Artykuł metodologiczny

Analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55536

⸱

3 lipca 2017

 ,  , 
1Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, INSERM U786, Institut Pasteur, 2Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Laboratory of Intestinal Immunity, Institut Imagine-INSERM UMR 1163, Université Paris Descartes-Sorbonne Paris Cité

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę jakościowej i ilościowej analizy tworzenia się granulek stresu w komórkach ssaków po tym, jak komórki są wystawione na działanie bakterii i wielu różnych stresów. Protokół ten można zastosować do badania odpowiedzi granulek stresu komórkowego w szerokim zakresie interakcji gospodarz-bakteria.

Streszczenie

Obrazowanie fluorescencyjne komponentów komórkowych jest skutecznym narzędziem do badania interakcji gospodarz-patogen. Patogeny mogą wpływać na wiele różnych cech zakażonych komórek, w tym ultrastrukturę organelli, organizację sieci cytoszkieletu, a także procesy komórkowe, takie jak tworzenie granulek stresu (SG). Scharakteryzowanie tego, w jaki sposób patogeny zakłócają procesy gospodarza, jest ważną i integralną częścią dziedziny patogenezy. Podczas gdy zmienne fenotypy mogą być łatwo widoczne, dokładna analiza jakościowych i ilościowych różnic w strukturach komórkowych wywołanych przez prowokację patogenem jest niezbędna do zdefiniowania statystycznie istotnych różnic między próbkami eksperymentalnymi i kontrolnymi. Powstawanie SG jest ewolucyjnie konserwatywną reakcją na stres, która prowadzi do odpowiedzi przeciwwirusowych i od dawna jest badana przy użyciu infekcji wirusowych1. Powstawanie SG wpływa również na kaskady sygnalizacyjne i może mieć inne, wciąż nieznane konsekwencje2. Charakterystyka tej reakcji na stres na patogeny inne niż wirusy, takie jak patogeny bakteryjne, jest obecnie nowym obszarem badań3. Na razie ilościowa i jakościowa analiza powstawania SG nie jest jeszcze rutynowo stosowana, nawet w systemach wirusowych. Tutaj opisujemy prostą metodę indukowania i charakteryzowania powstawania SG w komórkach niezakażonych oraz w komórkach zakażonych cytozolowym patogenem bakteryjnym, który wpływa na powstawanie SG w odpowiedzi na różne stresy egzogenne. Analiza powstawania i składu SG jest osiągana przy użyciu wielu różnych markerów SG i wtyczki detektora punktowego ICY, narzędzia do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym.

Wprowadzenie

Wizualizacja interakcji gospodarz-patogen na poziomie komórkowym jest potężną metodą uzyskiwania wglądu w strategie patogenne i identyfikowania kluczowych ścieżek komórkowych. Rzeczywiście, patogeny mogą być wykorzystywane jako narzędzia do wskazywania ważnych celów lub struktur komórkowych, ponieważ patogeny ewoluowały, aby obalić centralne procesy komórkowe jako strategię własnego przetrwania lub rozmnażania. Wizualizację składników komórkowych można osiągnąć poprzez rekombinowaną ekspresję znakowanych fluorescencyjnie białek gospodarza. Chociaż pozwala to na analizę w czasie rzeczywistym, generowanie linii komórkowych ze specjalnie oznakowanymi białkami gospodarza jest bardzo pracochłonne i może powodować niepożądane skutki uboczne. Wygodniejsze jest wykrywanie czynników komórkowych za pomocą określonych przeciwciał, ponieważ wiele czynników gospodarza może być analizowanych jednocześnie i jeden nie jest ograniczony do określonego typu komórki. Wadą jest to, że można uchwycić tylko widok statyczny, ponieważ analiza immunofluorescencyjna wymaga utrwalenia komórek gospodarza. Jednak ważną zaletą obrazowania immunofluorescencyjnego jest to, że łatwo poddaje się analizie zarówno jakościowej, jak i ilościowej. To z kolei może być wykorzystane do uzyskania statystycznie istotnych różnic, aby dostarczyć nowych informacji na temat interakcji gospodarz-patogen.

