Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model WinCF - niedrogi i łatwy w obsłudze mikrokosmos oskrzelika zatkanego śluzem do badania mikrobiologii infekcji płuc

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55532

⸱

8 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Drogi oddechowe pacjentów z mukowiscydozą (CF) są idealnym środowiskiem dla rozwoju patogenów mikrobiologicznych. W manuskrypcie opisano nowatorską metodę badania mikrobiomu płuc mukowiscydozy w środowisku, które naśladuje miejsce, w którym powodują one chorobę i w jaki sposób zmiany warunków chemicznych mogą wpływać na dynamikę drobnoustrojów.

Streszczenie

Wiele przewlekłych chorób dróg oddechowych powoduje zatkanie dróg oddechowych śluzem. Płuca osoby z mukowiscydozą są przykładowym przypadkiem, w którym ich skrzeliki zatkane śluzem tworzą korzystne środowisko dla kolonizacji mikrobiologicznej. W tym środowisku rozwijają się różne patogeny, które wchodzą ze sobą w interakcje i powodują wiele objawów związanych z mukowiscydozą. Jak w przypadku każdego zbiorowiska drobnoustrojów, warunki chemiczne ich siedliska mają znaczący wpływ na strukturę i dynamikę zbiorowiska. Na przykład różne mikroorganizmy rozwijają się przy różnych poziomach tlenu lub innych stężeń substancji rozpuszczonych. Dotyczy to również płuc z mukowiscydozą, gdzie uważa się, że stężenie tlenu wpływa na fizjologię i strukturę społeczności. Opisane tutaj metody mają na celu naśladowanie środowiska płuc i hodowlę patogenów w sposób bardziej podobny do tego, w jaki wywołują chorobę. Manipulacja chemicznym otoczeniem tych drobnoustrojów jest następnie wykorzystywana do badania, w jaki sposób chemia infekcji płuc rządzi ich ekologią mikrobiologiczną. Metoda, zwana systemem WinCF, opiera się na sztucznej pożywce z plwociną i wąskich rurkach kapilarnych, które mają zapewnić gradient tlenu podobny do tego, który występuje w oskrzelkach zatkanych śluzem. Manipulowanie warunkami chemicznymi, takimi jak pH pożywki plwociny lub ciśnienie antybiotyków, pozwala na wizualizację różnic mikrobiologicznych w tych próbkach za pomocą kolorowych wskaźników, obserwowanie produkcji gazu lub biofilmu lub ekstrakcję i sekwencjonowanie zawartości kwasów nukleinowych w każdej próbce.

Wprowadzenie

Metoda opisana w tym manuskrypcie nazywa się systemem WinCF1. Ogólnym celem WinCF jest dostarczenie eksperymentalnej konfiguracji zdolnej do symulacji środowiska wypełnionego śluzem oskrzelika płucnego. Pozwoli to na stworzenie elastycznego systemu do badania patogenów mikrobiologicznych chorób płuc o fenotypie nadmiernego wydzielania śluzu, w tym mukowiscydozy (CF), przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP), astmy i innych. Procedura została opracowana specjalnie do badania mukowiscydozy, która charakteryzuje się mutacjami, które powodują, że wydzieliny płucne stają się gęste i trudne do usunięcia, ostatecznie wypełniając oskrzeliki i inne małe kanały śluzem2. Takie zatory w płucach hamują wymianę gazową, ponieważ wdychane powietrze nie jest już w stanie dotrzeć do wielu pęcherzyków płucnych, a także stanowi siedlisko dla kolonizacji bakteryjnej3,4. Brak możliwości zapobieżenia rozwojowi drobnoustrojów w nadmiarze śluzu płucnego ostatecznie prowadzi do rozwoju złożonych przewlekłych infekcji dróg oddechowych. Społeczności te zawierają różne organizmy, w tym wirusy, grzyby i bakterie, takie jak Pseudomonas aeruginosa, które wchodzą ze sobą w interakcje5,6,7,8. Uważa się, że aktywność mikrobiomu płuc mukowiscydozy jest zaangażowana w zaostrzenia objawów zwane zaostrzeniami płuc1,9,10,11. WinCF umożliwia badanie zachowań społeczności drobnoustrojów w związku z tymi zaostrzeniami i jest obecnie rozszerzany, aby działać jako podstawowy system eksperymentalny do badania ekologii mikrobiologicznej płuc. Tradycyjnie, zaostrzenia badano poprzez bezpośrednią analizę próbek pobranych z płuc. Wiele czynników zakłócających sprawia, że bezpośrednia analiza zachowania drobnoustrojów w płucach jest trudna, dzięki systemowi WinCF wiele z tych czynników jest usuwanych, a zachowanie mikrobiomu płuc można badać bardziej bezpośrednio, co pozwala na dokładniejszą analizę aktywności bakteryjnej w oskrzelkach zatkanych śluzem.

