badaczy

1. Dwa dni przed jakimkolwiek testem behawioralnym przyzwyczaj myszy do obchodzenia się z nimi. Wyjmij klatkę ze stojaka na klatkę i umieść na równej powierzchni.
2. Zdejmij pokrywę z klatki. Posługuj się myszą dokładnie tak, jak byłaby obsługiwana podczas wykonywania nadchodzącego testu behawioralnego. Umieść mysz w złożonej dłoni nad klatką domową.
3. Zmierz opóźnienie, aby przeskoczyć z ręki badacza z powrotem do klatki domowej. Trzymaj myszy maksymalnie przez 5 s.
   UWAGA: Myszy, które wykazują opóźnienia ≥2 s, są uważane za "przyzwyczajone". Myszy, które wykazują opóźnienia <2 s podczas pierwszej próby, przechodzą tego dnia 2 dodatkowe sesje habituacji.
4. Niech myszy przejdą 2 kolejne dni przyzwyczajenia do obchodzenia się z myszami. Zwróć uwagę na każdą mysz, która nie jest przyzwyczajona do końca 2 dnia.

3. Ocena przestrzennej pamięci roboczej poprzez pomiar spontanicznej przemiany w labiryncie Y⁸

1. Przed pierwszym użyciem dokładnie wyczyść labirynt Y bezzapachową chusteczką bakteriobójczą z wybielaczem, 70% EtOH, a następnie dH₂O⁹. Wyraźnie oznaczyć ramiona labiryntu jako "A", "B" i "C" lub inne porównywalne niepowtarzalne identyfikatory.
2. Przed rozpoczęciem sesji testowej ustaw system akwizycji danych lub kamery wideo i ustaw prawidłowe śledzenie myszy w labiryncie. Skalibruj odległość w labiryncie, korzystając z przechwyconych obrazów wideo linijki lub innego obiektu o znanej długości.
   UWAGA: Metody behawioralne w tej procedurze będą działać z różnymi systemami akwizycji danych i autorzy zakładają, że każdy, kto wykonuje tę procedurę, jest biegły w korzystaniu z wybranego przez siebie systemu akwizycji danych. Analizy mocy wskazują, że do uzyskania β ≤0,2 wymagane są próbki o wielkości 10-15 myszy na grupę.
3. Wyjmij klatkę ze stojaka i delikatnie umieść ją na stole w pobliżu labiryntu Y. Wyjmij mysz z klatki domowej i delikatnie umieść ją w jednym ramieniu labiryntu Y, skierowanym do środka. Poproś badacza, aby odsunął się od labiryntu na tyle daleko, aby mysz nie mogła go zobaczyć.
4. Aktywuj system akwizycji danych/wideo natychmiast po umieszczeniu myszy w labiryncie.
5. Naciśnij przycisk odtwarzania i nagrywaj spontaniczne zachowanie każdej myszy przez okres 10 minut. Po zakończeniu sesji delikatnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej i umieść klatkę z powrotem na stojaku.
6. Dokładnie wyczyść labirynt między każdą sesją bezzapachową chusteczką bakteriobójczą z wybielaczem, 70% EtOH, a następnie dH₂O. Powtórz od kroku 3.4, aby ocenić wszystkie myszy.
7. Gdy wszystkie myszy zakończą eksplorację labiryntu Y, przeanalizuj dane z systemu akwizycji lub ręcznie oceń filmy z sesji. Wejście ramienia następuje, gdy wszystkie 4 łapy myszy przekraczają próg strefy środkowej i wchodzą do ramienia, a pysk zwierzęcia jest zorientowany w kierunku końca ramienia.
   UWAGA: Punkty końcowe, które będą analizowane, obejmują: całkowity dystans przebyty w labiryncie, całkowity dystans przebyty w każdym ramieniu (w tym w strefie centralnej), całkowity czas spędzony w każdym ramieniu (w tym w strefie centralnej), całkowitą liczbę wejść do ramienia, liczbę wejść do każdego ramienia oraz sekwencyjną listę wprowadzonych ramion w celu oceny liczby dokonanych zmian.
8. Spontaniczna przemiana występuje, gdy mysz wchodzi do innego ramienia labiryntu w każdym z 3 kolejnych wejść ramienia. Spontaniczna alternacja % jest następnie obliczana za pomocą następującego wzoru:
   
