Method Article

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

DOI:

10.3791/55533

⸱

May 1st, 2017

 , 
1Laboratory of Epidemiology and Population Science, National Institute on Aging, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Starzenie się komórek, nieodwracalny stan zatrzymania cyklu komórkowego, może być wywołane przez różne stresy komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokoły indukowania starzenia się komórek oraz metody oceny markerów starzenia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W odpowiedzi na stres lub uszkodzenie komórki, proliferujące komórki mogą wywołać specyficzny program, który inicjuje stan długotrwałego zatrzymania cyklu komórkowego, określany jako starzenie się komórki. Akumulacja komórek starczych następuje wraz ze starzeniem się organizmu i poprzez ciągłą hodowlę in vitro. Starcze komórki wpływają na wiele procesów biologicznych, w tym rozwój embrionalny, naprawę i regenerację tkanek, supresję guza i starzenie się. Cechy charakterystyczne komórek starczych obejmują między innymi zwiększoną aktywność β-galaktozydazy (SA-β-gal) związaną ze starzeniem się; poziomy p16INK4A, p53 i p21; wyższy poziom uszkodzeń DNA, w tym γ-H2AX; tworzenie ognisk heterochromatyny związanych ze starzeniem się (SAHF); oraz nabycie fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się (SASP), zjawiska charakteryzującego się wydzielaniem szeregu cytokin prozapalnych i cząsteczek sygnałowych. W tym miejscu opisujemy protokoły starzenia się zarówno replikacyjnego, jak i wywołanego uszkodzeniem DNA w hodowanych komórkach. Ponadto zwracamy uwagę na techniki monitorowania fenotypu starzenia się przy użyciu kilku markerów związanych ze starzeniem, w tym barwienia SA-β-gal, γ-H2AX i SAHF, oraz ilościowego określania poziomów białek i mRNA regulatorów cyklu komórkowego i czynników SASP. Metody te mogą być stosowane do oceny starzenia się w różnych modelach i tkankach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponad pół wieku temu, Hayflick i współpracownicy opisali, jak nieprzekształcone komórki rozprzestrzeniają się w hodowli, ale tylko przez skończony okres czasu1. Długotrwała hodowla ludzkich fibroblastów spowodowała, że komórki przestały się namnażać; Były jednak aktywne metabolicznie i nazywano to starzeniem się komórek. Starzenie się może być korzystne dla hamowania nowotworzenia, ale może być również szkodliwe, ponieważ uważa się, że przyczynia się do utraty zdolności regeneracyjnych, która występuje wraz ze starzeniem się2,3. Wykazano, że komórki starcze gromadzą się w tkankach wraz z wiekiem człowieka4 i są zaangażowane w wiele procesów biologicznych, w tym rozwój embrionalny, gojenie się ran, naprawę tkanek i stany zapalne związane z wiekiem2.

Ciągłe przechodzenie komórek w hodowli wywołuje starzenie replikacyjne, które zostało powiązane z zanikiem telomerów i niestabilnością genomu. Różne stresy komórkowe, w tym uszkodzenia DNA i onkogeny, mogą również powodować starzenie się3. Starzenie się spowodowane czynnikami innymi niż wyczerpanie telomerów jest często nazywane starzeniem się wywołanym stresem lub przedwczesnym starzeniem i generalnie zależy od szlaku p16INK4A/Rb5. Chociaż proliferujące, nieprzekształcone komórki zwykle mają kształt wrzecionowaty, komórki starcze można zidentyfikować jako posiadające pewne cechy, w tym płaską, dużą morfologię i zwiększoną aktywność β-galaktozydazy związaną ze starzeniem się (SA-β-gal) (ryc. 1 i 2). Starzejące się komórki gromadzą również markery uszkodzenia DNA, w tym γ-H2AX (Figura 3) 6 i, potencjalnie, ogniska heterochromatyny związane ze starzeniem się (SAHF) (Figura 4) 7. Starzejące się komórki mają wyższe poziomy regulatorów cyklu komórkowego, w tym p16 (p16INK4A) i/lub p21 i p53 (ryc. 5)8,9. Co więcej, ostatnie dane wykazały, że komórki starcze mogą mieć nieautonomiczne działanie poprzez wydzielanie szeregu prozapalnych cytokin i chemokin zwanych fenotypem wydzielniczym związanym ze starzeniem się (SASP)10. Chociaż to zjawisko SASP może się różnić w zależności od typu komórki, ogólnie rzecz biorąc, przejawia się między innymi wzrostem interleukiny-6 (IL-6), IL-8, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), α onkogenu regulowanego wzrostem (GRO-α) i GRO-β (Figura 6). Szczególny stres lub uszkodzenie, które wywołuje starzenie się, może również wpływać na fenotyp wydzielniczy11,12,13. SASP można wykryć, mierząc poziomy wydzielanych białek za pomocą testów ELISA lub tablic cytokin/białek10,14. Chociaż mechanizmy potranskrypcyjne mogą regulować poziom białka SASP11,15,16,17, w wielu przypadkach można również wykryć zmiany w poziomach mRNA. Zmiany te są na ogół bardziej czułe i łatwiejsze do ilościowego określenia niż pomiary poziomu białka. Można również ocenić inne markery starcze, w tym trwałe ogniska jądrowe uszkodzenia DNA, zwane segmentami DNA ze zmianami chromatyny wzmacniającymi starzenie się (DNA-SCARS)18, oraz różne inne markery3,19,20.