Programy do analizy obrazów fluorescencyjnych są potężnymi narzędziami analitycznymi do przeprowadzania analiz 3D i 4D. Jednak wysoki koszt oprogramowania i jego utrzymania sprawia, że metody oparte na darmowym oprogramowaniu open source stają się coraz bardziej atrakcyjne. Dokładna analiza obrazu za pomocą oprogramowania do analizy biologicznej jest cenna, ponieważ potwierdza analizę wizualną, a przy przypisywaniu istotności statystycznej zwiększa pewność co do poprawności danego fenotypu. Wcześniej SG były analizowane za pomocą darmowego oprogramowania ImageJ, co wymagało ręcznej identyfikacji poszczególnych SGs4. W tym miejscu przedstawiamy protokół indukcji i analizy tworzenia się komórkowego SG w kontekście infekcji bakteryjnych przy użyciu bezpłatnego oprogramowania do analizy bioobrazów ICY (http://icy.bioimageanalysis.org) o otwartym kodzie źródłowym. Oprogramowanie do analizy obrazu biologicznego ma wbudowany program detektora punktowego, który doskonale nadaje się do analizy SG. Pozwala na precyzyjne dostrojenie procesu automatycznego wykrywania w określonych regionach zainteresowania (ROI). Eliminuje to potrzebę ręcznej analizy poszczególnych SG i eliminuje błąd systematyczny w próbkowaniu.

Wiele stresów środowiskowych powoduje powstawanie SG, które są gęstymi fazowo cytozolowymi, niebłoniastymi strukturami o średnicy 0,2 - 5 μm5,6. Ta odpowiedź komórkowa jest ewolucyjnie zachowana u drożdży, roślin i ssaków i występuje, gdy globalna translacja białek jest zahamowana. Polega na agregacji zatrzymanych kompleksów inicjujących translację do SG, które są uważane za miejsca przechowywania mRNA nieaktywnych translacyjnie, umożliwiając selektywną translację podzbioru komórkowych mRNA. Po usunięciu stresu SG rozpuszczają się i wznawiają globalne tempo syntezy białek. SG składają się z czynników inicjujących elongację translacji, białek biorących udział w metabolizmie RNA, białek wiążących RNA, a także białek rusztowania i czynników zaangażowanych w sygnalizację komórkową gospodarza2, chociaż dokładny skład może się różnić w zależności od zastosowanego stresu. Czynniki środowiskowe, które indukują powstawanie SG, obejmują głód aminokwasów, promieniowanie UV, szok cieplny, szok osmotyczny, stres retikulum endoplazmatycznego, niedotlenienie i infekcję wirusową2,7,8. Poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu, w jaki sposób wirusy indukują, a także osłabiają powstawanie SG, podczas gdy nadal niewiele wiadomo o tym, jak inne patogeny, takie jak patogeny bakteryjne, grzybicze lub pierwotniaki, wpływają na tę komórkową reakcję na stres1,7.

Shigella flexneri jest Gram-ujemnym fakultatywnym patogenem cytozolowym ludzi i czynnikiem wywołującym ciężką biegunkę lub shigellozę. Szigelloza jest poważnym obciążeniem dla zdrowia publicznego i prowadzi do 28 000 zgonów rocznie u dzieci poniżej 5 roku życia9,10. S. flexneri infekuje nabłonek okrężnicy i rozprzestrzenia się z komórki na komórkę, przejmując kontrolę nad komponentami cytoszkieletu gospodarza11,12. Zakażenie nabłonka wspomaga replikację S. flexneri w cytozolu, ale zakażone makrofagi giną w wyniku zapalnego procesu śmierci komórki zwanego piroptozą. Infekcja prowadzi do masowej rekrutacji neutrofili i ciężkiego stanu zapalnego, któremu towarzyszy ciepło, stres oksydacyjny i niszczenie tkanek. Tak więc, podczas gdy zakażone komórki podlegają stresom wewnętrznym wywołanym infekcją, takim jak zaburzenie Golgiego, stres genotoksyczny i przegrupowania cytoszkieletu, zakażone komórki są również narażone na stresy środowiskowe spowodowane procesem zapalnym.