   UWAGA: Na przykład, jeśli kolejność wprowadzania ramienia brzmiałaby: ABCCBABCABC, badacz uzyskałby w sumie 6 spontanicznych zmian (w kolejności: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). Przy łącznej liczbie 11 wejść ramienia, spontaniczny % naprzemienności wynosiłby 67%.
9. Wykonaj następujące kontrole jakości, aby upewnić się, że dane reprezentują bezstronną ocenę spontanicznej przemiany.
   1. Wykonaj korelację Pearsona spontanicznej zmiany % zarówno z całkowitą przebytą odległością, jak i liczbą wykonanych wejść ramienia.
      UWAGA: Jeśli istnieje istotna korelacja spontanicznej zmiany % z którymkolwiek z parametrów, dane powinny być dalej analizowane ze względu na potencjalny wpływ hiperdynamicznej lokomocji na pozorny poznawczy punkt końcowy¹⁰.
   2. Przeanalizuj liczbę wejść do każdego ramienia za pomocą 1-kierunkowego testu ANOVA.
      UWAGA: Jeśli ta analiza jest znacząca, wskazywałoby to na obecność wskazówek w środowisku, które przyciągnęły myszy do określonego regionu labiryntu.

4. Ocena pamięci rozpoznawania pośredniego poprzez pomiar rozpoznawania nowych obiektów^11,12,13

1. Dla każdej fazy tego testu dokładnie wyczyść arenę na otwartym polu bezzapachową chusteczką bakteriobójczą z wybielaczem, 70% EtOH, a następnie dH₂O przed pierwszym użyciem.
2. Dzień przed ekspozycją na obiekt przyzwyczaj myszy do areny na otwartym polu.
   1. Przed rozpoczęciem sesji habituacji skonfiguruj system akwizycji danych lub kamery wideo i potwierdź prawidłowe śledzenie myszy w labiryncie. Skalibruj odległość na arenie, korzystając z przechwyconych obrazów wideo linijki lub innego obiektu o znanej długości. Zaznacz rogi areny w oprogramowaniu, aby umożliwić ocenę odchyleń pozycyjnych.
      UWAGA: Metody behawioralne w tej procedurze będą działać z różnymi systemami akwizycji danych i autorzy zakładają, że każdy, kto wykonuje tę procedurę, jest biegły w korzystaniu z wybranego przez siebie systemu akwizycji danych. Analizy mocy wskazują, że do uzyskania β ≤0,2 wymagana jest wielkość próby 15-20 myszy na grupę.
   2. Zdejmij klatkę ze stojaka i delikatnie połóż na stole w bliskiej odległości od areny.
   3. Wyjmij mysz z klatki domowej i delikatnie umieść ją na środku areny. Włącz oprogramowanie śledzące i/lub system nagrywania wideo natychmiast po umieszczeniu myszy na arenie.
   4. Pozwól myszom swobodnie eksplorować arenę przez 30 min.
      UWAGA: W tym okresie badacze nie będą przeszkadzać myszom.
   5. Po sesji habituacji umieść myszy z powrotem w ich domowej klatce i dokładnie wyczyść arenę bezzapachową chusteczką bakteriobójczą z wybielaczem, 70% EtOH, a następnie dH₂O.
   6. Powtarzaj od kroku 4.2.2, aż wszystkie myszy przyzwyczają się do areny.
   7. Po tym, jak wszystkie myszy przyzwyczają się do areny, przeanalizuj wideo.
      UWAGA: Punkty końcowe do analizy obejmują całkowity dystans przebyty na arenie i czas spędzony w pobliżu każdego zakrętu. Jeśli jest to istotne dla modelu mysiego, w tych analizach uwzględnia się stereotypowe zachowania (np. miokloniczne skakanie po rogach, krążenie itp.). Myszy wykazujące odchylenia w czasie spędzonym w określonych rejonach areny są wykluczone z dalszych eksperymentów, ponieważ wpłynie to na eksplorację obiektów.
      UWAGA: Pierwsza faza rozpoznawania nowych obiektów polega na oswajaniu myszy z obiektem. W tym przypadku ta część procedury rozpoznawania nowych obiektów będzie określana jako faza próby.
   8. Przed rozpoczęciem sesji fazy próbnej umieść przedmioty na arenie i przymocuj je do podłogi za pomocą szpachli montażowej, aby zwierzęta nie mogły nimi poruszać. Wyrównaj dwa identyczne obiekty do określonej ściany z wystarczającą odległością między ścianami a obiektami, aby myszy mogły swobodnie eksplorować obiekty pod każdym kątem.
   9. Skonfiguruj system akwizycji danych lub kamery wideo i potwierdź prawidłowe śledzenie myszy i obiektów w labiryncie. Skalibruj odległości na arenie, korzystając z przechwyconych obrazów wideo linijki lub innego obiektu o znanej długości.
   10. Zaznacz rogi areny w oprogramowaniu, aby umożliwić ocenę odchyleń pozycyjnych. Oznaczaj obiekty w oprogramowaniu i śledź ich zachowanie eksploracyjne osobno dla każdego obiektu (tj. "Obiekt A" i "Obiekt B").
   11. Wyjmij klatkę ze stojaka i delikatnie połóż ją na stole w bliskiej odległości od areny.
   12. Wyjmij mysz z klatki domowej i delikatnie umieść ją na środku areny, przodem do obiektów.
   13. Pozwól myszy swobodnie eksplorować obiekty przez 15 minut. W tym okresie nie przeszkadzaj myszom.
   14. Pod koniec sesji delikatnie umieść mysz z powrotem w jej klatce domowej. Oczyść arenę i przedmioty za pomocą 70% EtOH i dH₂O. Umieść te przedmioty z powrotem na arenie.
   15. Powtarzaj krok 4.2.11, aż wszystkie myszy zapoznają się z obiektem.
   16. Gdy wszystkie myszy zapoznają się z obiektem, przeanalizuj filmy.
       UWAGA: Eksploracja obiektu jest liczona po spełnieniu następujących kryteriów: mysz jest zorientowana w kierunku obiektu, pysk znajduje się w odległości nie większej niż 2 cm od obiektu, środek ciała zwierzęcia znajduje się poza 2 cm od obiektu, a poprzednie kryteria są spełnione przez co najmniej 1 s. Dodatkowo, jeśli zwierzę spełniło kryteria eksploracji, ale wykazuje bezruch przez > 10 sekund, wówczas walkę eksploracyjną uważa się za zakończoną.
   17. Oblicz wynik odchylenia obiektu dla każdej myszy w następujący sposób.
       
