In vitro Obrazowanie i kwantyfikacja skuteczności celowania w lek znakowanych fluorescencyjnie analogów GnRH

Summary

Selektywnie znakowane fluorescencyjne pochodne GnRH-I, -II i -III są niezawodnymi narzędziami do śledzenia i ilościowego określania ich absorpcji komórkowej. Niniejszy manuskrypt przedstawia eksperymenty mające na celu wizualizację, ilościowe określenie i porównanie efektywności wychwytu tych koniugatów GnRH w różnych liniach komórkowych.

Abstract

Analogi GnRH są skuteczne w zwalczaniu ugrupowań i są w stanie selektywnie dostarczać środki przeciwnowotworowe do złośliwych komórek nowotworowych, które wykazują wysoką ekspresję receptorów GnRH. Jednak analiza ilościowa wychwytu komórkowego przez analogi GnRH i badanych typów komórek w systemach dostarczania leków opartych na GnRH jest obecnie ograniczona. Wcześniej wprowadzone, selektywnie znakowane fluorescencyjne pochodne GnRH I, -II i -III zapewniają doskonałą wykrywalność i mają odpowiednie właściwości chemiczne do powtarzalnych i solidnych eksperymentów. Odkryliśmy również, że odpowiednie, aktualne metody z tymi znakowanymi analogami GnRH mogą dostarczyć nowych informacji na temat systemów dostarczania leków opartych na GnRH. Ten manuskrypt wprowadza kilka prostych i szybkich eksperymentów dotyczących wychwytu komórkowego [D-Lys⁶(FITC)]-GnRH-I, [D-Lys⁶(FITC)]-GnRH-II i [Lys⁸(FITC)]-GnRH-III na EBC-1 (płuco), BxPC-3 (trzustka) i na komórkach nowotworowych nowotworu złośliwego Detroit-562- (gardło). Równolegle z tymi koniugatami GnRH-FITC badano również poziom powierzchni komórek receptorów GnRH-I na tych liniach komórkowych przed i po leczeniu GnRH za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Wychwyt komórkowy koniugatów GnRH-FITC określono ilościowo za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. W eksperymentach tych zaobserwowano niewielkie różnice między analogami GnRH i duże różnice między typami komórek. Istotne różnice między liniami komórkowymi są skorelowane z ich wyraźnym poziomem receptorów GnRH-I na powierzchni komórki. Przedstawione eksperymenty zawierają praktyczne metody wizualizacji, ilościowego określania i porównywania efektywności wychwytu koniugatów GnRH-FITC w sposób zależny od czasu i stężenia na różnych przylegających kulturach komórkowych. Wyniki te mogą pozwolić przewidzieć skuteczność koniugatów GnRH w danej hodowli komórkowej i stanowić dobrą podstawę do dalszych eksperymentów w badaniu systemów dostarczania leków opartych na GnRH.

Introduction

Systemy celowanego dostarczania leków oparte na peptydach stały się szybko rozwijającym się i obiecującym obszarem terapii nowotworów w ciągu ostatnich kilku lat^1,2. Ludzki receptor hormonu uwalniającego gonadotropiny typu I (GnRH-I-R) znajduje się głównie w przysadce mózgowej, ale jest również obecny w kilku innych tkankach, które są odpowiedzialne za samoreprodukcję³. GnRH-I-R ulega również ekspresji w wielu tkankach nowotworowych, związanych lub niezwiązanych z układem rozrodczym^4,5. Wysoka ekspresja GnRH-I-R na kilku złośliwych komórkach nowotworowych w porównaniu ze zdrowymi tkankami daje możliwość terapii celowanej^5,6.

W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano wiele analogów hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH), które mogą być używane jako ugrupowania celujące^7,8,9. Peptydy te są w stanie dostarczać środki przeciwnowotworowe o wysokiej selektywności do złośliwych komórek nowotworowych, które nadmiernie eksprymują GnRH-I-R⁶. Zgłoszono kilka sprzężonych leków przeciwnowotworowych GnRH o wyższej selektywności i lepszej skuteczności niż odpowiadający im niesprzężony wolny lek^7,8,9.