Tutaj opisujemy popularne techniki wywoływania starzenia się komórek w hodowli, a także pomiaru kilku markerów starzenia, w tym SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF oraz białka i mRNA cząsteczek związanych ze starzeniem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wywoływanie starzenia replikacyjnego

  1. Rozmrozić ludzkie diploidalne fibroblasty o niskim pasażu (np. WI-38 i IMR-90) lub inne linie komórkowe.
    UWAGA: W tym przypadku użyto ludzkich diploidalnych fibroblastów, ale protokoły te można wykorzystać do oceny starzenia się innych typów komórek, takich jak śródbłonkowe, nabłonkowe lub mezenchymalne komórki macierzyste. Warunki hodowli mogą być zoptymalizowane dla różnych typów używanych komórek ze względu na różne tempo wzrostu lub warunki wzrostu.
    UWAGA: Komórki powinny się rozmnażać i mieć morfologię wrzeciona (patrz rysunek 1 dla schematu i rysunek 2 dla przykładów). Idealnie byłoby, gdyby komórki miały poziom podwojenia populacji (PDL) wynoszący <30 na początku eksperymentów, aby uniknąć ewentualnych replikacyjnych komórek starczych.
    1. Oblicz PDL komórek, używając następującego równania PDL = log(Nf/N0)/log2, gdzie Nf to ostateczny numer komórki, a N0 to początkowa liczba komórek rozsianych21.
  2. Hodowla komórek WI-38 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% aminokwasów endogennych i 1% penicyliny/streptomycyny.
  3. Hoduj komórki IMR-90 w DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
  4. Hoduj wszystkie komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Stale hoduj komórki i dziel co 2 - 4 dni, gdy komórki osiągną ~ 70 - 80% konfluencji. Monitoruj zbieg komórek za pomocą mikroskopu świetlnego. Unikaj komórek o większej konfluencji, ponieważ może to wpływać na wzrost komórek z powodu hamowania kontaktu.
  5. Monitoruj komórki pod mikroskopem świetlnym pod kątem morfologicznego wyglądu komórek starczych (patrz ryc. 1 i 2) oraz kiedy nie ma zmian w PDL z jednej subkultury na drugą.

2. Starzenie się wywołane uszkodzeniem DNA

  1. Komórki płytki (np. WI-38, IMR-90 lub inny typ komórek) o rzadkiej gęstości (tj. ~300 000 komórek/6 cm szalka) w odpowiednim naczyniu do rodzaju analizy (tj. 6-centymetrowej szalce do barwienia białka/RNA lub 6-dołkowej szalce do barwienia SA-β-gal). Użyj komórek wczesnego pasażu, które są młode i proliferujące (<30 PDL) i umieść je tak, aby komórki były w około 50 - 60% zlewające się następnego dnia.
  2. Usuń pożywkę wzrostową za pomocą szklanej pipety podłączonej do próżni i umyj komórki, dodając 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania. Dodaj cienką warstwę PBS (~ 750 μL dla naczynia o średnicy 6 cm) zarówno dla stanu "pozorowanego", jak i dla stanu poddanego działaniu promieniowania jonizującego (IR).
  3. Użyj promiennika promieniowania gamma, aby wystawić komórki na pojedynczą dawkę 10 Grayów (Gy) podczerwieni; jest to typowa ekspozycja dla większości linii komórkowych. W kapturze wyjmij PBS i zastąp go pożywką wzrostową. Alternatywnie potraktuj komórki bleomycyną w dawce 20 μg/ml przez 2 godziny.
  4. Zmieniaj pożywkę na komórkach co 48 -7 2 h i w razie potrzeby podziel komórki.
  5. Monitorować komórki pod mikroskopem świetlnym pod kątem zmian morfologicznych (patrz rysunek 1 dla schematu i rysunek 2 dla reprezentatywnych obrazów komórek) i oznaczyć markery starcze 7 - 10 dni po leczeniu IR.
    UWAGA: Ten protokół opisuje starzenie się wywołane przez IR. Starzenie się może być również wywołane przez inne stresy, w tym bleomycynę (warunki patrz wyżej), H2O222,23, leki chemioterapeutyczne24, dym papierosowy25, transformujący czynnik wzrostu (TGF)-β126,27, oraz inne metody21,28,29.