System WinCF zapewnia metodę hodowli i analizy bakterii w sposób, który skutecznie naśladuje środowisko płuc. Tradycyjne metody hodowli bakterii płuc często polegały na hodowaniu próbek na tradycyjnych płytkach agarowych. Metody te pozostawiają próbki otwarte na działanie tlenu atmosferycznego, zaniedbując uwzględnienie warunków niedotlenienia i często niedotlenienia występujących w oskrzelkach płuc zatkanych śluzem12,13. Hodowla na agarze w warunkach tlenowych w niczym nie przypomina środowiska płuc mukowiscydozy i może wprowadzać w błąd klinicystów i badaczy co do zachowania patogenów, które próbują leczyć. Ponadto składniki odżywcze dostępne dla bakterii na płytkach agarowych są niepodobne do tych dostępnych w rzeczywistej plwocinie, która jest uwzględniana w WinCF poprzez wykorzystanie sztucznej pożywki z plwociny (ASM). Jak wykazały kultury Pseudomonas w Sriramulu i wsp.14, ASM zawiera specyficzny zestaw komponentów, który naśladuje zasoby dostępne dla mikrobów plwociny, a także replikuje fizyczną konsystencję plwociny. Ponieważ chore płuca mają specyficzny mikrobiom, badanie takich mikroorganizmów powinno odbywać się idealnie również w określonych warunkach płuc.

System WinCF umożliwia szybką analizę i łatwą manipulację warunkami eksperymentalnymi, aby obserwować zmiany mikrobiologiczne podobne do tych, które występują w rzeczywistych oskrzelkach płucnych. Technika ta pozwala na inokulację niezliczonych powiązanych typów próbek, w tym plwociny, śliny, innych wydzielin ciała oraz czystych lub mieszanych kultur bakterii. Charakter układu eksperymentalnego pozwala na natychmiastową wizualną interpretację zachowań społeczności drobnoustrojów i jest zaprojektowany tak, aby umożliwić łatwe zastosowanie wielu procedur mikrobiologicznych i omicznych. Takie badania są ważne, ponieważ skład społeczności bakteryjnej zmienia się w zależności od warunków fizykochemicznych ich środowiska. Dzięki WinCF można manipulować warunkami chemicznymi pożywki w celu analizy wpływu na aktywność bakterii. Na przykład, kwasowość pożywki może być zmieniona przed inokulacją próbki. Po inkubacji można bezpośrednio porównać aktywność bakteryjną w każdym z tych warunków i wyciągnąć wnioski na temat tego, jak bakterie w tych próbkach plwociny zachowują się w odpowiedzi na zmieniające się pH. W tym miejscu przedstawiamy procedury stosowania systemu WinCF oraz przykłady, w jaki sposób można manipulować chemią pożywek w celu zbadania wpływu na mikrobiom płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów zapasowych do pożywek z syntetyczną plwociną

  1. Przygotuj 5% roztwór mucyny. Dodaj 1,0 g odwodnionej mucyny z żołądka świni do 20 ml wody dejonizowanej. Uzyskany roztwór poddaj autoklawowaniu.
    UWAGA: Sterylizacja mucyny zniszczy jej naturalną strukturę; inne metody sterylizacji mucyny w formie suchej obejmują sterylizację promieniami UV oraz irradiację. Metody te nie były jednak szeroko stosowane w systemie WinCF.
  2. Do 50 ml wody dejonizowanej dodać 2,2 g KCl i pozostawić do czasu rozpuszczenia. Do 50 ml wody dejonizowanej dodać 5,0 g NaCl i pozostawić do czasu rozpuszczenia. Oba roztwory poddać autoklawowaniu.
  3. Dodaj 10 mg DNA z plemni łososia do 10 ml sterylnej wody dejonizowanej. Podgrzej ten roztwór do około 85 °C w kąpieli wodnej przez kilka godzin, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
  4. Dodać 5,0 mg ferrytyny do 5,0 ml sterylnej wody dejonizowanej.

