Artykuł metodologiczny

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

DOI:

10.3791/55528

⸱

28 lipca 2017

 ,  , 
1Cereal Disease Laboratory, United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service, 2Department of Horticultural Science, University of Minnesota, 3Department of Plant Pathology, University of Minnesota

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomy organelli roślinnych zawierają duże, powtarzalne elementy, które mogą ulegać parowaniu lub rekombinacji, tworząc złożone struktury i/lub fragmenty subgenomowe. Genomy organellarne istnieją również w domieszkach w obrębie danego typu komórki lub tkanki (heteroplazmia), a obfitość podtypów może zmieniać się w trakcie rozwoju lub pod wpływem stresu (przesunięcie substechiometryczne). Technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) są niezbędne do głębszego zrozumienia struktury i funkcji genomu organellarów. Tradycyjne badania sekwencjonowania wykorzystują kilka metod w celu uzyskania organellarnego DNA: (1) Jeśli używana jest duża ilość tkanki wyjściowej, jest ona homogenizowana i poddawana wirowaniu różnicowemu i/lub oczyszczaniu gradientowemu. (2) Jeśli używana jest mniejsza ilość tkanki (tj. jeśli nasiona, materiał lub przestrzeń są ograniczone), przeprowadza się ten sam proces, co w (1), po którym następuje amplifikacja całego genomu w celu uzyskania wystarczającej ilości DNA. (3) Analiza bioinformatyczna może być wykorzystana do sekwencjonowania całkowitego genomowego DNA i do analizowania odczytów organellarów. Wszystkie te metody wiążą się z nieodłącznymi wyzwaniami i kompromisami. W (1) uzyskanie tak dużej ilości tkanki wyjściowej może być trudne; w (2) amplifikacja całego genomu może wprowadzić błąd sekwencjonowania; a w (3) homologia między genomami jądrowymi i organellarnymi może zakłócać składanie i analizę. W roślinach z dużymi genomami jądrowymi korzystne jest wzbogacanie DNA w organellary w celu zmniejszenia kosztów sekwencjonowania i złożoności sekwencji w analizach bioinformatycznych. W tym miejscu porównujemy tradycyjną metodę wirowania różnicowego z czwartą metodą, dostosowanym podejściem CpG-methyl pulldown, w celu rozdzielenia całkowitego genomowego DNA na frakcje jądrowe i organellarne. Obie metody dają wystarczającą ilość DNA dla NGS, DNA, które jest wysoce wzbogacone o sekwencje organellarne, choć w różnych proporcjach w mitochondriach i chloroplastach. Przedstawiamy optymalizację tych metod dla tkanki liści pszenicy i omawiamy główne zalety i wady każdego podejścia w kontekście wprowadzania próbki, łatwości protokołu i dalszego stosowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie genomu to potężne narzędzie do analizy genetycznych podstaw ważnych cech roślin. Większość badań nad sekwencjonowaniem genomu koncentruje się na zawartości genomu jądrowego, ponieważ większość genów znajduje się w jądrze. Jednak genomy organellarów, w tym mitochondria (eukarionty) i plastydy (u roślin; wyspecjalizowana forma, chloroplast, działa w fotosyntezie) wnoszą istotną informację genetyczną niezbędną do rozwoju organizmu, reakcji na stres i ogólnej sprawności1. Genomy organelli są zazwyczaj włączane do całkowitej liczby ekstrakcji DNA przeznaczonych do sekwencjonowania genomu jądrowego, chociaż stosuje się również metody zmniejszania liczby organelli przed ekstrakcją DNA2. W wielu badaniach wykorzystano wyniki sekwencjonowania z całkowitej ekstrakcji gDNA w celu złożenia genomów organellarnych3,4,5,6,7. Jednakże, gdy celem badania jest skupienie się na genomach organellarnych, użycie całkowitego gDNA zwiększa koszty sekwencjonowania, ponieważ wiele odczytów jest "traconych" na rzecz sekwencji DNA jądrowego, szczególnie w roślinach o dużych genomach jądrowych. Ponadto, ze względu na duplikację i transfer sekwencji organellarów do genomu jądrowego i między organellami, rozwiązanie prawidłowej pozycji mapowania odczytów sekwencjonowania do właściwego genomu jest bioinformatyczne trudne2,8. Oczyszczanie genomów organelli z genomu jądrowego jest jedną ze strategii zmniejszania tych problemów. Dalsze strategie bioinformatyczne mogą być wykorzystane do oddzielenia odczytów, które mapują regiony homologii między mitochondriami a chloroplastami.

Chociaż genomy organelli wielu gatunków roślin zostały zsekwencjonowane, niewiele wiadomo o różnorodności genomów organellarów dostępnych w dzikich populacjach lub w hodowlanych basenach. Genomy organellarne są również znane jako dynamiczne cząsteczki, które ulegają znacznej rearanżacji strukturalnej w wyniku rekombinacji między powtarzającymi się sekwencjami9. Co więcej, wiele kopii genomu organellarnego jest zawartych w każdej organelli, a wiele organelli jest zawartych w każdej komórce. Nie wszystkie kopie tych genomów są identyczne, co jest znane jako heteroplazmia. W przeciwieństwie do kanonicznego obrazu "kręgów głównych", obecnie istnieje coraz więcej dowodów na bardziej złożony obraz struktur genomu organellarnego, w tym okręgów subgenomowych, chromosomów liniowych, konkatamerów liniowych i struktur rozgałęzionych10. Składanie genomów organelli roślinnych jest dodatkowo skomplikowane ze względu na ich stosunkowo duże rozmiary oraz znaczne odwrócone i bezpośrednie powtórzenia.