       UWAGA: Myszy wykazujące wynik odchylenia obiektu poniżej 20% lub powyżej 80% są wykluczone z dalszych eksperymentów.
3. Ostatnia faza rozpoznawania nowego obiektu polega na ocenie zachowania eksploracyjnego skierowanego zarówno na nowy, jak i znajomy obiekt w środowisku, nazywanej tutaj fazą testową. Fazę tę wykonuje się 2-3 godziny po zakończeniu fazy pobierania próbki.
   1. Przed rozpoczęciem sesji fazy testowej umieść przedmioty na arenie i przymocuj je do podłogi, aby zwierzęta nie mogły nimi poruszać.
      1. Umieść obiekty w tej samej pozycji na arenie względem fazy próbkowania¹³.
      2. Zrównoważ względną pozycję nowych i znanych obiektów w genotypach i grupach badanych.
      3. Upewnij się, że między ścianami a obiektami jest wystarczająca odległość, aby myszy mogły swobodnie eksplorować obiekty pod każdym kątem.
   2. Skonfiguruj system akwizycji danych i/lub kamery wideo. Potwierdź prawidłowe śledzenie myszy i obiektów w labiryncie. Kalibruj odległości na arenie, korzystając z przechwyconych obrazów wideo linijki lub innego obiektu o znanej długości.
   3. Oznacz rogi areny w oprogramowaniu, aby umożliwić ocenę odchyleń pozycyjnych. Oznaczaj obiekty w oprogramowaniu i śledź zachowania eksploracyjne dla każdego obiektu indywidualnie (np. "Nowy" i "Znajomy").
   4. Wyjmij klatkę ze stojaka i delikatnie połóż ją na stole w bliskiej odległości od areny.
   5. Delikatnie umieść zwierzęta na środku areny, przodem do obiektów. Nagrywaj myszy swobodnie eksplorujące obiekty przez 10 minut.
   6. Pod koniec sesji testowej usuń myszy z areny i umieść je z powrotem w ich domowej klatce. Po każdej sesji dokładnie wyczyść arenę i przedmioty bezzapachową chusteczką bakteriobójczą wybielacza, 70% EtOH i dH₂O.
   7. Powtarzać czynności od kroku 4.4.3 do momentu, aż wszystkie zwierzęta zostaną ocenione.
   8. Po zmierzeniu eksploracji obiektów dla wszystkich myszy analizowane są filmy.
      UWAGA: Eksploracja obiektu jest liczona po spełnieniu następujących kryteriów: mysz jest zorientowana w kierunku obiektu, pysk znajduje się w odległości nie większej niż 2 cm od obiektu, środek ciała zwierzęcia znajduje się poza 2 cm od obiektu, a poprzednie kryteria są spełnione przez co najmniej 1 s. Dodatkowo, jeśli zwierzę spełniło kryteria eksploracji, ale wykazuje bezruch przez > 10 sekund, wówczas walkę eksploracyjną uważa się za zakończoną.
   9. Oceń rozpoznawanie nowych obiektów, porównując czas spędzony na odkrywaniu powieści ze znajomym obiektem. W literaturze powszechnie opisywane są trzy metody.
      1. Przeanalizuj surowy czas spędzony na odkrywaniu zarówno nowych, jak i znanych obiektów, korzystając z testu powtarzanych pomiarów. Metodę tę najlepiej stosować, gdy genotyp i/lub leczenie nie wpływają na całkowity czas eksploracji.
      2. Oblicz preferencję nowości, korzystając z równania:
         