Charakterystyka wpływu infekcji S. flexneri na zdolność komórek do reagowania na stres środowiskowy za pomocą wielu markerów SG wykazała, że infekcja prowadzi do jakościowych i ilościowych różnic w składzie SG3. Jednak niewiele wiadomo o innych patogenach bakteryjnych. W tym miejscu opisano metodologię zakażenia komórek gospodarza cytozolowym patogenem S. flexneri, stresowania komórek o różnych stresach środowiskowych, znakowania składników SG oraz jakościowej i ilościowej analizy powstawania i składu SG w kontekście komórek zakażonych i niezakażonych. Ta metoda ma szerokie zastosowanie w przypadku innych patogenów bakteryjnych. Ponadto analiza obrazu powstania SG może być wykorzystana w przypadku infekcji wirusami lub innymi patogenami. Może być używany do analizy powstawania SG po infekcji lub wpływu infekcji na tworzenie SG w odpowiedzi na stresy egzogenne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie bakterii i komórek gospodarza

  1. Przenieść szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 lub 14 mm na płytkach 24- lub 12-dołkowych odpowiednio za pomocą sterylnej pęsety, licząc jedną studzienkę na warunki doświadczalne. Sterylizuj je przez obróbkę UV w kapturze do hodowli tkanek przez 15 min.
    UWAGA: Uwzględnij studzienki kontrolne dla prowokacji bakteryjnej i indukcji SG przez stresy egzogenne.
  2. W przypadku płytki 24-dołkowej ze szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm, należy wysiać 1 x 105 komórek ssaków (np. komórek HeLa) na szkiełka nakrywkowe; docisnąć szkiełka nakrywkowe sterylną końcówką pipety. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5% CO2 w pożywce odpowiedniej dla każdego typu komórek.
    UWAGA: Płytki komórek tak, aby zbieg komórek wynosił od 40 do 60% następnego dnia.
    1. W przypadku komórek HeLa inkubuj w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z aminokwasami endogennymi (NEAA) i 10% zdekomplementowaną płodową surowicą cielęcą (FCS). Uzupełnij FCS przez ogrzewanie przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, mieszając serum raz po 15 minutach.
  3. Aby usunąć bakterie, użyj sterylnej końcówki pipety, aby usunąć niewielką ilość z bakteryjnego bulionu glicerolowego (20% glicerolu) przechowywanego w zamrażarce o temperaturze -80 °C i umieść go na oznakowanej płytce. Użyj sterylnej pętli, aby rozprowadzić bakterie na około 10% płytki. Użyj nowej sterylnej pętli i przeciągnij ją przez rozmaz, aby utworzyć 3 równoległe linie o długości połowy płytki. Przełóż smugę przez te linie pokrywające resztę płytki. Inkubować płytkę O/N w temperaturze 37 °C.
    1. Wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną (np. S. flexneri) ze świeżo wyłożonej płytki. Unikaj pracy z koloniami bakteryjnymi starszymi niż 1 tydzień.
    2. W przypadku szczepu S. flexneri M90T należy zaszczepić czerwoną kolonię ze świeżo rozwarstwionej czerwonej płytki agarowej Tryptic Soy Agar-0,1% Kongo do 8 ml bulionu sojowego tryptycznego w probówce o pojemności 15 ml; dokręcić pokrywkę i inkubować, wytrząsając z prędkością 222 obr./min O/N w temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Nie używaj dużych białych kolonii, ponieważ utraciły one plazmid wirulencji i nie są zakaźne.