Tradycyjne protokoły izolacji organellarów, oczyszczania DNA i późniejszego sekwencjonowania genomu są często kłopotliwe i wymagają dużych ilości pobranych tkanek, przy czym jako punkt wyjścia niezbędne jest pobranie od kilku gramów do ponad setek gramów młodej tkanki liścia11,12,13,14,15,16,17. To sprawia, że sekwencjonowanie genomu organellarnego jest niedostępne, gdy tkanka jest ograniczona. W niektórych sytuacjach ilość nasion jest ograniczona, na przykład gdy konieczne jest sekwencjonowanie na podstawie pokolenia lub w męskich sterylnych liniach, które muszą być utrzymywane poprzez krzyżowanie. W takich sytuacjach organellarne DNA można oczyścić, a następnie poddać amplifikacji całego genomu. Jednak amplifikacja całego genomu może wprowadzać znaczne odchylenie sekwencjonowania, co jest szczególnym problemem przy ocenie zmienności strukturalnej, struktur subgenomowych i poziomów heteroplazmii18. Ostatnie postępy w przygotowaniu bibliotek do technologii sekwencjonowania krótkiego odczytu pozwoliły przezwyciężyć bariery związane z niskimi nakładami wejściowymi, aby uniknąć amplifikacji całego genomu. Na przykład zestaw do przygotowania biblioteki Illumina Nextera XT pozwala na użycie zaledwie 1 ng DNA jako input19. Jednak przygotowanie biblioteki standardowej do zastosowań sekwencjonowania z długim odczytem, takich jak technologie sekwencjonowania PacBio lub Oxford Nanopore, nadal wymaga stosunkowo dużej ilości wejściowego DNA, co może stanowić wyzwanie dla sekwencjonowania genomu organellarów. Ostatnio opracowano nowe protokoły sekwencjonowania z długim odczytem, opracowane przez użytkowników, aby zmniejszyć ilość danych wejściowych i ułatwić sekwencjonowanie genomu w próbkach, w których uzyskanie mikrogramowych ilości DNA jest trudne20,21. Jednak uzyskanie czystych frakcji organellarów o wysokiej masie cząsteczkowej, które zostaną wprowadzone do tych preparatów bibliotecznych, pozostaje wyzwaniem.

Staraliśmy się porównać i zoptymalizować metody wzbogacania i izolacji organellarów DNA odpowiednie dla NGS bez potrzeby amplifikacji całego genomu. W szczególności naszym celem było określenie najlepszych praktyk w celu wzbogacenia organellarnego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z ograniczonych materiałów wyjściowych, takich jak podpróbka liścia. W niniejszej pracy przedstawiono analizę porównawczą metod wzbogacania DNA organellarów: (1) zmodyfikowany, tradycyjny protokół wirowania różnicowego kontra (2) protokół frakcjonowania DNA oparty na zastosowaniu komercyjnie dostępnego podejścia pulldown białka domeny wiążącej DNA CpG-metyl22 zastosowanego do tkanki roślinnej23. Zalecamy najlepsze praktyki izolacji organellarnego DNA z tkanki liści pszenicy, które można łatwo rozszerzyć na inne rośliny i typy tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie materiałów roślinnych do izolacji organelli i ekstrakcji DNA

  1. Standardowy wzrost sadzonek pszenicy
    1. Posadź nasiona w wermikulicie w małych, kwadratowych doniczkach po 4 - 6 nasion w rogu. Przenieść do szklarni lub komory wzrostowej z 16-godzinnym cyklem świetlnym, 23 ºC w dzień/18 ºC w nocy.
    2. Podlewaj rośliny każdego dnia. Rośliny nawozić 1/4 łyżeczki granulowanego nawozu 20-20-20 N-P-K po wykiełkowaniu i po 7 dniach od wykiełkowania.
  2. Alternatywna etiolacja siewek pszenicy
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 1.1, ale umieść doniczki w ciemnej komorze wzrostowej, 23 °C przez 16 godzin / 18 ºC przez 8 godzin. Alternatywnie, przykryj rośliny w szklarni (np. pojemnikiem do przechowywania; jednak należy zachować odpowiednią wentylację).
  3. Wzrost i pobieranie tkanek
    1. Uprawiaj rośliny przez 12 - 14 dni. W przypadku większości genotypów pszenicy 75 - 100 siewek daje około 10 - 12 g tkanki, co wystarcza do dwóch ekstrakcji organellarów metodą wirowania różnicowego (sekcja 2); tylko jedna roślina jest potrzebna, jeśli wykorzystuje się podejście pulldown oparte na metylacji DNA CpG do frakcjonowania organelli z jądrowego DNA (sekcja 3).
    2. W przypadku stosowania metody wirowania różnicowego należy pobrać świeże tkanki i natychmiast przystąpić do przetwarzania próbek, jak opisano w sekcji 2.
    3. W przypadku stosowania metody CpG-methyl pulldown, należy pobrać 20 mg skrawków młodej tkanki liścia do probówek do mikrowirówek (należy użyć tkanki standardowej lub etiolowanej, patrz reprezentatywne wyniki). Błyskawiczne zamrażanie na ciekłym azocie i zamrażanie w temperaturze -80 ºC do czasu użycia. Przejdź do frakcjonowania DNA metodą pulldown, jak opisano w sekcji 3.

2. Metoda #1: Ekstrakcja DNA za pomocą wirowania różnicowego (DC)

UWAGA: Protokół wirowania różnicowego został zmodyfikowany na podstawie dwóch publikacji, które optymalizowały warunki do izolacji obu organelli, ale wzbogacały o mitochondria17,24. Powstały w ten sposób protokół jest mniej czasochłonny i wykorzystuje mniej toksycznych chemikaliów niż poprzednie metody. W szczególności dokonaliśmy modyfikacji i etapów mycia, w tym dodaliśmy poliwinylopirolidon (PVP) do buforu ekstrakcyjnego STE i wyeliminowaliśmy końcowy etap płukania w buforze NETF, który zawiera fluorek sodu (NaF).

Uwaga: Przygotowanie i użycie buforu STE powinno odbywać się pod wyciągiem chemicznym z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej, ponieważ ten bufor zawiera 2-merkaptoetanol (BME).