3. Barwienie komórek pod kątem β-galaktozydazy związanej ze starzeniem

  1. Przed barwieniem zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby monitorować zmiany morfologiczne.
    UWAGA: Komórki starcze są zazwyczaj powiększone i płaskie, w przeciwieństwie do komórek proliferujących, które mają morfologię wrzeciona (patrz rysunek 1 dla schematu i rysunek 2 dla reprezentatywnych wyników). Komórki proliferujące mogą być stosowane jako kontrola negatywna, a komórki traktowane IR lub innym czynnikiem uszkadzającym DNA (patrz sekcja 2) mogą być używane jako kontrole pozytywne.
  2. Określ ilościowo aktywność SA-β-gal za pomocą odczynników z zestawu dostępnego w handlu (patrz tabela materiałów). Rozmrozić wszystkie odczynniki i doprowadzić je do temperatury pokojowej, podgrzewając je do 37 °C.
    1. Oblicz ilość niezbędnego roztworu barwiącego i roztworu utrwalającego.
      UWAGA: Zazwyczaj objętość 1 ml wystarcza na jeden dołek w płytce 6-dołkowej. Można stosować płytki o różnych rozmiarach, ale płytki 6-dołkowe dobrze nadają się do wykonania testu w trzech egzemplarzach dla każdego stanu. Ta gęstość zwykle zapewnia wystarczającą liczbę komórek na pole do zliczenia bez użycia nadmiernej liczby komórek.
    2. Rozcieńczyć roztwór barwiący w stosunku 1:10 wodą destylowaną.
    3. Rozcieńczyć roztwór utrwalający w stosunku 1:10 wodą destylowaną.
    4. Uzupełnić 20x roztwór podstawowy X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd) w N,N-dimetyloformamidzie (DMF; np. 20 mg X-gal w 1 ml DMF). Aby zmaksymalizować wykorzystanie zestawu, odmierz X-gal do ilości potrzebnej do każdego testu, a następnie dodaj obliczoną ilość DMF do rozpuszczenia. Alternatywnie, roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze -20 °C w probówce zabezpieczonej przed światłem przez jeden miesiąc. Do rozcieńczania i przechowywania roztworów X-gal należy używać wyłącznie probówek polipropylenowych (nieprzezroczystych).
    5. Przygotuj roztwór barwiący o β galonach: 930 μl 1x roztwór barwiący, 10 μl suplementu barwiącego A, 10 μl suplementu barwiącego B i 50 μl 20 mg/ml X-gal w DMF. Przygotuj mieszankę wzorcową w zależności od tego, ile studzienek należy zabarwić.
  3. Ostrożnie usunąć pożywkę z komórek za pomocą pipety transferowej lub jej odpowiednika.
  4. Delikatnie umyj komórki raz za pomocą 1x PBS o temperaturze pokojowej.
  5. Dodać 1 ml 1x roztworu utrwalającego do każdej studzienki i inkubować przez 10 - 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć roztwór utrwalający za pomocą pipety transferowej.
    UWAGA: Roztwór utrwalający (1x) zawiera 2% formaldehydu i 0,2% aldehydu glutarowego i powinien być utylizowany jako odpad niebezpieczny zgodnie z zaleceniami biura bezpieczeństwa laboratorium.
  7. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie za pomocą 1x PBS.
  8. Całkowicie usuń PBS i dodaj 1x β-galonowy roztwór barwiący do studzienek (1 ml / dołek 6-dołkowej płytki). Całkowicie przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować przez 24 - 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C (najlepiej przy braku CO2 , ponieważ może to obniżyć pH buforu i wpłynąć na barwienie).
    1. Sprawdź komórki po 24 godzinach pod kątem barwienia, a jeśli plama jest zbyt jasna, inkubuj przez kolejne 24 godziny.
  9. Po czasie inkubacji usuń roztwór β-galon i zastąp go 1x PBS.
    UWAGA: Ten krok usuwa część koloru tła podczas obrazowania, a także zapobiega niebezpiecznemu rozlaniu roztworu X-gal.
    UWAGA: Roztwór β-galonów należy zutylizować prawidłowo, zgodnie z zaleceniami laboratoryjnego biura bezpieczeństwa.
  10. Zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym za pomocą dołączonej kamery przy użyciu obiektywu 10x lub większego; Komórki SA-β-gal-dodatnie będą niebieskie. Uzyskaj żądaną liczbę obrazów do eksperymentu. W przypadku liczenia procentu komórek SA-β-gal-dodatnich należy uzyskać odpowiednią liczbę obrazów (>5) do oznaczania ilościowego na studzienkę. Upewnij się, że obrazy nie nakładają się na siebie z różnych pól widzenia w każdej studzience.
  11. Policz liczbę komórek SA-β-gal-dodatnich (niebieskich) w porównaniu z liczbą wszystkich komórek, aby obliczyć procent komórek SA-β-gal-dodatnich. Policz >100 komórek na warunek.
    UWAGA: Reprezentatywne zdjęcia mogą być również używane do rysunków. Należy pamiętać, że zbieganie się komórek ma kluczowe znaczenie podczas liczenia komórek, ponieważ zbyt wiele komórek utrudnia różnicowanie każdej komórki, a zbyt mała liczba może nie dać wystarczającej liczby komórek do kwantyfikacji i statystyki. Zdjęcia do rycin do publikacji mają najlepszą rozdzielczość, jeśli są zapisane jako pliki .tiff, chociaż odpowiednie są również pliki .jpeg. Obrazy kolorowe powinny mieć rozdzielczość 300 dpi.