2. Przygotowanie sztucznej pożywki imitującej plwocinę

  1. Połączyć następujące składniki: 16 ml roztworu zapasu mucyny, 2,0 ml roztworu zapasu KCl, 2,0 ml roztworu zapasu NaCl, 200 µL emulsji z żółtka jaja, 5,6 ml roztworu zapasowego DNA, 120 µL roztworu zapasu ferrytyny, 5,78 ml roztworu aminokwasów egzogennych, 5,78 ml roztworu aminokwasów endogennych oraz 2,44 ml sterylnej wody.
    1. Jeśli pojawi się niewielka ilość osadu, należy delikatnie wstrząsnąć w celu wymieszania.
    2. Do ośmiu sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml odpipetować po 5,0 ml pożywki.
      UWAGA: Warunki chemiczne w każdej probówce można modyfikować według uznania. Na przykład do każdej probówki można dodać roztwory buforowe i wskaźniki pH w celu porównania zachowania mikroorganizmów przy różnych poziomach pH. Demonstracja tego procesu przedstawiona jest w sekcji wyników reprezentatywnych z 8 różnymi poziomami pH, od 5,0 do 8,5 w odstępach co 0,5 pH.
  2. Po pomyślnym dostosowaniu warunków chemicznych pożywek, należy je zamrozić do późniejszego użycia. Pożywki zachowają stabilność w zamrożeniu w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Po rozmrożeniu wymieszać w wortexie.

3. Przygotowanie biegu kontrolnego kapilar

  1. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza napełnić osiem sterylnych probówek do mikrocentryfugi 250 µL po tyle jednostek pożywki.
  2. Należy przygotować osiem dodatkowych sterylnych probówek do wirowania o pojemności 15 ml, tak aby każda z nich odpowiadała probówce do mikrocentryfugi wymienionej w kroku 3.1.
    1. Zdezynfekuj ręcznik papierowy 70% roztworem etanolu i pozostaw do wyschnięcia. Po wyschnięciu podrwij ręcznik na kawałki o wielkości około czterech cali kwadratowych każdy i zgnieć każdy fragment na dnie probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. W celu przygotowania kolejnych probówek spryskaj i wysusz dodatkowe ręczniki papierowe w razie potrzeby.
    2. Umieściwszy jedną kulkę papieru na dnie każdej probówki do wirowania, lekko zwilż każdą z nich, dodając około 1,0 ml sterylnej wody, aby stworzyć wilgotne środowisko.
  3. Przygotuj trzy szklane kapilary dla każdej probówki do mikrowirówki przygotowanej w kroku 3.1 oraz blok uszczelniacza do kapilar.
  4. Dla każdej probówki do mikrocentryfugi napełnić trzy kapilary pożywką do poziomu około 5 mm poniżej niebieskiego znacznika znajdującego się w górnej części kapilary.
    1. Napełnić, trzymając jeden koniec rurki w probówce do mikrocentryfugi i przechylając ją w kierunku orientacji poziomej, aby działanie kapilarne wprowadziło medium do wnętrza rurki (patrz Rysunek 1).
    2. Przerwij napełnianie, delikatnie przykrywając palcem w rękawiczce otwarty koniec probówki, a następnie uszczelnij drugi koniec probówki, dociskając go do bloku uszczelniającego.