2. Wyzwanie bakteryjne komórek gospodarza

  1. Przygotuj bakterie, aby zmaksymalizować potencjał infekcji.
    1. W przypadku S. flexneri subkulturuj bakterie, dodając 150 μl kultury O/N do 8 ml tryptycznego agaru sojowego i inkubując, wytrząsając 222 obr./min w temperaturze 37 °C do późnej fazy wykładniczej (~ 2 h) w celu wywołania ekspresji genów wirulencji i nasilenia infekcji.
      1. Gdy gęstość optyczna kultury wynosi od 0,6 do 0,9 (mierzona przy 600 nm), przenieś 1 ml kultury do probówki o pojemności 1,5 ml. Bakterie osadzać przez 2 minuty przy 8 000 x g i ponownie zawiesić w pożywce infekcyjnej (DMEM z NEAA, bez FCS) przy OD600 = 1. Tak więc, jeśli OD600 wynosi 0,85, ponownie zawiesić w 850 μL.
        UWAGA: W przypadku S. flexneri, przy OD600 = 1, będzie 8 x 108 bakterii na ml podczas hodowli w pożywce 8 ml. Odpowiednia jest wielokrotność infekcji (MOI) wynosząca 20. W przypadku innych patogenów liczbę bakterii na ml przy OD600 i odpowiednią MOI należy określić empirycznie.
    2. Aby wzmocnić interakcje bakteria-gospodarz, pokryj bakterie poli-L-lizyną (PLL).
      UWAGA: Leczenie PLL S. flexneri nie miało wpływu na dynamikę SG. Inne patogeny muszą zostać ocenione pod kątem ich przydatności do leczenia PLL.
      1. Aby pokryć bakterie PLL, odwiruj 1 ml kultury bakteryjnej przez 2 minuty przy 8 000 x g, a następnie ponownie zawieś osad w 10 μg/ml PLL w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przy OD600 = 1.
      2. Dodać roztwór bakteryjny do małego naczynia, takiego jak studzienka na 12-dołkowej płytce, i inkubować w temperaturze pokojowej (~ 20 °C) przez 10 minut, delikatnie mieszając na wytrząsarce do płytek.
      3. Osadzaj bakterie przez 2 minuty przy 8,000 x g, usuń nadmiar PLL. Zawiesić osad w 1 ml PBS i powtórzyć ten etap prania dwukrotnie. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić w pożywce infekcyjnej o średnicy zewnętrznej600 = 1,
        UWAGA: W tym przypadku pożywką infekcyjną dla S. flexneri jest pożywka komórki gospodarza z 20 mM HEPES bez FCS.
  2. Przygotuj komórki na prowokację bakteryjną.
    1. Usuń pożywkę z komórek HeLa ssaków za pomocą pompy ssącej. Dodać 500 μl pożywki komórkowej RT HeLa, aby umyć komórki, zawirować, usunąć pożywkę za pomocą pompy ssącej i zastąpić odpowiednią pożywką infekcyjną o pojemności 500 μl RT (np. pożywką z komórek gospodarza z 20 mM HEPES bez FCS).
    2. UWAGA: Na wszystkich etapach mycia pracuj szybko i przetwarzaj tylko do 4 szkiełek nakrywkowych na raz, aby uniknąć wysuszenia komórek.
  3. Wyzwanie przygotowało komórki HeLa z bakteriami, aby zainfekować 20 - 50% komórek.
    UWAGA: Dla każdego gatunku bakterii należy określić odpowiedni czas i MOI. Ogólnie rzecz biorąc, dobry początek to 30 minut w temperaturze 37 °C z MOI 10.
    1. W przypadku S. flexneri należy zmobilizować komórki HeLa za pomocą jednej z dwóch metod (krok 2.3.1.1 lub 2.3.1.2).
      1. Wiruj bakterie niepoddane działaniu PLL (20 μl OD600 = 1/dołek 24-dołkowej płytki w 500 μl pożywki) na komórkach przez 10 minut przy 13000 x g.
      2. Dodaj bakterie pokryte PLL (15 μl OD600 = 1/dołek 24-dołkowej płytki w 500 μl pożywki) przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby bakterie mogły osiedlić się na komórkach.
    2. Pozwolić na wystąpienie infekcji, umieszczając komórki z osadzonymi bakteriami w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 30 min.
      UWAGA: W przypadku krótkich okresów czasu należy zsynchronizować zakażenie S. flexneri, umieszczając płytki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut zamiast w inkubatorze do hodowli tkankowych.
  4. Zatrzymaj infekcję, myjąc komórki.
    1. Aby umyć komórki i usunąć nadmiar bakterii, usuń pożywkę za pomocą pompy ssącej, dodaj 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej HeLa (DMEM, 10% FCS, NEAA). Zamieszaj pożywkę, usuń i zastąp świeżą pożywką. Powtórz dwa razy i pozostaw świeże podłoże na komórkach.
      1. W przypadku S. flexneri lub innych bakterii wewnątrzkomórkowych, po zakażeniu komórek HeLa i płukania, należy zastąpić pożywkę standardową pożywką do hodowli tkankowej zawierającą 50 μg/ml gentamycyny, aby zabić bakterie zewnątrzkomórkowe i zapobiec dalszej inwazji komórek.
        UWAGA: Nie dodawaj antybiotyków do pożywki dla bakterii zewnątrzkomórkowych.
  5. Inkubować bakterie z komórkami przez żądany czas w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    UWAGA: W przypadku S. flexneri infekcja może trwać nawet 6 godzin, w zależności od typu komórki. W przypadku komórek HeLa pozwól infekcji postępować przez 1,5 - 2 godziny przed dodaniem egzogennych stresów w celu wywołania tworzenia SG. W przypadku infekcji Caco-2, w których Shigella rozprzestrzenia się z komórki na komórkę, należy zakażać przez 30 minut do 6 godzin przed dodaniem stresu egzogennego. Komórki można utrwalić w tym momencie bez dodawania stresów egzogennych w celu oceny powstawania SG w wyniku infekcji bakteryjnej (w takim przypadku przejdź do sekcji 4).