4. Barwienie komórek dla γ-H2AX

  1. Umieścić komórki z sekcji 1 lub 2 na szklanych szkiełkach nakrywkowych na płytce 24-dołkowej.
  2. Następnego dnia umyj komórki 1x PBS. Dokładnie spłucz, ponieważ komórki starcze nie przylegają dobrze do szkiełek nakrywkowych i można je łatwo usunąć podczas prania. Alternatywnie bezpośrednio przymocuj komórki bez mycia.
  3. Usunąć PBS i utrwalić komórki świeżo przygotowanym 3,7% formaldehydem w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć roztwór i przepuszczać komórki 0,2% Triton X-100 w PBS przez 10 minut.
  5. Usuń roztwór i zablokuj 5% FBS w PBS przez 2 godziny w RT.
  6. Inkubować z anty-fosfo γ-H2AX (Ser139) i koniugatem FITC w 5% FBS/PBS przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub O/N w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem.
  7. Prać 3 - 6x PBS w temperaturze 37 °C, łącznie 30 - 60 min.
  8. Barwieć DAPI (rozcieńczonym w stosunku 1:15 000 w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Umyj 3x PBS.
  10. Szybko umyj wodą, aby usunąć sole i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą 3 - 5 μl odczynnika zapobiegającego blaknięciu. Alternatywnie można użyć rozwiązania montażowego zawierającego DAPI.
  11. Pozostaw do wyschnięcia O/N i zwizualizuj wybarwione komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym przy użyciu obiektywu 63X lub wyższego.
  12. Określ ilościowo ogniska γ-H2AX przy użyciu jednej z dwóch metod opisanych poniżej. Oceń dowolny protokół na oko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Najlepiej użyć mikroskopu konfokalnego. Weź przekroje Z i skondensuj w jednej płaszczyźnie w celu wizualizacji wszystkich wykrywalnych ognisk (reprezentatywne obrazy barwienia γ-H2AX w komórkach proliferujących i starczych pokazano na rysunku 3). Policz ogniska na oko za pomocą oprogramowania do obrazowania; Ogólnie rzecz biorąc, do liczenia wystarcza ~100 - 200 jąder.
    1. Aby określić ilościowo procent komórek, które mają ogniska γ-H2AX-dodatnie, policz każdą komórkę, która ma widoczne co najmniej jedno ognisko i podziel przez całkowitą liczbę jąder barwionych DAPI.
    2. Aby określić ilościowo liczbę ognisk γ-H2AX, policz ogniska γ-H2AX na komórkę.
      UWAGA: Poziomy γ-H2AX mogą się różnić w zależności od konkretnego stresora lub uszkodzenia, które wywołało starzenie się.

5. Barwienie komórek dla markerów SAHF

UWAGA: Ludzkie komórki starcze często mają jądrowe regiony skondensowanego DNA/chromatyny. Uważa się, że w komórkach starczych te heterochromatyczne regiony hamują ekspresję genów promujących proliferację, takich jak członkowie rodziny E2F. SAHF może być wizualizowany przez reorganizację DAPI; przez obecność znaczników histonów związanych z heterochromatyną, w tym di- i trimetylację Lys9 na histonie H3 (H3K9Me2 i H3K9Me3); oraz przez białka reorganizujące chromatynę, w tym białko heterochromatyny HP-1 1 (HP1), HIRA (represor histonów A) i ASF1a (funkcja antywyciszająca-1a) do chromatyny30. Zdecydowaliśmy się użyć modelu starzenia się wywołanego onkogenem (OIS), ponieważ SAHF jest bardziej widoczny w modelach OIS30. Komórki IDH4 namnażają się w obecności deksametazonu ze względu na obecność dużego antygenu T SV40, ale starzeją się po usunięciu deksametazonu z klasy medium31. SAHF można wykryć za pomocą barwienia DAPI i barwienia przeciwciałami przeciwko specyficznym markerom wymienionym powyżej. Tutaj opisujemy barwienie DAPI i H3K9Me2 w celu wizualizacji SAHF w komórkach28.