  1. Rzeczy do zrobienia przed rozpoczęciem
    1. Upewnij się, że wszystkie urządzenia są wyjątkowo czyste i sterylizuj w autoklawie wszelkie urządzenia, które można sterylizować w autoklawie (np. cylindry mielące, probówki wirówkowe o dużej prędkości itp.).
      UWAGA: Końcówki filtrujące są zalecane do wszystkich etapów wymagających pipetowania, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    2. Zapoznaj się z listą wymaganego sprzętu i odczynników oraz przygotuj wymagane i zapasy robocze dla Metody #1 (Tabela 1). Schłodzić kriogeniczne bloki mielące do temperatury -20 °C, a wirniki i do 4 °C, ustawić mikrowirówkę na 4 °C i włączyć łaźnię wodną o temperaturze 37 °C.
  2. Izolacja organelli
    1. Zebrać 5 g świeżej tkanki i opłukać ją w zimnej, sterylnej wodzie w schłodzonej zlewce na lodzie.
      UWAGA: Próbki należy zawsze przechowywać na lodzie podczas wszystkich operacji i transportu do i z wirówek, dygestoriów itp. Alternatywnie, pracuj w chłodni, jeśli jest dostęp do wystarczającej ilości miejsca i sprzętu do przeprowadzenia protokołu.
    2. Za pomocą nożyczek pokrój tkankę liściową na ~1-centymetrowe kawałki bezpośrednio do probówki o pojemności 50 ml zawierającej dwa ceramiczne cylindry mielące.
      UWAGA: Wyczyść lub zmień nożyczki między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    3. Jeśli nie ma homogenizatora tkankowego, użyj moździerza i tłuczka, a następnie wykonaj czynności opisane w krokach 2.2.4 - 2.2.9.
      1. Pokrój tkankę liścia w schłodzony moździerz na lodzie. Mieleć próbki przez 2 - 3 minuty w 15 ml STE (w dygestorium).
      2. Wylej bufor (pozostaw tkankę w moździerzu) przez lejek zawierający jedną warstwę wstępnie zwilżonej, sterylnej tkaniny filtracyjnej (wielkość porów od ~ 22 do 25 μm; szczegóły w głównym protokole) do innej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj dodatkowe 10 ml STE do moździerza i tłuczka, a następnie ponownie homogenizuj.
      3. Wlać homogenizowaną tkankę i bufor do tego samego lejka. Opłucz moździerz i tłuczek 10 ml STE i wlej do lejka. Wyciśnij i wykręć tkaninę filtracyjną do lejka, aby odzyskać jak najwięcej płynu.
        UWAGA: Zmieniaj rękawice między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Kontynuuj postępowanie z protokołem opisanym w kroku 2.2.10.
    4. Dodać 20 ml STE (w dygestorium) do każdej probówki o pojemności 50 ml.
    5. Umieścić próbki we wstępnie schłodzonych kriogenicznych blokach mielących w aparacie do mielenia tkanek i mielić próbki przez 2 x 30 s z prędkością 1 750 obr./min. Obróć pozycje próbki i umieść próbki na lodzie na ~1 minutę między mieleniem.
      UWAGA: Na tym etapie można użyć moździerza i tłuczka, blendera lub innego urządzenia do mielenia/homogenizowania tkanek. Jednak każda metoda będzie miała wpływ na uzyskaną jakość DNA w różnym stopniu, dlatego długość i jakość DNA powinny być oceniane przed kontynuowaniem dalszych zastosowań.
    6. Włóż lejek do czystej probówki o pojemności 50 ml umieszczonej w lodzie. Umieść jedną warstwę tkaniny filtracyjnej w lejku i wstępnie zwilż ją 5 ml STE. Nie wyrzucaj przepływu.
    7. Wlej homogenizowaną tkankę do lejka. Opłucz probówkę do mielenia 15 ml STE, ponownie zamknij i odwróć probówkę, aby przepłukać ścianki i pokrywkę, a następnie wlej do lejka.
    8. Ostrożnie usuń kamienie ceramiczne, a następnie ściśnij i wykręć ściereczkę filtracyjną do lejka.
      UWAGA: Zmieniaj rękawice między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    9. Owiń nakrętki tubek parafilmem, aby uniknąć rozlania. Wirować przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej (unikać naruszania osadu) i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml o pojemności 50 ml (jeśli probówki nie mają szczelnych uszczelek, owinąć nakrętki probówki parafilmem, aby uniknąć rozlania). Wyrzuć granulki.
    11. Zrównoważyć probówki z dokładnością do 0,1 g za pomocą STE i odwirować otrzymany supernatant przez 20 minut w temperaturze 18 000 x g i 4 °C. Aby zrównoważyć probówki, umieść małą zlewkę z lodem na wadze, wytaruj wagę i zważ próbki na lodzie, aby były zimne. Alternatywnie użyj wagi i dygestorium w chłodni.
    12. Odrzucić supernatant. Dodaj 1 ml ST do granulki i delikatnie zawiesić ponownie za pomocą miękkiego pędzla. Dodać 24 ml ST (końcowa objętość 25 ml) i wymieszać/zawirować (tj. nacisnąć pędzel z boku tubki, aby usunąć cały płyn).
    13. Zrównoważyć probówki z dokładnością do 0,1 g za pomocą wirówki ST. przez 20 minut w temperaturze 18 000 x g i 4 ºC. W międzyczasie przygotuj roztwór DNaseI (patrz Tabela 1, aby zapoznać się z recepturami roztworów podstawowych i roboczych). Dla każdej próbki należy pobrać jedną podwielokrotność o objętości 200 μl w probówce o pojemności 1,5 ml.