3. Wywoływanie powstawania granulek stresu przez dodanie egzogenicznych stresorów

  1. Usunąć pożywkę z zakażonych i niezakażonych komórek HeLa za pomocą pompy ssącej, zastąpić pożywkę 500 μl odpowiedniej pożywki z lub bez stresora i inkubować.
    UWAGA: Warunki wywołujące stres obejmują następujące (patrz poniżej). Aby uzyskać dodatkowe leczenie, patrz Kedersha i wsp. 13.
    1. Do leczenia szokiem cieplnym należy użyć zwykłej pożywki zawierającej 20 mM HEPES i umieścić płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 44 °C na 30 minut.
    2. Do leczenia klotrimazolem (indukuje stres mitochondrialny) należy użyć zwykłej pożywki bez FCS z 20 μM klotrimazolem i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 1 godzinę
      UWAGA: Jednorazowe podwielokrotności 20 mM klotrimazolu należy przechowywać w dimetylosulfotlenku (DMSO) w temperaturze -20 °C przez okres do 4 miesięcy. Użyj nośnika DMSO do komórek kontrolnych.
    3. Do leczenia arsenitem (indukuje stres oksydacyjny) należy użyć zwykłej pożywki z arsenitem 0,5 μM i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 1 godzinę
      UWAGA: Jednorazowe porcje arseninu o stężeniu 0,5 mM należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
      UWAGA: Klotrimazol i arsenit są szkodliwe i niebezpieczne dla środowiska i muszą być odpowiednio zutylizowane.
    4. Do leczenia Des-Methyl Des-Amino (DMDA)-pateamine (hamuje inicjację translacji eukariotycznej), należy użyć zwykłej pożywki z 50 - 200 nM DMDA-pateaminą i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 1 h.
      UWAGA: Przechowywać DMDA-pateaminę w temperaturze -80 °C. Przechowywać odczynniki w postaci małych porcji, aby uniknąć rozmrażania przez zamrażanie.

4. Analiza utrwalania i immunofluorescencji tworzenia się granulek stresu

UWAGA: Przetwarzaj kontrolne i eksperymentalne szkiełka nakrywkowe w tym samym czasie, aby uniknąć różnic w barwieniu, które mogą wpływać na analizę obrazu w kolejnych krokach. Próbki kontrolne obejmują brak zakażenia z leczeniem indukującym SG i bez niego oraz próbki zakażone z leczeniem indukującym SG i bez niego.