Poprzednie publikacje na temat peptydów GnRH i ich receptorów informowały, że GnRH-I-R może przyjmować różne konformacje, które mają różną selektywność dla analogów GnRH¹⁰. Wysoce zmienny GnRH-I-R ma złożone i różne szlaki sygnałowe, które są obdarzone różną aktywnością w stosunku do swoich naturalnych i sztucznych ligandów¹¹. Fakty te sprawiają, że badanie systemów opartych na GnRH jest trudne. Z drugiej strony posiadają obiecujący potencjał terapeutyczny. Wcześniej zgłoszono kilka eksperymentów z radioznakowanymi peptydami GnRH ^12,13,14,15, ale eksperymenty, w których użyto fluorescencyjnie znakowanych analogów GnRH, są nadal ograniczone. Podczas gdy znakowanie radioaktywne zapewnia wysoką czułość, znakowanie fluorescencyjne ma kilka innych zalet, na przykład łatwiejszą obsługę i możliwość przeciwdziałania barwieniu za pomocą różnych fluoroforów. Trzy popularne analogi GnRH, które z powodzeniem zostały wykorzystane do dostarczania leków, to [D-Lys⁶]-GnRH-I, [D-Lys⁶]-GnRH-II i GnRH-III, ale skuteczność tych peptydów jako ugrupowań celujących jest rzadko porównywana^16,17. Z drugiej strony, wyniki oddzielnych eksperymentów, w których wykorzystano różne komórki nowotworowe i analogi GnRH, są zróżnicowane.

Na podstawie tych rozważań, skupiliśmy się na ukierunkowaniu tych peptydów GnRH na guz i potencjale dostarczania leków, a tym samym zsyntetyzowaliśmy i scharakteryzowaliśmy koniugat ⁶(FITC)]-GnRH-II i [Lys⁸(FITC)]-GnRH-III class="xref">18. Analogi te są selektywnie znakowane FITC w łańcuchu bocznym ich Lys lub D-Lys (stosunek peptyd-FITC 1:1 w każdym koniugacie). Pomysł polegał na tym, że selektywne znakowanie fluorescencyjne może dostarczyć nowych informacji na temat tych peptydów i umożliwić ich dobre śledzenie oraz wiarygodną ocenę ilościową. Koniugaty te charakteryzują się bezpieczną obsługą i niezawodną wykrywalnością, co ułatwia porównanie ich skuteczności w celowaniu w nowotwór oraz badań przesiewowych wielu typów złośliwych komórek nowotworowych. Mamy nadzieję, że dotychczasowe eksperymenty z tymi koniugatami peptydowymi mogą przyczynić się do opracowania nowych koniugatów leków GnRH ukierunkowanych na raka, a także pomóc w identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Obecny manuskrypt demonstruje kilka dobrze powtarzalnych i szybkich eksperymentów z koniugatami GnRH-FITC. Ekspresja GnRH-R na powierzchni komórki jest warunkiem determinującym wychwyt GnRH, dlatego równolegle badaliśmy poziom powierzchni komórek GnRH-I-R na badanych liniach komórkowych. Zwizualizowaliśmy koniugaty GnRH-I-R i GnRH-FITC za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) i określiliśmy ilościowo wychwyt komórkowy koniugatów GnRH-FITC za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).