    14. Odrzucić supernatant, osuszyć probówkę i ponownie zawiesić osad (nadal w probówce wirówki o dużej prędkości) w 300 μl ST za pomocą miękkiego pędzla. Umieść pędzel w przygotowanej wcześniej 1,5 ml probówce zawierającej 200 μl roztworu DNaseI i zakręć pędzlem, aby usunąć resztki osadów utkniętych w pędzlu. Odpipetować roztwór DNaseI z powrotem do probówki wirówki o dużej prędkości i delikatnie zamieszać, aby wymieszać.
    15. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w łaźni wodnej (owinąć parafilm wokół górnej części probówki, aby zapobiec przedostawaniu się kondensatu do nasadki). Delikatnie wymieszaj, mieszając 2 razy podczas inkubacji.
    16. Delikatnie odpipetować mieszaninę granulek z probówki za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem i umieścić ją w probówce o pojemności 1,5 ml o niskim stopniu wiązania. Dodaj 500 μl 400 mM EDTA, pH 8,0 do probówki wirówki o wysokiej prędkości i delikatnie pipetować, aby usunąć cały pozostały osad z probówki. Przenieś EDTA do tej samej 1,5 ml probówki o niskim stopniu wiązania, co mieszanina granulek i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.
    17. Wirować przy 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, osuszyć probówkę i użyć natychmiast do izolacji DNA. W razie potrzeby zamrozić granulki w temperaturze -20 ºC, ale może to spowodować zmniejszenie wydajności, ponieważ resztki DNazy I mogą degradować DNA próbki, jeśli nie zostaną natychmiast przetworzone.
  3. Ekstrakcja DNA z wyizolowanych organelli przy użyciu komercyjnego podejścia opartego na kolumnach
    UWAGA: Pełny protokół znajduje się w podręczniku zestawu25, a poniżej znajdują się modyfikacje. Preferowane jest bezpośrednie przejście od izolacji organelli do ekstrakcji DNA. Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie zmniejszy rozmiary fragmentów DNA i doprowadzi do degradacji DNA przez resztkowe DNazy. Ogranicz wirowanie lub energiczne pipetowanie, ponieważ może to spowodować ścinanie DNA. Zaleca się stosowanie probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania, aby zmaksymalizować odzysk DNA.
    1. Procedura ekstrakcji DNA
      UWAGA: Przeczytaj szczegółowy protokół handlowy25 przed rozpoczęciem, aby upewnić się, że są prawidłowo wykonane/przechowywane i że procedury obracania kolumn są zrozumiałe.
      1. Dodaj 180 μl buforu ATL bezpośrednio do probówki z granulkami (rozmrożonymi, jeśli wcześniej zamrożonymi i zrównoważonymi do temperatury pokojowej na blacie).
      2. Postępuj zgodnie z krokiem 3 w protokole "Oczyszczanie DNA z tkanek" w podręczniku zestawu, z następującymi modyfikacjami: 30-minutowa liza w kroku 3, uwzględnij opcjonalne trawienie RNazy A i eluuj w 3 x 200 μl AE (każdy do osobnej probówki, a następnie połącz elutiony).
      3. Zachowaj podwielokrotność (co najmniej 20 μl) do qPCR (patrz krok 4.1). Aby określić ilościowo przed zagęszczeniem, zaoszczędź dodatkowy 1 μl na określenie ilościowe o wysokiej czułości.
      4. W razie potrzeby należy przystąpić do zatężania próbki.
  4. Zagęszczenie próbki za pomocą komercyjnych jednostek filtrujących
    UWAGA: Zobacz komercyjny protocol26, aby uzyskać więcej informacji. W zależności od dalszego zastosowania może nie być konieczne przeprowadzanie zatężania próbki (np. w przypadku zastosowań PCR i qPCR w punkcie końcowym). Jednak do budowy biblioteki NGS prawdopodobnie konieczne będzie zagęszczenie rozcieńczonego organellarnego DNA uzyskanego po ekstrakcji DNA.
    1. Procedura kolumny stężeniowej
      1. Ostrożnie zważ wstępnie (patrz Tabela 2) pustą jednostkę filtrującą (bez rurki) na czystym kawałku papieru wagowego na cyfrowej wadze analitycznej. Zapisz wagę.
      2. Odpipetować połączone eluity do jednostki filtrującej i ponownie ostrożnie zważyć.
        UWAGA: Podręcznik handlowy26 mówi, że maksymalna objętość jednostki filtrującej wynosi 500 μL, ale można dodać do niej do 575 μL jednorazowo bez przepełnienia.
      3. Ostrożnie umieść napełnioną jednostkę filtrującą w rurce (dostarczonej z kolumnami). Wirować przy 500 x g przez żądany czas, aby osiągnąć wymaganą objętość koncentratu. W przypadku próbki o objętości ~575 μl, 20-minutowe wirowanie zwykle daje objętość koncentratu 15 - 30 μl.
      4. Wyjmij jednostkę filtrującą z rurki i zważ ponownie. Skorzystaj z tabeli, aby określić, czy osiągnięto żądaną objętość koncentratu. Jeśli nie, należy ponownie odwirować przy 500 x g przez krótszy czas i ponownie zważyć; Powtarzaj tę czynność, aż do osiągnięcia żądanej objętości koncentratu.
      5. Umieść nową rurkę (dostarczoną z kolumnami) na górze jednostki filtrującej i odwróć. Wirować przez 3 minuty przy 1 000 x g, aby przenieść koncentrat do probówki.
      6. Określ odzyskany wolumin. Zwykle będzie to ~3 - 5 μL mniej niż obliczona objętość, ze względu na retencję filtra. W przypadku nadmiernego stężenia rozcieńczyć sterylną wodą lub TE, aby osiągnąć pożądaną objętość.
      7. Określ ilościowo DNA za pomocą kwantyfikacji o wysokiej czułości (zgodnie z instrukcjami producenta).