  1. Hoduj komórki IDH4 w DMEM uzupełnione 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1 μg/ml deksametazonu. Aby wywołać starzenie się, należy usunąć deksametazon i zmienić pożywkę tak, aby zawierała FBS pozbawiony węgla drzewnego; po wzroście przez ~10 dni w tym nowym podłożu, komórki IDH4 stają się stare31.
  2. Płytki IDH4 lub komórki z sekcji 1 lub 2, opisane powyżej, na szklanych szkiełkach nakrywkowych w płytce 24-dołkowej.
  3. Następnego dnia umyj komórki 1x PBS. Dokładnie spłucz, ponieważ komórki starcze nie przylegają dobrze do szkiełek nakrywkowych i można je łatwo usunąć podczas prania. Alternatywnie, bezpośrednio napraw komórki bez mycia.
  4. Usunąć PBS i utrwalić komórki świeżo przygotowanym 3,7% formaldehydem w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj komórki 3 razy za pomocą 1x PBS.
  6. Usunąć roztwór i przepuszczać komórki 0,2% Triton X-100 w PBS przez 5 minut.
  7. Umyj komórki 1x PBS. Usunąć PBS i zablokować szkiełka nakrywkowe, dodając bufor blokujący zawierający 3% BSA (w/v) w PBS przez 5 minut w temperaturze suchej at. Przed użyciem należy zawsze przefiltrować roztwory zawierające BSA w celu usunięcia cząstek stałych.
  8. Usuń bufor blokujący i inkubuj komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko markerom SAHF, takim jak przeciwciała anty-H3KMe2 (Figura 4; szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów). Rozcieńczyć przeciwciała w buforze blokującym i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
  9. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć szkiełka nakrywkowe 3 razy 1% (v/v) Triton X-100 w PBS.
  10. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w buforze blokującym (tabela materiałów) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.
  11. Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS. Barwienie DAPI (rozcieńczone w stosunku 1:15 000 w PBS; patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Umyj szkiełka nakrywkowe 3x za pomocą 1x PBS.
    1. Szybko umyj wodą, aby usunąć sole i zamontuj każde szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą 3 - 5 μl odczynnika zapobiegającego blaknięciu. Alternatywnie można użyć rozwiązania montażowego zawierającego DAPI.
    2. Pozostaw do wyschnięcia O/N i uwidocznij wybarwione komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym przy użyciu obiektywu 63X lub wyższego (patrz reprezentatywne wyniki na rysunku 4). Określić ilościowo SAHF zgodnie z opisem w sekcji 4.
      UWAGA: Jako kontrolę ujemną do barwienia immunofluorescencyjnego należy stosować przeciwciała pierwszorzędowe kontrolne izotypu lub brak przeciwciał pierwszorzędowych (tj. samo przeciwciała drugorzędowe) w celu barwienia immunofluorescencyjnego.

6. Analiza białek związanych ze starzeniem się za pomocą immunoblottingu

UWAGA: Fenotyp starzenia się charakteryzuje się regulacją w górę regulatorów cyklu komórkowego, w tym p16INK4A, p21 i p53. Protokół ten będzie opisywał ilościowe określenie poziomów tych białek w lizatach komórkowych. Techniki te mogą być używane do oceny starzenia się wywołanego przy użyciu różnych metod21,28,29.