         UWAGA: Podaje procent czasu spędzonego na eksploracji nowego obiektu w stosunku do całkowitego czasu eksploracji obiektów. Wartości mieszczą się w zakresie od 0% (brak eksploracji nowego obiektu) do 100% (eksploracja tylko nowego obiektu), przy czym wartość 50% wskazuje równy czas spędzony na odkrywaniu nowych i znanych obiektów.
      3. Oblicz wskaźnik dyskryminacji¹¹, używając równania:
         
         UWAGA: Daje to różnicę w czasie spędzonym na eksploracji nowych i znanych obiektów w stosunku do całkowitego czasu spędzonego na eksploracji obiektów. Wartości mieszczą się w zakresie od -1 (eksploracja tylko znanego obiektu) do +1 (eksploracja tylko nowego obiektu, przy czym wartość 0 oznacza równy czas spędzony na eksploracji nowych i znanych obiektów.
   10. Usuń zwierzęta, które nie biorą udziału w sesji testowej z powodu hiperdynamicznej lokomocji lub innych stereotypów, z rozważań¹¹.
       UWAGA: Kryteria stosowane do usuwania muszą być obiektywne i określone a priori dla modelu myszy (tj. <5. percentyl dla całkowitego czasu eksploracji i albo >100 średniego kąta skrętu podczas sesji testowej, albo >50. percentyla czasu wykazującego miokloniczne skakanie po zakrętach).

5. Ocena funkcji korowo-rdzeniowej u myszy z zaciskaniem kończyn¹⁴

1. Wideo dokumentuje całą sesję. Nagraj wideo za pomocą przenośnego urządzenia przenośnego (np. smartfona lub jego odpowiednika).
   UWAGA: Analizy mocy wskazują, że do uzyskania β ≤0,2 wymagana jest wielkość próby 10-15 myszy na grupę.
2. Wyjmij klatkę domową ze stojaka i umieść ją na stole. Udokumentuj identyfikator zwierzęcia na filmie przed następnym krokiem.
3. Delikatnie wyjmij mysz z klatki i zawieś za ogon na 5-10 sekund. Film musi rejestrować tylne i przednie łapy zwierzęcia w stanie zawieszenia.
4. Po nagraniu co najmniej 5 s wideo umieść mysz z powrotem w klatce domowej i włóż klatkę z powrotem do stojaka.
5. Wyczyść stół. Powtarzaj od kroku 5.2, aż wszystkie myszy zostaną zarejestrowane.
6. Punktuj zaciskanie kończyn na podstawie filmów myszy zawieszonych za ogon w skali od 0 do 4 (patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z opisem punktacji). Sprawdź filmy z zawieszonymi myszami, a następnie przypisz wynik na podstawie następujących kryteriów.
   1. Brak zaciskania kończyn. Normalne przedłużenie ucieczki. Jedna tylna kończyna wykazuje niepełne rozchylenie i utratę ruchomości. Palce u nóg mają normalne rozchylenie.
   2. Obie kończyny tylne wykazują niepełne rozchylenie i utratę ruchomości. Palce u nóg mają normalne rozchylenie.
   3. Obie kończyny tylne wykazują splecione z podkurczonymi palcami u nóg i bezruchomość.
   4. Kończyny przednie i tylne są zaciśnięte i skrzyżowane, podkurczone palce u nóg i unieruchomione.
7. Wszystkie myszy są oceniane przez 2 niezależnych badaczy. Każda mysz, w której 2 wyniki różnią się o więcej niż 1 punkt, jest ponownie punktowana.
   1. Wyniki, które się różnią, są uśredniane.

Tabela 1: Opis punktacji zaciśnięcia kończyn.

Wyniki

Wiekowe myszy Tg2576 wykazują silne deficyty w spontanicznych przemianach dokonywanych w labiryncie Y^15,16, fenotypu, który można replikować za pomocą metod opisanych tutaj (Rysunek 1A). Podczas gdy u tych myszy obserwuje się tendencję do zwiększonego wchodzenia w ramię (Figura 1B), nadpobudliwość obserwowana w tej linii myszy nie wpłynęła na szybkość spontanicznej przemiany (Figura 1C). W przeciwieństwie do tego, starzejące się myszy rTg4510 wydają się wykazywać zwiększoną spontaniczną przemianę po umieszczeniu w labiryncie Y (Figura 1D). Wynika to z ekstremalnej nadpobudliwości (Rysunek 1E) i stereotypy¹⁰, które znacząco zakłócają pomiar spontanicznej przemiany (Rysunek 1F). Podczas wstępnej oceny myszy w tym zadaniu ważne jest, aby upewnić się, że wejścia ramion i/lub przebyta odległość nie są istotnie skorelowane z częstością spontanicznych zmian.