Urządzenie mikroprzepływowe w laboratorium; dłoń w rękawiczce trzyma pipetę i fiolkę, zestaw do chromatografii cieczowej.
Rycina 1: Przykład gradientu pH, napełnianie kapilary medium imitującym plwocinę. Pożywkę dodaje się, wprowadzając jeden koniec rurki do cieczy i przechylając ją, aby ułatwić działanie kapilarne. Barwa pożywki w tym przykładzie wynika z dodania wskaźnika pH, który ma pomóc w zademonstrowaniu potencjalnych zmian kwasowości po inkubacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Każdy zestaw trzech kapilar należy umieścić w probówkach do wirówki o objętości 15 ml, wypełnionych całkowicie nasączonymi sterylną wodą ręcznikami papierowymi, stroną uszczelnioną masą modelarską skierowaną w dół. Probówki należy zamknąć i opisać. Te trzy kapilary służą do powtórzeń każdego warunku kontrolnego.
  2. Po wypełnieniu wszystkich probówek wirówkowych o pojemności 15 ml odpowiednimi kapilarami, należy umieścić probówki w statywie. Statyw należy ustawić w taki sposób, aby inkubacja probówek odbywała się w pozycji poziomej (w celu wychwycenia pęcherzyków gazu) (Patrz Rysunek 2). Inkubować kapilary wewnątrz probówek do wirówki (zawierających zwilżone grudki papieru) w temperaturze 37 °C przez 48 h.

Probówka w statywie w konfiguracji eksperymentu laboratoryjnego, przedstawiająca pomiar objętości cieczy, proces chemiczny.
Rysunek 2: Przykład gradientu pH, kapilary przygotowane do inkubacji. Po napełnieniu i zamknięciu trzech kapilar umieszcza się je w probówce wirówkowej, na dnie której znajduje się wilgotny ręcznik papierowy. Probówkę należy następnie zamknąć zakrętką i wstawić do statywu. Podczas inkubacji statyw musi być ustawiony poziomo, jak pokazano na zdjęciu, aby po zakończeniu inkubacji można było zaobserwować wydzielanie gazu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Obrazowanie kontrolnych kapilar po inkubacji

  1. Wyjmij statyw z probówkami do wirowarki z inkubatora, dbając o to, aby probówki pozostawały w pozycji poziomej. Ostrożnie wysuń kapilary z probówek do wirowarki, utrzymując każdy zestaw trzech kapilar oddzielnie od pozostałych zestawów.
  2. Ułóż kapilary obok siebie na podświetlaczu, wyrównując je tak, aby zawartość rurek była widoczna i oświetlona. Co trzy kapilary pozostaw przerwę, aby oddzielić od siebie różne warunki chemiczne.
  3. Przy wyrównanych probówkach i włączonym podświetlaczu wykonaj zdjęcie bezpośrednio z góry. (Patrz Rysunek 3)

Schemat układu elektroforezy kapilarnej do rozdziału i analizy DNA, przedstawiający migrację próbek.
Rysunek 3: Przykład gradientu pH, bieg kontrolny, preinkubacja, bez dodatku plwociny. Sztuczne podłoże plwociny po dodaniu do kapilar zgrupowanych po trzy, z pH zwiększającym się od lewej do prawej. Kombinacja wskaźników dodanych do podłoża sprawia, że probówki o bardziej kwasowym odczynie wykazują bardziej żółty kolor, podczas gdy probówki o mniejszej kwasowości stają się bardziej fioletowe. Kapilary są ułożone poziomo i oświetlone od dołu, a zdjęcie wykonano z góry. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Zutylizować materiały kontrolne w pojemniku na odpady biologiczne.

5. Inokulacja kapilar WinCF próbką plwociny

  1. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza napełnić osiem sterylnych probówek do mikrocentryfugi za pomocą 225 µL po każdej pożywce.
  2. Uhomogenizować próbkę plwociny, wielokrotnie zasysając i wypuszczając ją za pomocą strzykawki 3 ml (plastikowej strzykawki bez igły). Czynność tę powtarzać do momentu uzyskania gładkiej konsystencji plwociny.
  3. Dodaj 25 µL homogenizowanego plwocina do każdej probówki do mikrowirówki (rozcieńczenie 1/10 w podłożu ASM) przygotowanej w kroku 5.1. Następnie mieszaj próbki w wirówce typu vortex przez 30 s do uzyskania jednorodności.
  4. Należy dodać pożywkę do kapilar, postępując zgodnie z procedurą opisaną w krokach od 3.2 do 3.5.

6. Obrazowanie kapilar z próbkami po inkubacji

  1. Po 48-godzinnym czasie inkubacji wyjąć kapilary i wykonać obrazowanie zgodnie z procedurą opisaną w krokach od 4.1 do 4.3.
  2. Jeśli w probówkach znajdują się pęcherzyki powietrza, należy upewnić się, że wykonane fotografie wyraźnie przedstawiają granicę między pęcherzykami a medium w probówkach. W przypadku obecności biofilmu należy upewnić się, że fotografie również wyraźnie obrazują jego występowanie.