  1. Wywołaj starzenie komórkowe zgodnie z opisem w sekcjach 1 i 2 lub za pomocą innej metody21,28,29. Aby przeanalizować markery starzenia się komórek, umieść komórki w 6-centymetrowych szalkach i jednocześnie analizuj zarówno białko, jak i RNA (patrz sekcja 7, aby uzyskać instrukcje dotyczące izolacji RNA).
  2. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych. Ułóż komórki na tacy z lodem.
    1. Umyj komórki 2 razy zimnym 1x PBS. Przechyl czaszę, aby upewnić się, że cały PBS jest zasysany, tak aby był równie precyzyjny pod względem objętości użytych do zabiegu.
    2. Po zaessaniu ostatniego prania PBS należy dodać do naczynia 200 μL zimnego 1x PBS (na naczynie o średnicy 6 cm). Zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek.
    3. Odpipetować mieszaninę komórka/PBS do probówki wolnej od RNaz w celu izolacji RNA. Pobrać około 150 μl tej mieszaniny i odpipetować ją do nowej probówki. Ta podwielokrotność zostanie użyta do analizy białka, więc upewnij się, że pipetujesz tę samą ilość z każdej probówki.
  3. Poddać komórki lizie, dodając 75 - 100 μl zmodyfikowanego 2x buforu próbki Laemmli (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 12,5% glicerolu, 2% SDS, 5% β-merkaptoenolu (BME) i błękitu bromofenolowego; może być uzupełniony jako duża partia, podzielony i przechowywany w temperaturze -20 °C do momentu użycia) lub równoważny bufor próbki.
    1. Alternatywnie, poddać komórki lizie w 75 - 100 μl buforu do lizy i odwirować przy 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Usunąć supernatant i pipetę do czystej probówki. Test białka Bradforda lub równoważny test białka może być stosowany na lizatach, aby zapewnić równomierne obciążenie białka.
      UWAGA: Testów białkowych nie można przeprowadzać na próbkach zlizowanych w buforze próbek.
    2. Wyjmij ~25 μL lizatu i dodaj go do 15 μL 2x buforu do próbki. Pipetować w górę i w dół w buforze próbki, aby zlizować komórki.
      UWAGA: Objętości buforu do lizy lub buforu próbki można dostosować w zależności od konfluencji komórek. Jeśli próbka jest "lepka" z powodu lizy jądrowej, dodaj więcej buforu próbki lub PBS w celu rozcieńczenia. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  4. Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym (lub równoważnym urządzeniu) i załadować ~40 μl zlizowanej próbki do buforu próbki na 18% żelu tris-glicyny.
    UWAGA: Żel gradientowy (4-15%) lub żel 14% Tris-Glycine są również wystarczające do wykrywania białek o niskiej masie cząsteczkowej. Można również stosować różne rodzaje żeli akrylowo-akrylamidowych, ale należy upewnić się, że żele i system są odpowiednie do wykrywania białek o niskiej masie cząsteczkowej.
    1. Uruchom przy użyciu 1x bufora roboczego przy stałym napięciu 100 V przez 20 minut (przez żel do układania) i ~ 60 minut przy 180 V. Monitoruj żel tak, aby przód barwnika po prostu spływał lub znajdował się na dnie żelu, aby białka o niskiej masie cząsteczkowej nie spływały z żelu.
  5. Przenieś żel akrylowy na membranę PVDF (wstępnie nasączoną 100% metanolem w celu aktywacji). W przypadku transferu na mokro potrzeba tylko 1 godziny na transfer (w porównaniu z normalnym ~1,75 godziny). Dostosuj odpowiednio do odpowiedniego systemu przenoszenia; Stosowanie wstępnie wybarwionych markerów masy cząsteczkowej może pomóc w ocenie wydajności transferu.
  6. Umyj membranę w wodzie. Użyj barwienia Pąs, aby monitorować równomierne obciążenie próbek. Zmyj Pąs wodą.
    1. Zablokować membranę w 5% beztłuszczowym mleku w proszku w TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl i 0,1% Tween-20) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C z mieszaniem.
  7. Przemyć osuszyć raz TBST i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 5% mleku TBST (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania rozcieńczeń i zaleceń dotyczących przeciwciał) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Wykonaj dwa szybkie mycia TBST, a następnie umyj dwa razy na shakerze, co daje łącznie ~30 min (~15 min każde pranie).
  9. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć krok 6.10.
  10. Inkubować ze świeżo przygotowanym substratem Western blot i wywołać film lub odczytać go na czytniku chemiluminescencyjnym.
  11. Najpierw zbadaj immunoblot przeciwciałamip16 INK4A (ryc. 5). Usunąć błonę przez inkubację przez 15 minut z wodą, 15 minut z 0,2 N NaOH i 15 minut z wodą. Kontynuuj krok 6.9 przy użyciu przeciwciał anty-p21.
  12. Usunąć membranę za pomocą 62,5 mM Tris-HCL o pH 6,8 i 2% SDS z 300 μl świeżo dodanego BME na 50 ml roztworu do usuwania izolacji.
  13. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut i dokładnie przemyć TBS, a następnie TBST. Sonda z przeciwciałami anty-aktynowymi lub anty-GAPDH do kontroli obciążenia białkami (ryc. 5 pokazuje reprezentatywne wyniki).
    UWAGA: Poziomy p53 można również ocenić na tych samych membranach. Ponieważ jednak p53 ma wyższą masę cząsteczkową, lepiej rozpuszcza się na żelu o niższej zawartości procentowej (np. 10% tris-glicyny lub żelu gradientowym (4-15%)). Poziomy białek innych markerów starczych można również ocenić za pomocą lizatów immunoblottingowych, w tym markerów γ-H2AX i SAHF.

7. Analiza poziomów mRNA markerów starzenia

UWAGA: Podczas izolowania RNA upewnij się, że powierzchnie robocze są czyszczone roztworami do usuwania RNaz lub równoważnymi i że wszystkie materiały są wolne od RNaz.