Przed oceną rozpoznawania nowych obiektów, myszy są przyzwyczajane do areny, na której będzie przeprowadzany test. Podczas habituacji można ocenić nadpobudliwość (ryc. 2A) i inne stereotypowe zachowania istotne dla modelu mysiego. Podczas fazy próbkowania kluczowe znaczenie ma pomiar eksploracji każdego obiektu osobno, tak aby myszy, które wykazują znaczące uprzedzenia w zachowaniu eksploracyjnym, mogły zostać wyłączone z dalszej oceny (Rysunek 2B, otwarte kręgi). Rozpoznawanie nowych obiektów jest oceniane poprzez porównanie eksploracji znanego i nowego obiektu i jest zwykle analizowane na trzy różne sposoby. Jeśli całkowity czas eksploracji jest porównywalny między genotypami i / lub grupami leczonymi, wówczas surowy czas badania każdego obiektu i odpowiednie testy powtarzanych pomiarów można wykorzystać do określenia, czy wystąpiły różnice w rozpoznawaniu nowych obiektów (Figura 2C). Jeśli konkretny szczep myszy wykazuje różnice w całkowitym czasie eksploracji, rozpoznawanie nowych obiektów można ocenić za pomocą preferencji nowości (Rysunek 2D) lub wskaźnika dyskryminacji (Rysunek 2E).

Zaciskanie kończyn to funkcjonalny test motoryczny, który określa ilościowo deficyty funkcji korowo-rdzeniowej. Zaciskanie kończyn, które nie jest miarą poznawczą, obserwuje się w kilku transgenicznych modelach myszy tau^6,17,18,19 i podsumowuje niektóre z funkcjonalnych deficytów motorycznych obserwowanych u pacjentów z AD w późnym stadium. Zawieszenie myszy przez ogon wywołuje reakcję ucieczki (ryc. 3A, "0"). Deficyty w zdolności do rozchylania kończyn tylnych i prostowania palców u nóg są oceniane na podstawie ich nasilenia w skali od 0 do 4 (ryc. 3A). Korzystając z opisanej tutaj procedury, można zaobserwować znaczne zaciskanie kończyn u myszy rTg4510 (ryc. 3B).