7. Usuwanie pożywki w celu dalszych analiz

  1. Aby ułatwić późniejszą analizę, po wykonaniu obrazowania należy usunąć medium z kapilar. Potencjalne zastosowania obejmują hodowlę komórkową, sekwencjonowanie DNA/RNA oraz profilowanie metabolomiczne.
    Ostrzeżenie: Szklane kapilary wypełnione patogenami stanowią istotne zagrożenie biologiczne, w związku z czym czynności te należy wykonywać bardzo ostrożnie, używając odpowiedniego sprzętu. W przypadku stłuczenia kapilar należy zutylizować je w odpowiednim pojemniku na odpady biologiczne ostrego charakteru.
  2. Do usunięcia medium należy użyć igieł tępokrawędziowych o rozmiarze 25 G i długości 0,5 cala. Wprowadź igłę tępokrawędziową w zatyczkę probówki, aby przerwać uszczelnienie.
  3. Po przełamaniu uszczelnienia należy odwrócić kapilarę do góry dnem, aby pożywka wyciekła z górnej części. Jeśli pożywka nie wycieka łatwo, należy użyć pipety z 200 µL przechylić probówkę i usunąć z niej medium, naciskając tłok pipety po wprowadzeniu jej do końca rurki kapilarnej. Usunięte z probówki medium należy zebrać do odpowiedniego pojemnika (probówki wirówkowej 1,5 ml).
    UWAGA: W przypadku analizy transkryptomicznej lub innych analiz RNA, pożywkę można usuwać bezpośrednio do buforów stabilizujących RNA.

8. System WinCF FLUD

UWAGA: System urządzenia do ładowania płynów WinCF Fluid Loading Utility Device (FLUD) to opcjonalny zestaw urządzeń uzupełniających, zaprojektowany w celu optymalizacji wydajności systemu WinCF. System WinCF FLUD składa się głównie z materiałów drukowanych w technologii 3D. Produkcja metodą druku 3D umożliwia szybką i łatwą wymianę materiałów, co zapewnia badaczom minimalny czas przestoju oraz minimalne wymagania produkcyjne. Projekty, pliki stl, instrukcje druku 3D oraz instrukcja obsługi WinCF FLUD są dostępne w suplemencie online.

  1. Przygotowanie pożywek do ładowania do kapilar
    1. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza napełnić osiem sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml za pomocą 900 µL po jednej porcji pożywki na każdą.
    2. Próbki plwociny należy zhomogenizować, wielokrotnie zasysając i wypuszczając plwocinę za pomocą strzykawki 3 ml (plastikowej strzykawki bez igły). Czynność tę należy powtarzać do momentu uzyskania gładkiej konsystencji plwociny.
    3. Dodaj 100 µL homogenizowanego plwociny do każdej probówki do mikrocentryfugi (rozcieńczenie 1/10 w medium) przygotowanej w kroku 8.1.1. Następnie mieszać próbki wierzchołkowym mieszalniku (vortex) przez 30 s do uzyskania odpowiedniego wymieszania.
    4. Umieść wypełnione i otwarte probówki do mikrowirówki w uchwycie rotora, orientując je w pozycji pionowej.
  2. Umieszczenie kapilar
    1. Pobierz trzy kapilary dla każdej probówki do mikrocentrifugi użytej w kroku 8.1.
    2. Wsuń trzy probówki do gumowego uchwytu tak, aby znajdowały się w jednej linii z probówkami do mikrowirówki po przeciwnej stronie urządzenia. Upewnij się, że zaznaczone końce probówek są skierowane w stronę przeciwną do probówek do mikrowirówki. Dopasuj trzy otwory w dolnej części uchwytu do trzech wypustek w podstawie uchwytu.
    3. Po umieszczeniu kapilar w kanałach prowadzących urządzenia, należy stabilnie przycisnąć je w ich środkowej części za pomocą gumowego ubijaka, aby zapobiec przesunięciu. (Patrz Rysunek 4)