3. Metoda #2: Frakcjonowanie metylu (MF) w celu wzbogacenia DNA na organellar z całkowitego genomowego DNA

UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany na podstawie opracowanego przez użytkownika protokołu ekstrakcji DNA dla roślin i grzybów Genomic Tip Kit27 oraz komercyjnego protokołu Microbiome DNA Enrichment Kit28. Teoretycznie każdy protokół izolacji DNA, który daje DNA o dużej masie cząsteczkowej, może być użyty do ściągania. W przypadku sekwencjonowania z krótkim odczytem każda ekstrakcja dająca głównie fragmenty o wielkości >15 kb jest odpowiednia do użycia w pulldown. W przypadku sekwencjonowania z długim odczytem pożądane mogą być większe fragmenty. Dlatego zoptymalizowaliśmy ten protokół, aby uzyskać DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.

  1. Izolacja całkowitego DNA
    UWAGA: Zapoznaj się z listą wymaganego sprzętu i odczynników oraz przygotuj wymagane i zapasy robocze dla Metody #2 (Tabela 1). Dodaj enzymy lizujące do zapasu bufora do lizy, aby uzyskać roztwór roboczy buforu do lizy. Włączyć termomikser i ustawić go na 37 °C. Włączyć łaźnię wodną do 50 °C i umieścić bufor QF w kąpieli. Umieścić 70% EtOH w zamrażarce i ustawić mikrowirówkę na 4 °C.
    1. Całkowita ekstrakcja DNA przy użyciu komercyjnych kolumn do ekstrakcji DNA
      UWAGA: Przed rozpoczęciem przeczytaj komercyjny podręcznik29, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat korzystania z kolumn anionowymiennych grawitacyjno-przepływowych. Kolumny można ustawić za pomocą specjalistycznego stojaka lub umieścić nad rurami za pomocą dołączonych plastikowych pierścieni. Wszystkie etapy, w tym końcówki genomu, powinny mieć możliwość przebiegu przez przepływ grawitacyjny, a resztki cieczy NIE powinny być przepychane.
      1. Zmiel 20 mg zamrożonej tkanki w ciekłym azocie w probówce o niskim poziomie wiązania o pojemności 2 ml za pomocą ręcznych tłuczków do mielenia przeznaczonych do probówek o pojemności 2 ml.
      2. Dodaj 2 ml roztworu roboczego buforu do lizy (probówki będą bardzo pełne).
      3. Inkubować w termomieszalniku w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem przy 300 obr./min. Jeśli termomikser nie jest dostępny, odpowiednią alternatywą jest inkubacja na bloku grzewczym i mieszanie przez delikatne trzeganie co 15 minut.
      4. Dodać 4 μl RNazy A (100 mg/ml, końcowe stężenie 200 μg/ml). Odwrócić do mieszania i inkubować w termomikserze przez 30 minut w temperaturze 37 °C, z delikatnym mieszaniem przy 300 obr./min.
      5. Dodać 80 μl proteinazy K (20 mg/ml, końcowe stężenie 0,8 mg/ml), odwrócić do wymieszania i inkubować w termomikserze przez 2 godziny w temperaturze 50 °C, delikatnie mieszając przy 300 obr./min.
      6. Wirować przez 20 minut w temperaturze 4 °C i 15 000 x g w celu osadzenia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.
      7. Podczas wirowania próbek należy zrównoważyć kolumny z 1 ml buforu QBT i pozwolić kolumnie opróżnić się przez przepływ grawitacyjny.
      8. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze należy niezwłocznie nałożyć próbkę (unikać osadu) do wyrównanej kolumny i pozwolić jej w pełni przepłynąć przez kolumnę. Jeśli próbka stanie się mętna, przefiltruj lub odwiruj ponownie przed nałożeniem na kolumnę (szczegółowe informacje można znaleźć w podręczniku handlowym29).
      9. Gdy próbka całkowicie dostanie się do żywicy, przemyć kolumnę 4 x 1 ml buforu QC.
      10. Zawiesić kolumnę na czystej, 2 ml probówce do mikrowirówek o niskiej wiązalności. Eluować genomowe DNA za pomocą 0,8 ml buforu QF podgrzanego w temperaturze 50 °C.
      11. Wytrącić DNA, dodając 0,56 ml (0,7 objętości buforu elucyjnego) izopropanolu o temperaturze pokojowej do eluowanego DNA.
      12. Wymieszać przez odwrócenie (10X) i natychmiast odwirować przez 20 minut w temperaturze 15 000 x g i temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając szklistego, luźno przymocowanego osadu.
      13. Umyj odwirowany osad DNA 1 ml zimnego 70% etanolu. Wirować przez 10 minut przy 15 000 x g i temperaturze 4 °C.
      14. Ostrożnie usunąć supernatant (należy zachować ostrożność również na tym etapie), nie naruszając osadu. Suszyć na powietrzu przez 5-10 minut i ponownie zawiesić DNA w 0,1 ml buforu elucyjnego (EB). Rozpuść DNA przez noc w temperaturze pokojowej. Należy unikać pipetowania, które może spowodować ścinanie DNA.
      15. Określ ilościowo próbki za pomocą testu kwantyfikacyjnego DNA o wysokiej czułości (zgodnie z instrukcjami producenta).
  2. Frakcjonowanie metylowanego i niemetylowanego DNA
    na podstawie kulek UWAGA: Niedawna publikacja wykazała użycie dostępnego na rynku zestawu kit28, który wykorzystuje podejście pulldown wykorzystujące specyficzne dla CpG białko domeny wiążącej metyl połączone z ludzkim fragmentem IgG Fc (białko MBD2-Fc) do frakcjonowania genomów organelli roślinnych (niemetylowanych) z genomu jądrowego (wysoce metylowanego) zawartości23. Skuteczność frakcjonowania w próbkach pszenicy nie była wcześniej testowana przy użyciu tego komercyjnego zestawu MF kit28.
    1. Rzeczy do zrobienia przed rozpoczęciem
      1. Świeżo przygotować 80% etanolu (co najmniej 800 μl na reakcję). Ustawić 5x bufor do wiązania/płukania do rozmrożenia na lodzie i przygotować 5 ml 1x buforu na próbkę (rozcieńczyć 5X bufor sterylną, wolną od nukleaz wodą i trzymać na lodzie podczas protokołu).
    2. Przygotuj kulki magnetyczne związane z białkiem MBD2-Fc
      1. Przygotuj wymaganą liczbę zestawów koralików. Skaluj reakcje, aby użyć od 1 do 2 μg całkowitego wejściowego DNA, wymagając 160 - 320 μl kulek. Należy pamiętać, że wymienione poniżej reakcje dotyczą 1 μg całkowitego wejściowego DNA, więc wymagają 160 μl kulek. Skaluj reakcje w zależności od potrzeb.
      2. Używając końcówek o szerokim otworze, delikatnie pipetuj zawiesinę kulki magnetycznej Protein A w górę iw dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Alternatywnie, delikatnie obracaj rurkę z koralikami przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: Nie obracaj koralików.
      3. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta28.
    3. Wychwytywanie metylowanego jądrowego DNA
      1. Dla każdej pojedynczej próbki dodać 1 μg wejściowego DNA do probówki zawierającej 160 μl kulek magnetycznych związanych z MBD2-Fc.
      2. Dodać 5x bufor wiążący/przemłukujący, jeśli jest to właściwe, biorąc pod uwagę objętość próbki wejściowej DNA dla końcowego stężenia 1x (objętość 5x buforu wiążącego/płuczącego w celu dodania (μL) = objętość wejściowego DNA (μL)/4). Odpipetować próbkę kilka razy w górę i w dół, aby wymieszać za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze.
      3. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Delikatnie odpipetuj próbki za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze i przesuwaj próbki 2-3 razy przez cały okres inkubacji, aby zapobiec zbrylaniu się kulek.
        UWAGA: Pipetowanie i trzepanie ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia skutecznego ściągania metylowanego DNA.
    4. Zbierz wzbogacone, niemetylowane DNA organeleczalne
      1. Krótko obróć probówkę zawierającą mieszaninę kulek magnetycznych związanych z DNA i MBD2-Fc. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na co najmniej 5 minut, aby zebrać koraliki z boku tuby. Rozwiązanie powinno wydawać się jasne.
      2. Używając końcówek o szerokim otworze, ostrożnie usunąć oczyszczony supernatant, nie naruszając kulek. Przenieść supernatant (zawiera niemetylowane, wzbogacone organellarami DNA) do czystej, słabo wiążącej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Przechowywać tę próbkę w temperaturze -20 lub -80 °C lub przejść bezpośrednio do kroku 3.2.6 w celu oczyszczenia.
    5. Elute przechwycił jądrowe DNA z kulek magnetycznych związanych z MBD2-Fc
      1. Jeśli frakcja jądrowa jest również pożądana, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta28, aby wymyć jądrowe DNA z kulek magnetycznych związanych z MBD2-Fc; oczyść zgodnie z opisem w kroku 3.2.7.
    6. Oczyszczanie kwasów nukleinowych na bazie kulek
      1. Upewnij się, że kulki oczyszczające mają temperaturę pokojową i są dokładnie wymieszane. Postępuj zgodnie z protokołem zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji zestawu MF manual28.
        UWAGA: Próbka może być teraz wykorzystana do budowy biblioteki NGS lub innej dalszej analizy.