Ryc. 1: Spontaniczna zmiana w labiryncie Y. (A) Po umieszczeniu w labiryncie Y, myszy przyjmują strategię wyszukiwania typu losse-shift, która skutkuje wzorcem eksploracji, w którym każde ramię jest badane tylko raz na każde 3 wejścia ramienia. Starzejące się myszy Tg2576 wykazują znaczny deficyt spontanicznej przemiany. Stosując procedury opisane w tej metodzie, zaobserwowano znaczne przywrócenie spontanicznej przemiany po leczeniu zastrzeżonym związkiem. Dane analizowano za pomocą 1-kierunkowej ANOVA, a porównania post-hoc z Tg-PBS przeprowadzono za pomocą testu Dunnetta. **p <0,01. Słupki błędów wskazują SEM. (B) Liczba wpisów ramienia nie różniła się istotnie w żadnej z grup monitorowanych w tym eksperymencie. Dane analizowano za pomocą 1-czynnikowego testu ANOVA. Słupki błędów wskazują SEM. (C) Nie stwierdzono korelacji między spontaniczną zmianą a liczbą dokonanych wejść do ramienia, co wskazuje, że jakiekolwiek różnice w spontanicznej aktywności lokomotorycznej nie miały wpływu na kwantyfikację spontanicznej zmiany. Test korelacji przeprowadzono przy użyciu analizy korelacji Pearsona. (D) Po umieszczeniu w labiryncie Y, myszy rTg4510 (6 miesięcy) wydają się wykazywać znacznie bardziej spontaniczną przemianę w porównaniu z myszami WT z miotu. Dane analizowano za pomocą 1-kierunkowej ANOVA, a porównania post-hoc z Tg-PBS przeprowadzono za pomocą testu Dunnetta. **p <0,01. Słupki błędów wskazują SEM. (E) myszy rTg4510 wykonały znacznie więcej wejść w ramię ze względu na ich ekstremalną hiperdynamiczną lokomocję. Dane analizowano za pomocą 1-kierunkowej ANOVA, a porównania post-hoc z Tg-PBS przeprowadzono za pomocą testu Dunnetta. p <0,001. Słupki błędów wskazują SEM. (F) Spontaniczne zachowanie alternacyjne istotnie korelowało z wejściami ramienia, co wskazuje, że hiperdynamiczny fenotyp lokomotoryczny przesłonił prawdziwą spontaniczną zmianę. Test korelacji przeprowadzono przy użyciu analizy korelacji Pearsona (r = 0,7, p <0,0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rozpoznawanie nowych obiektów. (A) Habituacja areny pozwala na pomiar spontanicznej lokomocji i innych stereotypowych zachowań istotnych dla konkretnego modelu myszy. Tutaj starsze myszy Tg2576 (22 miesiące) wykazują znacznie bardziej spontaniczną lokomocję w porównaniu z myszami WT z miotu. Dane analizowano za pomocą 1-kierunkowej ANOVA, a porównania post-hoc z Tg-Veh przeprowadzono za pomocą testu Dunnetta. **p <0,01. Słupki błędów wskazują SEM. (B) Podczas fazy próbkowania eksploracja dwóch identycznych obiektów była śledzona oddzielnie. Myszy, które wykazują duże skłonności do eksploracji jednego z dwóch obiektów (otwartych kręgów), zostały wykluczone z fazy testowej. (C-E) Rozpoznawanie nowych obiektów oceniano, mierząc eksplorację nowego i znajomego obiektu. Rozpoznawanie nowych obiektów oceniano na podstawie (C) surowego czasu eksploracji, (D) preferencji nowości lub (E) wskaźnika dyskryminacji. Dane w panelu C przeanalizowano za pomocą dwukierunkowej ANOVA z powtarzającymi się pomiarami, a porównania parami wykonano za pomocą testu Sidaka. Dane w panelach D-E analizowano za pomocą 1-kierunkowej ANOVA, a porównania post-hoc z Tg-Veh wykonano za pomocą testu Dunnetta. *p <0,05, **p <0,01. Słupki błędów wskazują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zaciskanie kończyn.(A) Reprezentatywne obrazy myszy wykazujących różne stopnie zaciskania kończyn, jak opisano w Tabeli 1. (B) Myszy rTg4510 (6 miesięcy) wykazują znaczne zaciskanie kończyn w porównaniu z myszami WT z miotu, jak oceniono przy użyciu tych metod. Dane analizowano przy użyciu 1-kierunkowej ANOVA, a porównania post-hoc z Tg-PBS przeprowadzono za pomocą testu Dunnetta. p <0,001, ****p <0,0001. Słupki błędów wskazują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących metod
Procedura ta została zaprojektowana w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem aktywności in vivo związków w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Zastosowane tu podejście etapowe zapewnia wykrywanie skutecznych związków w domenach poznawczych istotnych dla AD³. Co więcej, opisane tutaj podejście wykorzystuje testy behawioralne, które mają jasno zdefiniowane punkty końcowe, łatwe do wdrożenia kontrole jakości, mogą być uruchamiane w formacie o umiarkowanej przepustowości i wymagają niewielkiej interwencji ze strony badacza. Cechy te skutkują testami, które wykazują dobrą odtwarzalność na zwierzętach i w kohortach, co skutkuje niską wariancją wewnątrz- i międzytestową oraz wielkościami efektu (2 ≤f ≤6), które są wystarczająco solidne, aby wspierać profilowanie behawioralne w środowisku odkrywania leków.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Wiele modeli mysich wykorzystywanych do odkrywania leków na chorobę Alzheimera wykazuje zachowania zgodne ze zwiększonym lękiem i agresją. To sprawia, że radzenie sobie z przyzwyczajeniem jest niezbędne do wykonania któregokolwiek z opisanych tutaj testów behawioralnych. Ponieważ testy te opierają się na nieumotywowanych zachowaniach, nieostrożne obchodzenie się z nią przez badacza z powodu nadpobudliwej i niespokojnej lub agresywnej myszy może znacząco wpłynąć na wydajność. Zwiększony niepokój może skutkować niewykonaniem zadania, zmniejszając ogólną moc testu. Co więcej, poziom światła na arenie jest niezbędny do ułatwienia spontanicznej lokomocji potrzebnej do każdego testu. Jasne światło ma tendencję do zwiększania niepokoju i tłumienia lokomocji u gryzoni, dlatego należy zadbać o dostosowanie poziomu światła otoczenia do 30-35 luksów na arenie.