Układ elektroforezy kapilarnej, obrazujący rozdział DNA przy użyciu wielu kapilar.
Rysunek 4: System FLUD w pełni załadowany kapilarami, które są zabezpieczone gumowym tamponem w ich środkowej części. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Napełnianie kapilar pożywką
    1. Ostrożnie chwyć jedną ręką koniec urządzenia, w którym znajdują się kapilary, a drugą ręką przytrzymaj statyw rotacyjny z włożonymi probówkami do mikrocentryfugi.
    2. Ostrożnie obrócić statyw do probówek do mikrocentryfugi tak, aby probówki znajdowały się niemal w pozycji poziomej, a następnie powoli przesunąć statyw w kierunku kapilar. (Patrz Rysunek 5)
    3. Gdy końce kapilar zetkną się z podłożem w probówkach do mikrowirówki, należy upewnić się, że pod wpływem sił kapilarnych rozpoczęło się natychmiastowe napełnianie kapilar. Aby dostosować szybkość i poziom napełnienia, należy delikatnie obracać cały aparat. Podczas wykonywania tej czynności należy uważać, aby nie rozlać podłoża z probówek do mikrowirówki. (Patrz Rysunek 6)
    4. Po napełnieniu kapilar do pożądanych poziomów należy ustawić aparat poziomo na powierzchni i ostrożnie, lecz szybko, wysunąć statyw z probówkami do mikrocentryfugi z końców kapilar, aby przerwać napełnianie. Probówki do mikrocentryfugi można teraz całkowicie przesunąć z powrotem do pozycji pionowej i zamknąć.
    5. Uszczelnij wystające końce rurek kapilarnych, dociskając blok uszczelniający do każdego zestawu trzech powtórzeń, uszczelniając po jednym zestawie, aż wszystkie zostaną zamknięte. Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji, dociskaj inną część bloku uszczelniającego do każdego zestawu trzech powtórzeń (Patrz Rysunek 7).

Układ do elektroforezy z kapilarami w uchwytach do analizy rozdziału DNA w eksperymencie laboratoryjnym.
Rycina 5: System FLUD z probówkami z medium ustawionymi w orientacji poziomej, gotowymi do kontaktu z kapilarami. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Pipeta i statyw na probówki do układu chromatograficznego, wspomagające analizę próbek ciekłych.
Rycina 6: System FLUD z kapilarami wypełnionymi pożywką poprzez Zjawisko kapilarne. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Równowaga statyczna w elektroforezie żelowej; przygotowanie metody z nakładaniem próbek na tackę.
Rysunek 7: Uszczelnianie wypełnionych kapilar w systemie FLUD, po jednym zestawie trzech powtórzeń jednocześnie, przy użyciu bloku uszczelniającego. Blok uszczelniający posiadał plastik wzdłuż krawędzi, który został odcięty, aby zapobiec kontaktowi z sąsiednimi zestawami potrójnymi podczas uszczelniania. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

  1. Inkubacja
    1. Zdejmij gumową uszczelkę z każdej z sekcji środkowych probówek i podnieś gumowy uchwyt z głównego urządzenia. Powinno to spowodować jednoczesne wyjęcie wszystkich kapilar. Następnie umieść uchwyt wraz z rurkami na statywie do obrazowania. Statyw ten posiada trzy wypustki pasujące do uchwytu oraz małe kanały prowadzące, w których należy umieścić rurki.
    2. Umieść cały statyw do obrazowania w przezroczystym plastikowym pudełku inkubacyjnym. Namocz niewielkie ilości sterylnych ręczników papierowych w sterylnej wodzie i umieść je wzdłuż dwóch krótszych boków pudełka, aby zapewnić wilgotność podczas inkubacji. (Patrz Rycina 8)
    3. Całkowicie zamknąć pudełko i umieścić je wewnątrz 37 °C do inkubatora, dbając o to, aby probówki pozostały w pozycji poziomej. Inkubować przez 48 h.