Protocol

1. Przygotowanie kultur komórkowych i odczynników

1. Utrzymuj hodowle komórkowe w pożywce zalecanej przez producenta, uzupełnionej 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami (zwanymi kompletną pożywką). Kolbę do hodowli komórek należy przechowywać w nawilżonym inkubatorze z atmosferą 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C. Śledzić proliferację i zbieganie się komórek za pomocą mikroskopu odwróconego (przy użyciu obiektywu z kontrastem fazowym 10x).
2. Gdy komórki osiągną odpowiednią konfluację, usuń pożywkę i przemyj kulturę 2-3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Usunąć PBS i dodać 0,5 ml, sterylnego 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek (około 10 min).
3. Zawieś komórki w 3-4 ml sterylnej, kompletnej pożywce, aby zatrzymać trypsynę i przenieś je do sterylnej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przy 150 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie odrzucić sklarowany osad i zawiesić osad w 2-3 ml sterylnej, kompletnej pożywki.
4. Pobrać 100 μl zawiesiny komórek i wymieszać ze 100 μl 0,4% (m/V) roztworu błękitu trypanowego, aby zabarwić martwe komórki. Załadować 10 μl tej mieszaniny do hemocytometru i określić liczbę żywotnych komórek za pomocą odwróconego mikroskopu.
5. Rozcieńczyć wymaganą ilość zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku od 1,3 do 10 ml sterylnym kompletnym podłożem, zawierającym 4 x 10⁴ komórek/ml.
6. Dodać 250 μl zawiesiny komórek (przygotowanej w kroku 1.5) na studzienkę (10⁴ komórki/studzienkę) do siedmiu dołków pierwszego 8-dołkowego szkiełka mikroskopowego ze szklanym dnem. Użyj tego suwaka w metodzie wychwytu GnRH.
7. Dodać 250 μl zawiesiny komórkowej (przygotowanej w kroku 1.5) na studzienkę (10⁴ komórki/studzienkę) do pięciu dołków drugiego 8-dołkowego szkiełka mikroskopowego. Szkiełko to zostanie wykorzystane w metodzie ekspresji GnRH-I-R.
8. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej (przygotowanej w kroku 1.5) na dołek (4 x 10⁴ komórki/studzienkę) do siedmiu dołków płytki 12-dołkowej. Płytka ta zostanie wykorzystana w metodzie oznaczania ilościowego GnRH.
9. Pozwól komórkom przylegać do dwóch mikroskopijnych szkiełek i płytki. Inkubować je w nawilżonym inkubatorze z 5% atmosferą_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
10. Po inkubacji sprawdź komórki za pomocą odwróconego mikroskopu (przy użyciu obiektywu z kontrastem fazowym 10x). Jeśli komórki są zdrowe i przyczepione, wykonaj następujące czynności.
11. Przygotować 10 mM roztworu podstawowego GnRH-FITC w dimetylosulfotlenku (DMSO) z każdego z trzech koniugatów¹⁸. (Stosować następujące stężenia rozcieńczenia: 16,43 μg/μL [D-Lys⁶(FITC)]-GnRH-I, 16,97 μg/μL [D-Lys⁶(FITC)]-GnRH-II i 16,47 μg/μL [Lys⁸(FITC)]-GnRH-III) Przechowuj te roztwory podstawowe w ciemnym miejscu w RT i zużyj je w ciągu kilku tygodni.
12. Rozcieńczyć po 1,7 μl każdy z trzech 10 mM roztworów podstawowych GnRH-FITC w 1,7 ml kompletnego podłoża. Potrząśnij tymi roztworami. (Są to pożywki do obróbki 10 μM GnRH-FITC). Rozcieńczyć po 150 μl każdej z trzech pożywek 10 μM GnRH-FITC w 1,35 ml kompletnego podłoża. Wstrząśnij również tymi roztworami (są to pożywki do obróbki 1 μM GnRH-FITC).
    UWAGA: Wszystkie pożywki zawierające GnRH-FITC należy chronić przed światłem i zużyć w ciągu kilku godzin.
13. Podgrzej sześć pożywek GnRH-FITC (przygotowanych w kroku 1.12) i 4 ml kompletnego podłoża do temperatury 37 °C.
14. Rozcieńczyć 3 μl 5 mM roztworu sondy fluorescencyjnej (jądrowy barwnik przeciwstawny wymieniony w wykazie materiałów) w 3 ml PBS do 5 μM. Roztwór ten należy chronić przed światłem, utrzymywać go w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu kilku godzin.

2. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM)