Innym krytycznym aspektem procedury jest minimalizacja silnych sygnałów środowiskowych, które mogłyby zakłócać zdolność zwierzęcia do wykonywania zadań. Sprzątanie areny i obiektów między biegami jest niezbędne, ponieważ myszy przyciągają nowe zapachy w otoczeniu. Brak dokładnego oczyszczenia areny i obiektów może skutkować zniekształceniem spontanicznej aktywności myszy i zamaskowaniem prawdziwej sprawności poznawczej. Badacze powinni również zminimalizować użycie środków higieny osobistej i wód kolońskich/perfum podczas wykonywania tych procedur. Wreszcie, gryzonie wykazują silne zmiany dobowe i okołodobowe w wielu jawnych zachowaniach²⁰ , w tym w uczeniu się i^pamięci21. Dlatego, aby zminimalizować wariancję wynikającą z rytmów dobowych w podstawowych zachowaniach i sprawności poznawczej, wszystkie testy powinny być wykonywane o tej samej porze dnia we wszystkich kohortach i badaniach.

Ponadto, szczególnie w odniesieniu do rozpoznawania nowych obiektów, krytycznymi parametrami są odstęp czasu między próbką a fazą testową oraz wybór i rozmieszczenie obiektów w środowisku. Pamięć występuje w 3 różnych formach: pamięci krótkotrwałej (STM), pamięci krótkotrwałej (ITM) i pamięci długotrwałej (LTM)^22,23. Zmiana interwału między fazami próbki i testu z minut (STM) na godziny (ITM) lub dni (LTM) zmieni typ pamięci testowanej przez procedurę¹². Co więcej, przed przeprowadzeniem testu rozpoznawania nowych obiektów, wiele obiektów powinno zostać przebadanych w kohorcie testowej myszy pod kątem potencjalnych uprzedzeń podczas eksploracji. Obiekt, który jest nadmiernie atrakcyjny lub odpychający dla kohorty testowej, nie może być używany do oceny rozpoznawania nowego obiektu. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie obiekty, które zostaną użyte w teście, po umieszczeniu na arenie wywołały równy czas eksploracji od naiwnej kohorty myszy. Nieodpowiednie testowanie i optymalizacja obiektów może znacznie zmniejszyć moc rozpoznawania nowych obiektów.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Istnieje kilka czynników, które mogą zwiększyć pozorną zmienność w opisywanych tutaj testach poznawczych. Wiele mysich modeli AD wykazuje hiperdynamiczną lokomocję³, która może maskować lub zmieniać zachowania mierzone jako poznawczy punkt końcowy. Co więcej, istnieje coraz więcej dowodów na to, że płeć 24,25,26, a nawet genotyp ^{matki 27} mogą wpływać na rozwój i progresję neuropatologii i fenotypów poznawczych w mysich modelach AD. Nieoczekiwana zmienność lub niepowodzenie w realizacji zadania behawioralnego może być spowodowane dowolnym z tych czynników. Przy pierwszym wdrażaniu konkretnego testu behawioralnego wyniki powinny być zawsze stratyfikowane według płci, wieku i, w stosownych przypadkach, genotypu matki. Ponadto kontrole jakości przedstawione w tej procedurze powinny być zawsze przeprowadzane, aby upewnić się, że nadpobudliwość lub inne stereotypowe zachowania nie zakłócają kwantyfikacji poznawczych punktów końcowych.

Środowisko może również wpływać na spontaniczne zachowania eksploracyjne gryzoni. Zapachy lub dźwięki, które są niewykrywalne dla badaczy, mogą przyciągać lub odstraszać myszy, zniekształcając wyniki testów poznawczych, które opierają się na spontanicznym zachowaniu. Przy początkowym ustalaniu labiryntu Y lub rozpoznawania nowych obiektów, niezbędne jest wykonanie środków kontrolnych w celu zapewnienia, że nie ma uprzedzeń pozycyjnych podczas eksploracji obiektów i/lub środowiska. Jeśli zaobserwuje się odchylenia pozycyjne, badacze muszą dokładnie przeanalizować środowisko i potencjalnie dostosować oświetlenie, rozmieszczenie areny, lokalizację pomieszczenia testowego względem innych pomieszczeń w obiekcie (tj. nie w pobliżu obszaru o dużym natężeniu ruchu lub ciężkiego sprzętu) oraz procedury czyszczenia areny.

Przyzwyczajenie się do środowiska testowego jest kluczem do osiągnięcia optymalnej wydajności w teście rozpoznawania nowych obiektów. Na przykład krótki całkowity czas eksploracji może wynikać z nieodpowiedniego przyzwyczajenia. Jako alternatywę dla opisanych tutaj procedur dotyczących postępowania (sekcja 2) i przyzwyczajenia areny (sekcja 4.2), przyzwyczajenie do obsługi i środowiska testowego można przeprowadzić jako 3,5 minutowe sesje dziennie przez 2 kolejne dni.