4. Kwantyfikacja próbki i kontrola jakości

  1. Test qPCR do oceny wzbogacenia organellar<br /> UWAGA: Wymienione tutaj parametry reakcji qPCR i testu zostały zaprojektowane do użytku na Roche LightCycler 480 i mogą wymagać dostosowania do różnych urządzeń i odczynników. Jeśli qPCR nie jest dostępny, jako jakościowy pomiar czystości próbki można zastosować PCR w punkcie końcowym i wizualizację na żelu agarozowym, stosując te same startery i warunki, które opisano tutaj. Rozmiary amplikonów wynoszą ~150 pz dla wszystkich zestawów starterów. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z sekwencjami starterów i parowaniami.
    1. Konfiguracja reakcji qPCR
      1. Aby uruchomić pojedynczą reakcję qPCR o pojemności 20 μL, należy ostrożnie odpipetować następujące składniki do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce qPCR: 10 μL 2x SYBR Green I Master; 2 μL 10 μM mieszanki startera do przodu i do tyłu (dla końcowego stężenia 0,5 μM); 2 μL matrycy (w zakresie krzywej wzorcowej); i 6 μL sterylnego, wolne od nukleazH2O. Aby zmniejszyć liczbę błędów pipetowania, zaleca się przygotowanie mieszanki wzorcowej ze wszystkimi składnikami reakcji z wyjątkiem matrycy. Dodaj mieszankę wzorcową do płytki qPCR, a następnie dodaj interesującą nas matrycę do każdej studzienki. Dla każdej próbki należy przeprowadzić trzy powtórzenia techniczne, aby zminimalizować skutki błędu pipetowania.
        UWAGA: Ostatecznie stosunek cykli kwantyfikacji jądrowej do organellarnej jest porównywany między próbkami, więc dopuszczalne są niewielkie różnice w stężeniu. Jednak stężenia DNA powinny mieścić się mniej więcej w zakresie od siebie.
      2. Uszczelnij płytkę wysokiej jakości folią uszczelniającą qPCR. Delikatnie zwiruj próbki, uważając, aby nie powstały żadne pęcherzyki. Krótko obracać płytkę w dół przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu zebrania próbki i usunięcia wszelkich małych pęcherzyków.
      3. Załaduj płytę do maszyny. Uruchom program qPCR zgodnie z poniższymi wskazówkami.
    2. Parametry reakcji qPCR
      UWAGA: Są to parametry domyślne, z wyjątkiem cyklu wyżarzania na etapie amplifikacji. Dostosuj to ustawienie, aby dostosować je do określonych starterów, jeśli te używane różnią się od starterów przedstawionych w tym protokole.
      1. Wstępną inkubację w temperaturze 95 °C przez 5 minut, z szybkością narastania 4,4 °C/s.
      2. Wykonać 45 cykli amplifikacji w (1) 95 °C przez 10 s, z szybkością narastania 4,4 °C/s; (2) 60 °C przez 20 s, z szybkością narastania 2,2 °C/s; oraz (3) 72 °C przez 10 s, z szybkością narastania 4,4 °C/s (dane uzyskane podczas (3)).
      3. Stosować opcjonalny cykl krzywej topnienia 95 °C przez 5 s, z szybkością narastania 4,4 °C/s; 65 °C przez 1 minutę, z szybkością narastania 2,2 °C/s; i 97 °C, z trybem ciągłej akwizycji.
      4. Stosować cykl chłodzenia w temperaturze 40 °C przez 30 s, z szybkością narastania 1,5 °C/s.
    3. Parametry testu
      1. Wybierz szablon SYBR. Sprawdź parametry programu w przycisku Eksperyment. Po załadowaniu płytki można rozpocząć test, a ustawienia można dostosować w trakcie trwania testu.
      2. Przypisywanie próbek za pomocą edytora próbek. Wybierz Abs Quant jako przepływ pracy i oznacz próbki jako nieznane, wzorcowe lub kontrole ujemne. Oznaczyć powtórzenia i wypełnić nazwy próbek pierwszego z każdej kontrpróby. Dodaj stężenia i jednostki do norm.
      3. Umożliwia skonfigurowanie podzbiorów do analizy, które są przypisywane w edytorze podzbiorów.
      4. Do analizy wybierz Abs Quant/2nd Derivative Max z listy "utwórz nową analizę". Zaimportuj zewnętrznie zapisaną krzywą standardową (jeśli dotyczy), a następnie naciśnij przycisk Oblicz; Raport będzie zawierał wybrane informacje.
      5. Aby przeprowadzić dokładną bezwzględną kwantyfikację w celu określenia liczby kopii lub stężenia, należy użyć krzywej wzorcowej, która jest reprezentatywna dla badanej próbki (np. organellarne DNA wyizolowane z powyższych metod). Ponieważ ilość mitochondrialnego DNA wymagana do przygotowania standardowej krzywej jest zbyt duża, aby można ją było osiągnąć przy użyciu rozsądnej ilości tkanki, nie należy wykorzystywać obliczeń liczby kopii dostarczonych przez oprogramowanie, ale zamiast tego zbadać wartości punktu przecięcia (Cp) w celu określenia względnego wzbogacenia organelli w porównaniu z jądrowym DNA w próbkach. Porównaj te względne ilości z całkowitymi wartościami genomowego DNA (patrz Reprezentatywne wyniki). Przetestuj wydajność startera na pięciu rozcieńczeniach 1:10 całkowitego genomowego DNA z w pełni jasnych, dwutygodniowych siewek pszenicy (reprezentatywne wydajności podane w legendzie Rysunek 2).
  2. Elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym (PFGE)
    UWAGA: Ten protokół jest oparty na wytycznych producenta dotyczących wykonywania PFGE w celu rozwiązania DNA o dużej masie cząsteczkowej. Zobacz tabelę materiałów.
    1. Przygotowanie żelu i próbek
      1. Postępuj zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi przygotowania żelu i próbki i dostosuj je do dostępnego systemu.
    2. Uruchamianie parametrów
      1. Postępuj zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi konfiguracji systemu elektroforezy i użyj następujących parametrów: początkowy czas przełączania 2 s, końcowy czas przełączania 13 s, czas pracy 15 godzin i 16 minut, V/cm 6 i kąt rozwarcia 120°.
    3. Plama i obraz żelu
      1. Wybarwić żel wybranym barwnikiem (np. bromkiem etydyny lub odpowiednią alternatywą) i zobrazować za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji żelu.