1. Metoda wychwytu GnRH
   1. Pobrać pierwsze szkiełko mikroskopowe przygotowane w kroku 1.6 i odpipetować całe podłoże z każdego z siedmiu dołków. Dodać 250 μl podgrzanej kompletnej pożywki do pierwszego dołka. Użyj tego jako kontroli negatywnej. Dodać 250 μl podgrzanej pożywki do obróbki GnRH-FITC (od 1.13) do każdej z następnych sześciu studzienek (3 studzienki z 1 μM i 3 z 10 μM). Inkubować szkiełko w nawilżonym inkubatorze z atmosferą 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez 5 godzin.
   2. Odpipetować pożywkę z każdej studzienki i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego (10% neutralnej buforowanej formaliny) do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   3. Odpipetować roztwór utrwalający z każdej studzienki i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl PBS zawierającego 5 μM roztworu sondy fluorescencyjnej przygotowanego w kroku 1.14 do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   4. Odpipetować roztwór sondy fluorescencyjnej z każdej studzienki i dokładnie umyć komórki dwukrotnie 250 μl PBS. Na koniec dodaj 3-4 krople podłoża montażowego do każdej studzienki. Trzymaj slajd w ciemności przy RT, aż do obrazowania.
2. Metoda wyrażania GnRH-I-R
   1. Weź drugie 8-dołkowe szkiełko mikroskopowe przygotowane w kroku 1.7 i odpipetuj całe podłoże z każdej z pięciu studzienek.
   2. Dodać 250 μl podgrzanej kompletnej pożywki do pierwszego dołka, użyć go jako kontroli ujemnej. Dodać 250 μl podgrzanej kompletnej pożywki również do drugiego dołka i użyć go do zbadania ekspresji GnRH-I-R przed obróbką GnRH.
   3. Dodać 250 μl każdej z trzech podgrzanych 10 μM pożywki do obróbki GnRH-FITC do następnych trzech studzienek. Użyj tych studzienek do wstępnej obróbki komórek koniugatami GnRH-FITC przed zbadaniem ekspresji GnRH-I-R. Inkubować szkiełko w nawilżonym inkubatorze z 5% atmosferą_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   4. Odpipetować pożywkę do obróbki z każdej z trzech studzienek, które zostaną użyte do zbadania ekspresji GnRH-I-R po zabiegu GnRH, a następnie przemyć te studzienki 250 μl wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża. Dodać 250 μl podgrzanej kompletnej pożywki do każdej z trzech studzienek. Inkubować szkiełko w nawilżonym inkubatorze z 5% atmosferą_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   5. Odpipetować pożywkę z każdej z pięciu studzienek i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   6. Odpipetować roztwór utrwalający z każdej studzienki i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl PBS zawierającego 5% roztworu blokującego albuminę surowicy bydlęcej (BSA) do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   7. Rozcieńczyć 10 μl pierwszorzędowego przeciwciała GnRH-I-R w 1 ml PBS (stosunek 1:100). Trzymaj go w RT i zużyj w ciągu kilku godzin.
   8. Odpipetować roztwór blokujący BSA z każdej studzienki z wyjątkiem kontroli ujemnej (pierwsza studzienka). Przemyć komórki 250 μl PBS (z wyjątkiem studzienki kontroli ujemnej). Dodać 250 μl PBS zawierającego pierwszorzędowe przeciwciało GnRH-I-R przygotowane w kroku 2.2.7 do każdej studzienki (z wyjątkiem kontroli ujemnej). Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemnym miejscu.
   9. Rozcieńczyć 2,5 μl przeciwciała wtórnego znakowanego Alexa 546 w 1,25 ml PBS (stosunek 1:500).
      UWAGA: Roztwór ten należy chronić przed światłem, utrzymywać go w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu kilku godzin.
   10. Odpipetować roztwory z każdej z pięciu studzienek i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl PBS zawierającego przeciwciało drugorzędowe znakowane AF 546 przygotowane w kroku 2.2.9 do każdej studzienki. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.
   11. Odpipetować roztwór z każdej studzienki i przepłukać komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl PBS zawierającego 5 μM roztworu sondy fluorescencyjnej przygotowanego w kroku 1.14 do każdej studzienki i inkubować szkiełko przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   12. Odpipetować roztwór sondy fluorescencyjnej z każdej studzienki i dokładnie umyć komórki dwukrotnie 250 μl PBS. Następnie dodaj 3-4 krople podłoża montażowego do każdej studzienki. Trzymaj szkiełko w ciemności przy RT do czasu obrazowania mikroskopowego.
3. Obrazowania
   1. Zobrazuj komórki za pomocą odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (przy użyciu obiektywu 63X z olejkiem immersyjnym)
      1. Użyj następujących długości fal wzbudzenia/emisji. koniugaty GnRH: 488/514 nm, przeciwciało znakowane Alexa 546: 488/546 nm (stosować tylko do metody ekspresji GnRH-I-R), sonda fluorescencyjna Draq5: 633/680 nm.
      2. Ustaw parametry obrazowania za pomocą komórek kontroli ujemnej. Użyj tych parametrów do obrazowania leczonych komórek (ryc. 3). Ponownie dostosuj parametry obrazowania na każdym szkiełku mikroskopowym na początku analizy. W razie potrzeby dostosuj i wyeksportuj obrazy za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta.

3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)

1. Metoda oznaczania ilościowego GnRH
   1. Wziąć płytkę przygotowaną w kroku 1.8 i odpipetować całe medium z każdej z siedmiu studzienek. Dodaj 1 ml podgrzanego kompletnego podłoża do pierwszego dołka. Użyj tego jako kontroli negatywnej. Dodaj po 1 ml każdego z sześciu wstępnie podgrzanych pożywek do obróbki (3 studzienki z 1 μM i 3 studzienki z 10 μM) do następnych sześciu studzienek. Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze z 5% atmosferą_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez 5 godzin.
   2. Odpipetować pożywkę z każdej studzienki. Ostrożnie umyj komórki dwukrotnie 2 ml PBS. Dodaj 500 μl roztworu trypsyny-EDTA do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C aż do oderwania komórek (około 10 min).
   3. Dodaj 1 ml kompletnego podłoża do każdej studzienki, aby zatrzymać trypsynę. Potrząśnij talerzem. Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety i przenieść zawiesinę z każdej studzienki do probówek FACS. Odwirować probówki o sile 150 x g przez 4 minuty, w temperaturze 4 °C.
   4. Ostrożnie wylej supernatanty jednym ruchem. Dodaj 500 μl lodowatego PBS do każdej probówki FACS i delikatnie ponownie zawieś komórki. Trzymaj probówki na lodzie do końca eksperymentu.
2. Analiza i obliczenia
   1. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Do wzbudzenia użyj długości fali lasera argonowego 488 nm, a do wykrywania użyj długości fali 530 nm. Ustaw parametry cytometru przepływowego, uruchamiając komórki kontroli ujemnej. Użyj tych parametrów do analizy leczonych komórek (ryc. 4A). Oceń dane za pomocą oprogramowania producenta, określ medianę wartości intensywności fluorescencji (MIF) i oblicz względne wartości MIF.