Ograniczenia techniki
Jak w przypadku każdej procedury, te testy behawioralne mają ograniczenia. Procedury te zostały zastosowane, ponieważ badają funkcję różnych obszarów kory mózgowej i hipokampa. Jeśli model mysi nie wykazuje deficytów funkcjonalnych w regionach mózgu badanych przez te testy, techniki te nie będą przydatne. Ponadto wybraliśmy testy kognitywne, które badają pamięć krótkotrwałą. Jeśli nie oczekuje się, że mechanizm działania związku poddanego ocenie przedklinicznej wpłynie na pamięć krótkotrwałą, wówczas procedury te powinny zostać odpowiednio zmodyfikowane (tj. zwiększyć odstęp między fazą próbka-badanie w celu zbadania pamięci długotrwałej). Wreszcie, testy te wykorzystują nieumotywowane zachowania. Dlatego, jeśli model myszy jest nadmiernie nadpobudliwy lub wykazuje inne stereotypowe zachowania, które uniemożliwiają eksplorację środowiska, procedury te mogą nie być optymalne. Jako alternatywę można użyć warunkowania strachu dla Tg2576 lub innych mysich modeli β-amyloidozy, lub przestrzennego labiryntu wodnego dla rTg4510 lub innych mysich modeli tauopatii³.

Przyszłe zastosowania
Po pomyślnym przyjęciu tych procedur w laboratorium można wprowadzić kilka modyfikacji lub rozszerzeń w celu oceny dodatkowych poznawczych i funkcjonalnych wskaźników motorycznych. Na przykład zmiana zadania rozpoznawania nowych obiektów w celu określenia, czy mysz może rozpoznać zmianę położenia obiektu¹³. Alternatywnie, zamiast używać przedmiotów, można użyć innych myszy i przeprowadzić test rozpoznania społecznego. Jeśli chodzi o zaciskanie kończyn i funkcje motoryczne, można by uzupełnić ten test o testy zwisu z drutu i/lub wytrzymałości chwytu. Testy szczegółowo opisane w tej metodzie stanowią solidną podstawę do badań przesiewowych pod kątem związków, które mają skuteczność in vivo w translacyjnych modelach myszy w chorobie Alzheimera i mogą być dostosowywane lub modyfikowane na wiele sposobów, aby jak najlepiej przesłuchać konkretny model myszy lub spełnić potrzeby unikalnego programu odkrywania leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Topscan Lite-High Throughput	Cleversys Zautomatyzowana		analiza behawioralna. Zawiera kamery i system akwizycji wideo, laptop.
ObjectScan	Moduł oprogramowania Cleversys		do dokładnej kwantyfikacji eksploracji obiektów
Otwarte pole dla myszy	Cleversys	CSI-OF-M	Arena do rozpoznawania nowych obiektów
Labirynt Y dla myszy	Niestandardowe		ramiona: 30 cm długości, 10 cm szerokości, 20 cm wysokości, umieszczone w odległości 120 stopni od siebie.
Uchwyt kamery do otwartego pola	Custom Custom	76	cm wysokości, 115 cm szerokości, kamery zamontowane @ 30 cm z każdej strony.  Dwa uchwyty, z których każdy zakrywa dwie skrzynki.
Uchwyt kamery do Y-maze	Custom	Custom 76	cm wysokości, 115 cm szerokości, kamery zamontowane @ 30cm z każdej strony.  Jeden montaż obejmuje dwa labirynty.
Marbles	Inperial Toy	8565	Standardowe (średnica 15,5 mm) szklane kulki.
Kości	Cardinal Industries	770	Standard (0,650 cala) białe kości z czarnymi kropkami.
LOCTITE Fun-Tak	Henkel	B018A3AG0W	Standard niebieski lepki tak
EtOH	Nexeo Solutions	82452	100% etanol Rozcieńczony do 70% przy użyciu wody destylowanej
dH2O	Tulpenhocken Spring Water Co.	-	PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320
Ręczniki papierowe	Procter & Gamble	B019DM86LA	Bounty, biała
ręczna kamera wideo	Apple, Inc.	MKV92LL/A	Przejęcie filmu o zaciskaniu kończyn, Iphone 6S Plus (lub funkcjonalny odpowiednik).
Rękawice	SafePOINT, L.L.C.	GL640-2	Standard, bezpudrowe rękawice lateksowe, średni
światłomierz	Dr. Meter	LX1330B	Oświetlenie @ spód otwartego pola = 35 luksów, Oświetlenie @ spód labiryntu Y= 32 LUX
Chusteczki bakteriobójcze	Clorox		Sterylizacja sprzętu w trakcie i po użyciu