  1. Używając mieszaniny komórka/PBS z kroku 4.2, dodaj 1 ml roztworu do ekstrakcji RNA i wiruj przez 30 s (nie powinno być widocznych grudek ani resztek komórkowych).
  2. Dodaj 200 μl chloroformu i energicznie wstrząsaj przez 15 s.
  3. Wirować z maksymalną prędkością (>15 000 x g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Usuń ~400 μL wierzchniej warstwy wodnej RNA i odpipetuj ją do nowej probówki do mikrofuge.
  5. Do warstwy RNA dodać 400 μl izopropanolu (1:1 przy całkowitej objętości warstwy wodnej odpipetowanej w poprzednim kroku) i 4 μl środka strącającego.
  6. Wirować przez 15-30 minut przy maksymalnej prędkości (>15 000 x g) i temperaturze 4 °C w celu osadzenia RNA.
  7. Usuń supernatant i dodaj 1 ml 75% lodowatego etanolu.
  8. Wirować przez 1 minutę przy maksymalnej prędkości (>15 000 x g) i temperaturze 4 °C.
  9. Usunąć supernatant i odwirować przez 1 minutę przy maksymalnej prędkości (>15 000 x g) i temperaturze 4 °C.
  10. Odpipetować jak najwięcej płynu i suszyć na powietrzu przez 2 minuty.
  11. Ponownie zawiesić w 10 μl 10x buforu DNazy, 85 μlH2Oi 5 μl DNazy 1.
  12. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  13. Dodać 200 μl buforu NT2 (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 i 0,05% nonidetu P-40) i dodać 300 μl dolnej warstwy kwaśnego fenolu-CHCl2.
  14. Wirować przez 1 minutę i wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z maksymalną prędkością (>15 000 x g).
  15. Zebrać 250 μl górnej warstwy RNA (2 x 125 μL), dodać 25 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2, 625 μl 100% lodowatego etanolu i 5 μl środka strącającego. Dobrze wymieszać i wytrącić O/N w temperaturze -20 °C.
  16. Następnego dnia wymieszać i wirować z maksymalną prędkością (>15 000 x g) i w temperaturze 4 °C przez 30 minut, a supernatant wyrzucić.
  17. Powtórz kroki 6.8-6.11.
  18. Zawiesić osad w 12 μl wody wolnej od nukleaz i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Można również zastosować inne procedury i zestawy do izolacji RNA.
  19. Wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą losowych heksamerów i odwrotnej transkryptazy SSII zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę niewielką ilość RNA wyizolowanego z komórek starczych, najlepiej jest użyć całego RNA (12 μL) do syntezy odwrotnej transkrypcji. Alternatywnie, RNA można określić ilościowo za pomocą spektrofotometru, a równe ilości RNA można użyć do odwrotnej transkrypcji.
  20. Analizuj poziomy mRNA za pomocą ilościowej amplifikacji qPCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) i głównej mieszanki SYBR-green PCR ze starterami specyficznymi dla genów.
    1. Podobnie jak w typowej reakcji RT-qPCR, rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:30 (w wodzie wolnej od RNazy/DNazy) i dodać 3 μl do 96-dołkowej płytki w czasie rzeczywistym, aby uzyskać lepszą dokładność pipetowania. Przygotuj główną mieszankę reakcji specyficznych dla genu starterów do przodu i do tyłu (stężenie 2,5 μM, dodać 5 μl/reakcję), mieszaninę SYBR-green PCR (6,25 μl/reakcję; użyć mniej niż zalecane przez producenta) i 5,75 μl wody wolnej od RNazy/DNaz dla końcowej objętości reakcji 20 μL (17 μl starterów/SYBR-green/woda i 3 μL cDNA).
    2. Wykonaj amplifikację RT-qPCR za pomocą maszyny do PCR w czasie rzeczywistym; postępuj zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Listę zweryfikowanych przez człowieka starterów do przodu i do tyłu w czasie rzeczywistym można znaleźć w Tabeli 1. Geny te obejmują białka SASP i inne markery i/lub geny związane ze starzeniem się. Reprezentatywne wyniki starzenia się wywołanego podczerwienią przedstawiono na rycinie 6.