  3. NGS i analiza
    1. Użyj 1 ng DNA jako danych wejściowych dla zestawu do przygotowania biblioteki DNA, zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Kod kreskowy i połącz próbki do sekwencjonowania w jednym przebiegu. Wykonaj sekwencjonowanie zgodnie z wytycznymi producenta.
      UWAGA: Parametry łączenia i sekwencjonowania mogą ulec zmianie w zależności od interesującego gatunku, pożądanego poziomu pokrycia i platformy używanej do sekwencjonowania bibliotek. Na przykład linia HiSeq ma znacznie większą moc wyjściową niż linia MiSeq, więc można multipleksować o wiele więcej próbek. Sekwencjonowanie mniejszego podzbioru próbek w celu określenia, czy poziomy pokrycia genomów organelli są odpowiednie do dalszej analizy.
    3. Sprawdź jakość odczytu za pomocą FastQC31, aby określić zakres przycinania i filtrowania wymagany dla danych.
    4. Przytnij i przefiltruj surowe odczyty za pomocą Trimmomatic32 lub innego porównywalnego programu. Użyj następujących ustawień: ILLUMINACLIP 2:30:10 (aby usunąć adaptery), LEADING 3, TRAILING 3, SLIDINGWINDOW 4:10 i MINLEN 100.
    5. Mapuj odczyty parowanych końców filtrowanych pod kątem jakości i przycinanych adapterem (PE) na mitochondria chińskiej wiosny (sekwencja referencyjna NCBI NC_007579.133), chloroplast (sekwencja referencyjna NCBI NC_002762.134) i nuclear35 genomy referencyjne przy użyciu Bowtie236, z następującymi ustawieniami: -I 0 -X 800 --sensitive.
    6. Przekonwertuj pliki wyrównania sam na format bam (samtools) i posortuj pliki bam. Użyj plików bam, aby obliczyć pokrycie całego genomu i pokrycie na bazę za pomocą narzędzi bedtools. Wizualizuj wyniki za pomocą funkcji R-plot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły przedstawione w tym manuskrypcie opisują dwie różne metody wzbogacania organellarnego DNA z tkanki roślinnej. Przedstawione tutaj warunki odzwierciedlają optymalizację dla tkanki pszenicy. Porównanie kluczowych etapów w protokołach, wymaganego wkładu tkankowego i wyjścia DNA opisano w Rysunek 1. Kroki testowanego przez nas protokołu DC przebiegają w warunkach podobnych do opisanych wcześniej (Rysunek 1A). Pobrana tkanka musi być przetworzo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory większość badań nad sekwencjonowaniem organelli koncentruje się na tradycyjnych metodach DC w celu wzbogacenia o określone DNA. Opisano metody izolowania organelli z różnych roślin, w tym mchu40; rośliny jednoliścienne, takie jak pszenica15 i owies11; oraz rośliny dwuliścienne, takie jak rzodkiewnikpospolity (Arabidopsi) 11, słonecznik(17) i rzepak(14). Większość prot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach handlowych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za finansowanie od Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych - Służby Badań Rolniczych oraz od Narodowej Fundacji Nauki (IOS 1025881 i IOS 1361554). Dziękujemy firmie R. Caspers za utrzymanie szklarni i pielęgnację roślin. Dziękujemy również Centrum Genomiki Uniwersytetu Minnesoty, gdzie przeprowadzono przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki Illumina. Jesteśmy również wdzięczni za komentarze redaktorów czasopisma i czterech anonimowych recenzentów, które jeszcze bardziej wzmocniły nasz manuskrypt. Dziękujemy również OECD za stypendium dla SK w celu zintegrowania tych protokołów we wspólnych projektach z kolegami z Japonii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol (beta-merkaptoetanol; BME)Sigma AldrichM3148-100ml
2-propanol (alkohol izopropylowy/izopropanol), bioodczynnikSigma AldrichI9516
agaroza, Bio-Rad Cetified Megabase agarozaBio-Rad1613108
waga analitycznaMettlerToledo AB54-S
Mettler ToledoPB1502-S
surowica bydlęca albumina (BSA)Sigma AldrichB4287-25G
Ceramiczne cylindry mielące, 3/8 cala x 7/8 calaSPEX SamplePrep2183
Bloki kriogeniczne kompatybilne z homogenizatorem tkankowym do przechowywania probówek 50 mlSPEX SamplePrep2664
DNaseISigmaDN25
etanol, absolutnyDecon Laboratories2716
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,5 M roztwór, pH 8,0FisherBP2482-500
system obrazowania
żelu barwnik żelowyTaki jak GelRed lub Ethidium
Bromek Tłuczek do mielenia, szeroka końcówka do probówek
Guanidyna-HCl, roztwór 8 MThermoFisher24115
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
ciekły azot
Enzymy lizujące z Trichoderma harzianumSigmaL1412
Chlorek magnezuG Bioscience24115
stojak magnetycznyTermoFisherA13346
probówki do mikrowirówek, LoBind 1,5 mL Eppendorf22431021
, standardowe 1,5 ml bez nukleazMikrowirówka Eppendorf
, chłodzonaSorvall Legend X1RLub równoważny produkt, musi być w stanie osiągnąć co najmniej 18 000 x g z wirnikami do probówek 50 ml, probówek Oak Ridge i mikrowirówek 1,5 ml w
temperaturze pokojowejEppendorf5424lub równoważny produkt, musi być w stanie osiągnąć co najmniej 18 000 x g z rotorem dla probówek do mikrowirówek 1,5 ml i 2 ml
Microcon DNA Filtry odśrodkowe o szybkim przepływieEMD MilliporeMRCFOR100
Miracloth, 1 kwadrat na próbkę przycięty tak, aby pasował do lejkaEMD Millipore475855
NEBNext Zestaw do wzbogacania DNA mikrobiomu NewEngland BiolabsE2612L
parafilmParafilm MPM992
plastikowe doniczki i tace
poliwinylopirolidon (PVP)FisherBP431-100
Proteinaza KQiagen19131
Zestaw do elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (np. CHEF DR III)Bio-Rad1703697
kulki oczyszczające, koraliki Agencourt AMpureXPBeckman CoulterA63881
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304
Qiagen 20/g Zestaw do ekstrakcji DNA z końcówką genomicznąQiagen10223