Równowaga statyczna; ΣFx=0; metoda wagi ramiennej; zestaw eksperymentalny w kompaktowej obudowie; zastosowanie edukacyjne.
Rysunek 8: Kapilary w gumowej podstawce przeniesione z systemu FLUD do statywu obrazującego, który został umieszczony w przezroczystym boksie inkubacyjnym wraz z wilgotnymi ręcznikami papierowymi w celu zapewnienia wilgotności. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Obrazowanie i ekstrakcja
    1. Wyjmij statyw do obrazowania z probówkami z inkubatora i ustaw go na lightboxie z podświetleniem dolnym. Dzięki temu, że probówki znajdują się już w statywie, zestawy powtórzeń threefold będą odpowiednio rozmieszczone i gotowe do natychmiastowego obrazowania.
    2. Ustaw ostrość kamery na probówki w taki sposób, aby wszystkie były widoczne w polu widzenia, a światło z pulpitu świetlnego zapewniało wystarczający kontrast i wizualizację barwy barwników w probówkach. Wykonaj zdjęcie bezpośrednio z góry.
    3. Aby wydobyć zawartość probówek, należy wyjmować kapilary z gumowej podstawki po jednym zestawie trzech probówek. Probówki należy delikatnie podnieść i wyjąć z podstawki lub wysunąć.
    4. Dla każdego zestawu próbek wykonanych w trzech powtórzeniach należy przeprowadzić procedurę ekstrakcji zgodnie ze szczegółowym opisem w krokach od 7.1 do 7.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wzrost mikrobiologiczny w zależności od różnych warunków chemicznych wywołanych w próbkach różnił się w niektórych przypadkach drastycznie, a w innych bardziej subtelnie. Wiele zmian w aktywności miało charakter wizualny i stało się wyraźnie widocznych natychmiast po zakończeniu okresu inkubacji. W przykładzie manipulacji pH próbki w całym zakresie pH różniły się znacznie, co wykazało wiele czynników ujawnionych po inkubacji. Gdy do pożywek nie dodano próbek plwociny, jedyną zmianą zaobse...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Skład mikrobiologiczny płuc z mukowiscydozą obejmuje dużą różnorodność organizmów, ale warunki panujące w płucach prawdopodobnie mają znaczący wpływ na to, jakie rodzaje drobnoustrojów mogą przetrwać i rozwijać się13,15. Konkretne mechanizmy, za pomocą których zmieniają się te warunki, i dokładny wpływ, jaki wywierają na mikrobiom płuc, są obecnie na ogół niejasne. W niniejszej metodzie eksperymentalnej przedstawiono analizę zmian mikrobiologicznych w oparciu o z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Vertex Pharmaceuticals i Cystic Fibrosis Research Innovation Award za sfinansowanie R. Quinna oraz NIH/NIAID za sfinansowanie grantu 1 U01 AI124316-01, podejścia biologii systemowej do leczenia patogenów opornych na wiele leków. Chcielibyśmy również podziękować Wydziałowi Inżynierii Mechanicznej i Lotniczej na studiach licencjackich inżynierii mechanicznej UCSD za ułatwienie współpracy w zakresie inżynieryjnych aspektów tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oznaczone kolorami rurki kapilarneFisher Scientific22-260943
Środek uszczelniający rurkę Cha-sealKimble-Chase43510
Mucyna z żołądka świniSigmaM1778
Ferrytyna, kationowana ze śledziony koniaSigmaF7879
DNA plemników łososia Sól sodowa (sonifikowana)AppliChem PanreacA2159
MEM Aminokwasyendogenne Corning cellgro25-025-CI
MEM AminokwasyCellgro25-030-CI
Emulsja z żółtka jaja, 50%Dalynn BiologicalsVE30-100
Chlorek potasuFisher ScientificP2157500
Chlorek soduFisher ScientificS271500
Probówki wirówkowe 15 ml z nadrukowaną podziałką i płaskimi nakrętkamiVWR89039-666
Probówki wirówkowe 50 ml z nadrukowaną podziałką i płaskimi nakrętkamiVWR89039-656
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlCorningMCT-150-R
Probówki do mikrowirówek 2,0 mlCorningMCT-200-C

Bibliografia

  1. Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
  2. Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
  3. Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
  4. Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, Suppl 4. S31-S38 (2015).
  5. Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130(2012).
  6. Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
  7. Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313(2012).
  8. Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
  9. Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
  10. Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432(2013).
  11. Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
  12. Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
  13. Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
  14. Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
  15. Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

P uco w mukowiscydoziesztuczne medium plwocinymikrobiom p ucmodel kapilarnyspo eczno mikrobiologicznagradient tlenowywzrost patogen wsekwencjonowanie DNAanaliza metabolomiczna
Model WinCF - niedrogi i łatwy w obsłudze mikrokosmos oskrzelika zatkanego śluzem do badania mikrobiologii infekcji płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.