8. Kwantyfikacja poziomów białka SASP

  1. Wywołać starzenie się za pomocą sekcji 1 lub 2 lub innej metody. Umieść komórki na płytkach o średnicy 6 lub 10 cm, jak opisano powyżej (~250 000 komórek/płytka 6 cm lub płytka ~650 000/10 cm).
  2. Albo z komórkami 10 d po podczerwieni, albo z replikacyjnymi komórkami starczymi (i odpowiednimi komórkami kontrolnymi), przemyj komórki trzykrotnie 1x PBS i dodaj pożywkę bez surowicy z antybiotykami w małej objętości (2,5 ml na 6 cm lub 5 ml na 10 cm).
  3. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnego dnia zbierz podłoże i umieść je w stożkowej tubie na lodzie.
  4. Umyj komórki 2 razy PBS, a następnie dodaj 1 ml trypsyny (na 6 cm naczynie). Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby później dostosować stężenia zgodnie z liczbą komórek.
  5. Odwirowywać pożywkę przez 5 minut przy 300 x g.
  6. Przefiltrować pożywkę za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
  7. Podwielokrotnić pożywkę i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu użycia lub bezpośredniego oznaczenia przy użyciu testu ELISA lub równoważnych testów.
  8. Obliczyć liczbę komórek/ml stężenia, biorąc całkowitą liczbę komórek/objętość zebranego podłoża.
  9. Wykonaj odpowiedni test immunoenzymatyczny (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z zalecanymi zestawami ELISA do oznaczania IL-6, IL-8, GROα i innych cytokin/chemokin (Figura 6B).
  10. Aby upewnić się, że mierzone czynniki mieszczą się w zakresie liniowym zestawu ELISA, należy rozcieńczyć pożywkę komórek starczych w porównaniu z pożywką komórek proliferujących. Uwzględnij te rozcieńczenia i objętość przy obliczaniu ilości IL-6. Aby uzyskać ilość IL-6 wydzielaną na komórkę dziennie, należy obliczyć wartość IL-6 uzyskaną z zestawu (w pg) na stężenie rozcieńczonej komórki na ml (z kroku 7.8).
    UWAGA: Inne metody, takie jak macierze cytokin, mogą być stosowane do wykrywania poziomów białka SASP i mogą być odpowiednie do badań przesiewowych dużej liczby czynników SASP. Poziomy białek czynników SASP mogą się różnić w zależności od czasu po indukcji starzenia, typu komórki lub rodzaju wywołanego starzenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki 2 - 6 pokazują reprezentatywne wyniki barwienia SA-β-gal; barwienia na γ-H2AX i SAHF; oceny poziomów białek p16,INK4A, p21 i p53; oraz poziomów mRNA i białek cząsteczek związanych ze starzeniem się. Zwiększone barwienie SA-β-gal występuje przy starzeniu się replikacyjnym i wywołanym uszkodzeniem DNA. Obserwuj także zmiany morfologiczne, które zachodzą wraz ze starzeniem się. Komórki stają się powiększone i płaskie w porównaniu z wrzecionowatym wyglądem ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisaliśmy metody starzenia się wywołanego replikacją i uszkodzeniem DNA przy użyciu ludzkich fibroblastów diploidalnych. Ponadto uwzględniono techniki ilościowego określania poziomów białek i mRNA różnych białek związanych ze starzeniem się, a także barwienia SA-β-gal i markera uszkodzenia DNA γ-H2AX. Protokoły te mogą być szeroko stosowane do oceny fenotypów starzenia się zarówno in vitro, jak i in vivo, chociaż istnieje wiele zastrzeżeń dotyczących charakteryzowania starzenia się in...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute on Aging. Autorzy pragną podziękować Myriam Gorospe i Kotbowi Abdelmohsenowi za wiele pomocnych dyskusji na temat starzenia się, a Kotb Abdelmohsen za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy również naszym pracownikom laboratorium, a w szczególności Douglasowi Dluzenowi za krytyczną lekturę manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% żele tris-glicynoweInvitrogenXP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3AmbionAM9720
Alexa-Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysieInvitrogenA110311:300 rozcieńczenie
Podnośniki komórekCorning Inc.3008Skrobak do komórek
ECL przeciwciało przeciw mysim HRPAmershamNA931V
ECL Plus Western BlottingSubstrate Pierce32132
Sondy molekularneDAPIMP01306magazynie 5 mg / ml w dH2O
Przeciwciało GAPDHSanta Cruzsc-322331:1,000 - 5,000 rozcieńczenie
GlycoBlueAmbionAM9515
Przeciwciało monoklonalne histonowe H3 dimetylo K9Abcam12201:500 rozcieńczenie
ludzki IL-6 Kwantykine test ELISAR& Systemy DD6050
Test ELISA u ludzi IL-8 QuantikineR& Systemy DD8000C
Test Human GROa Quantikine ELISAR& Systemy DDRG00
N-N-dimetyloformamid SigmaD4551DMF
p16 przeciwciało monoklonalneBD Biosciences51-1325gr1:500 rozcieńczenie
p21 przeciwciało monoklonalneMillipore05-3451:750 rozcieńczenie
p53 przeciwciało monoklonalneSanta Cruzsc-1261:500 klon rozcieńczający DO-1
fosfo-H2AX (Ser139) Przeciwciało sprzężone FITCSygnalizacja komórkowa97191:2,000 rozcieńczenie
POWER SYBR-green PCR master mix Applied Biosystems4367659
Wstępnie barwione markery masy cząsteczkowejBiorad161-0374
ProLong Gold Antiblade InvitrogenP36930
 Thermo Scientific88518
Zestaw do barwienia starzenia i beta;-galaktozydazySygnalizacja komórkowa9860
TRIzolAmbion/Life Tech10296028
ECLMembrana PVDF

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  2. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  3. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
  4. Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
  5. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  6. Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
  7. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  8. Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
  9. Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
  10. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  11. Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
  12. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
  13. Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
  14. Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
  15. Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
  16. Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
  17. Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
  18. Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
  19. Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
  20. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  21. Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
  22. Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
  23. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
  24. Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  25. Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
  26. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  27. Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
  28. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
  29. Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
  30. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
  31. Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
  32. Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
  33. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
  34. Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
  35. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  36. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  37. Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  38. Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
  39. Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
  40. Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
  41. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
  42. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  43. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  44. Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
  45. Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
  46. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  47. Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cellular SenescenceSenescence InductionSA gal StainingGamma IrradiationDNA DamageSASP QuantificationRT qPCR AnalysisELISA DetectionSenescence MarkersCell Cycle Arrest

Related Articles