Qiagen Buffer EB (bufor elucyjny)Qiagen19086
Zestaw do ekstrakcji DNA QiagenQiagen19060
QiaRackQiagen19015
qPCR maszyna (np. Roche Light Cycler 480)
qPCR4729757001
qPCR, płytka 96-dołkowaRoche4729692001
Kubit  probówkitestowe Life TechnologiesQ32856
Zestaw do oznaczania kubitów o szerokim spektrumLife TechnologiesQ32850
Zestaw do oznaczania kubitów o wysokiej czułościLife TechnologiesQ32851
RNazaAQiagen19101
Pipety serologiczne (20 ml) i pipetaFisher13-678-11
Małe lejki, 1 na próbkę
Chlorek soduAmbionAM9759
Miękki pędzel, 2 na próbkę
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder lub inny rodzaj homogenizatora tkankowegoSPEX SamplePrepLub inny porównywalny homogenizator tkankowy. Jeśli nie masz dostępu do homogenizatora tkankowego, wystarczy zmielić go w schłodzonym moździerzu i tłuczku (szczegóły w protokole). Jednak homogenizator zapewni bardziej spójne wyniki, a całkowity czas homogenizacji zostanie skrócony.
SacharozaOmnipure8550
TBE
termomikser
TrisSigmaT2819-100ml
Triton X-100PromegaH5142
probówki obrotowe
, 50 ml stożkowy polipropylenCorning352070
probówki z polipropylenu szybkotnącego 50 ml ThermoScientific/Nalgene3119-0050np. probówki Nalgene Oakridge lub równoważna
kąpieli
wermikulitowej
, sterylna i certyfikowana wolna od nukleaz Fisher1481
woda, sterylna milliQ
waga stożkowych 2 mlProbówki do mikrowirówek Folia uszczelniająca do płytek Roche Roche woda do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
  2. Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
  3. Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
  4. Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
  5. Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
  6. Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
  7. Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
  8. Wicke, S., Schneeweiss, G. M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. Hörandl, E., Appelhans, M. , Koeltz Scientific Books. (2015).
  9. Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
  10. Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
  11. Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
  12. Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
  13. Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
  14. Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291(2014).
  15. Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
  16. Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
  17. Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
  18. Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
  19. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
  20. Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
  21. Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948(2016).
  22. Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096(2013).
  23. Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
  24. Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
  25. Qiagen. QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. , 5th ed, Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016).
  26. E.M. Corporation. User Guide: Microcon Centrifugal Filter Devices. , Available from: http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Microcon-DNA-Fast-Flow-Centrifugal-Filter-Unit-with-Ultracel-membrane,MM_NF-MRCF0R100 (2013).
  27. Qiagen. User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN). , Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001).
  28. New England BioLabs, Inc.. NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit: Instruction Manual Version 4.0. , Available from: http://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/371BCB5A557C462D95D1E45E15BBFEA3/Datacards or Manuals/E2612Manual.pdf (2015).
  29. Qiagen. QIAGEN Genomic DNA Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012).
  30. PacificBiosciences. Guidelines for Using the BIO-RAD® CHEF Mapper® XA Pulsed Field Electrophoresis System. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Unsupported-Guidelines-Using-BIO-RAD-CHEFMapper-XA-Pulsed-Field-Electrophoresis.pdf (2016).
  31. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2016).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  33. Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
  34. Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
  35. International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
  36. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  37. Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome? Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
  38. Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
  39. Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
  40. Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
  41. Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
  42. PacificBiosciences. Procedure & Checklist - 10 kb to 20 kb Template Preparation and Sequencing with Low (100 ng) Input DNA. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-10-20kb-Template-Preparation-and-Sequencing-with-Low-Input-DNA.pdf (2015).
  43. PacificBiosciences. Template Preparation and Sequencing Guide. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/Guide-Pacific-Biosciences-Template-Preparation-and-Sequencing.pdf (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Centryfugacja r nicowatechnika frakcjonowania metylowegotkanka li cia pszenicyizolacja organellimetody ekstrakcji DNAwzbogacanie frakcji mitochondri wwzbogacanie frakcji chloroplast wwyciszanie magnetyczne magnetic bead pulldown

Powiązane artykuły