Results

Obrazy uzyskane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) dostarczają spektakularnych informacji na temat absorpcji koniugatów GnRH-FITC w danej hodowli komórkowej w sposób zależny od czasu i stężenia. Równolegle z tymi koniugatami GnRH-FITC, obecność GnRH-I-R na powierzchni komórki jest również możliwa do zweryfikowania w eksperymencie CLSM. Ponadto, dzięki zastosowaniu sondy fluorescencyjnej barwiącej DNA w dalekiej czerwieni, możliwe jest przeciwbarwienie jąder kom...

Discussion

W eksperymentach opisanych w niniejszym dokumencie wykorzystano selektywnie znakowane analogi GnRH do badań przesiewowych przylegających kultur komórkowych in vitro. Metody mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej są odpowiednie do śledzenia i ilościowego określania wychwytu komórkowego tych koniugatów GnRH-FITC w sposób zależny od czasu i stężenia. Eksperymenty te składają się z następujących krytycznych etapów: 1) utrzymanie sterylnej, zdrowej hodowli komórkowej; 2) Peptydy GnRH muszą być wys...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EBC-1	Bank komórek JCRB	JCRB0820	Ludzki rak płaskonabłonkowy płuc
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Ludzki gruczolakorak trzustki
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Ludzki rak gardła
RPMI-1640 Pożywka z L-glutaminą	Lonza	BE12-702F	Pożywka hodowlana dla komórek BxPC-3
Minimum Orła Niezbędne Pożywka	Lonza	BE12-611F	Pożywka hodowlana dla komórek EBC-1 i uzupełniona 0,1% pirogronianem sodu dla komórek Detroit-562
Surowica bydlęca	Euro Clone	ECS0180L	Uzupełnia pożywkę hodowlaną
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Uzupełnia pożywkę hodowlaną (antybiotyki)
Standardowe kolby do hodowli komórkowych	VWR	10062-872	Zapewniają spójne, sterylne środowisko wzrostu komórek
Mieszanina trypsyny i EDTA	Lonza	BE17-161E	Usuń przyczepione komórki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Lonza	BE17-516F	Rozpuszczalnik
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Rozpuszczalnik
Trypan Blue Solution, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Służy do liczenia komórek
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	wykonane przez nas	-	Czystość ≥ 98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	wykonane przez	nas-Czystość	≥ 98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	wykonane przez	nas-Czystość	≥ 98% (HPLC)
szklane dno 8-dołkowe szkiełko mikroskopowe	Ibidi	80826	Zastosowanie w eksperymencie CLSM
Płytka do hodowli komórkowej Corning Costar, 12-dołkowa	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Zastosowanie w eksperymencie FACS
Roztwór utrwalający (10% neutralna buforowana formalina)	Bio-Optica	01V60P	Napraw przylegające komórki
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Zapobiegaj niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał
GnRHR Przeciwciało	Proteintech	19950-1-AP	Odczynnik immunocytochemiczny, wiąże się z ludzkimi receptorami GnRH typu I
Przeciwciało wtórne, koniugat Alexa Fluor 546	Odczynnik immunocytochemiczny	Thermo Fisher Scientific	A11035
Roztwór sondy fluorescencyjnej (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Jądra przeciwbarwiące
Fluoromount Wodne medium montażowe	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Zastosowanie w eksperymencie CLSM, zachowanie fluorescencji
Mikroskop odwrócony	Elektro-Optika Sp. z o.	Alpha XDS-2T	Sprawdź fenotyp i zbieżność kultur komórkowych
Odwrócony konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Zeiss	LSM-710	Zastosowanie w eksperymencie CLSM
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Użyj w eksperymencie FACS