  1. Całkowicie usunąć pożywkę za pomocą pompy ssącej i utrwalić próbki, dodając 0,5 ml RT 4% paraformaldehydu (PFA) do PBS. Inkubować przez 30 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: PFA jest szkodliwy dla osoby zajmującej się obsługą i środowiska. Podejmij odpowiednie środki w celu ochrony osoby obsługującej i utylizuj razem z odpadami chemicznymi.
    UWAGA: Alternatywnie, utrwalaj przez 15 minut, a następnie zastąp wstępnie schłodzonym metanolem o temperaturze -20 °C przez 10 minut, aby zachować większą cytoplazmatyczną lokalizację markerów SG 13.
  2. Usuń PFA za pomocą pipety i wyrzuć płyn do odpowiedniego pojemnika na odpady. Umyj szkiełko nakrywkowe 1 ml soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3; 15 mM NaCl). Inkubować szkiełko nakrywkowe przez 2 minuty, delikatnie potrząsając na wytrząsarce płytkowej podczas mycia.
  3. Całkowicie usuń TBS za pomocą pompy ssącej i dodaj 500 μl 0,3% Triton-X100 w TBS przez 10 minut, aby przepuszczalność komórek.
  4. Usunąć roztwór przepuszczalny za pomocą pompy ssącej. Zastąp 1 ml TBS, delikatnie zamieszaj płytkę, usuń TBS przez odsysanie i dodaj 1 ml roztworu blokującego (5% FCS w TBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie 1:300) w 5% FCS w TBS. Obliczyć 50 μl na 12 mm szkiełka nakrywkowego i dostarczyć wystarczającą ilość dla wszystkich szkiełek nakrywkowych w jednej partii.
    UWAGA: Typowe przeciwciała pierwszorzędowe, które są używane, są ukierunkowane na G3BP1, eIF3b i TIA1.
  6. Umieścić 50 μl mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych na folii parafinowej z tworzywa sztucznego (parafilm) mocno przyklejonej do stołu lub komory.
    UWAGA: Lista kanonicznych markerów SG znajduje się w Tabeli materiałów, ale skład SG może zależeć od zastosowanego naprężenia. Inne markery SG są wymienione w Kedersha i wsp.13 Oczekiwane wyniki dla wielu markerów SG dla infekcji S. flexneri są wymienione w Tabeli 1.
  7. Podnieś szkiełko nakrywkowe pęsetą, przetrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego na chusteczkę, na chwilę zwalniając pęsetę, aby usunąć nadmiar płynu, i delikatnie połóż na kropli stroną zadrukowaną do dołu. Szkiełka nakrywkowe inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
    UWAGA: Aby przygotować wilgotną komorę, należy umieścić wstępnie zwilżone chusteczki wzdłuż krawędzi mocno zamkniętej komory wyłożonej plastikowym parafilmem.
  8. Przenieść każde szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety do dołka nowej 24-dołkowej płytki wypełnionej 1 ml TBS; inkubować, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce płytkowej przez 5 minut. Odessać TBS do każdej studzienki za pomocą pompy ssącej, zastąpić 1 ml TBS i umieścić z powrotem na wytrząsarce płytkowej na 5 minut. Powtórzyć mycie jeszcze raz.
    UWAGA: Ponownie użyj parafilmu, usuwając nadmiar płynu chusteczką i myjąc powierzchnię wodą. Upewnij się, że folia parafinowa jest całkowicie sucha przed użyciem jej do kolejnego etapu barwienia.
  9. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w TBS (rozcieńczenie 1:500 - 1:2 000). Aby zabarwić jądro i bakterie, dodaj do mieszanki 2 μg/ml DAPI. Aby zabarwić aktynę, dodaj fluorescencyjną falloidynę. Odpipetować 50 μl wtórnej mieszaniny przeciwciał na plastikową folię parafinową.
    UWAGA: Stosowanie wysoce oczyszczonych, wchłanianych krzyżowo przeciwciał drugorzędowych osła jest zalecane do badań kolokalizacji różnych markerów SG, gdy stosuje się G3BP1 (przeciwciało kozie). Wybierz znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe o nienakładających się widmach. eIF3b wyraźnie barwi cytoplazmę komórek i dlatego jest dobrym markerem do wyznaczania komórek. Barwienie aktynowe dodatkowo pomaga w wyznaczaniu komórek w miejscach kontaktu między komórkami i obszarach wnikania bakterii.
  10. Podnieś szkiełko nakrywkowe pęsetą, przetrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego na chusteczkę, zwalniając na chwilę pęsetę, aby usunąć nadmiar płynu. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na kropli i inkubuj szkiełka nakrywkowe w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  11. Za pomocą pęsety umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem w 24-dołkowych płytkach wypełnionych świeżym 1 ml PBS. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest całkowicie zakryte PBS. Umyj komórki 3x delikatnie potrząsając przez 5 min każda.
    UWAGA: Podczas płukania płytkę należy przechowywać pod przykryciem w celu ochrony przed światłem, ponieważ fluorofory przeciwciała drugorzędowego są wrażliwe na światło.
  12. Na krótko zanurz szkiełko nakrywkowe w wodzie dejonizowanej, aby usunąć sól, osusz do sucha od krawędzi na chusteczkę i zamontuj szkiełko nakrywkowe na 5 μl fluorescencyjnego podłoża mocującego na szkiełku podstawowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe przed obrazowaniem za pomocą lakieru do paznokci. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego (tydzień) lub -20 °C w przypadku długotrwałego (miesiąc).
    UWAGA: Podczas uszczelniania należy unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ może to pogorszyć jakość obrazu.

5. Obrazowanie fluorescencyjne

UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby dowiedzieć się, jak zoptymalizować ustawienie.

  1. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu 40- lub 63-krotnej soczewki olejowej. Wybierz żądane kanały fluorescencyjne do akwizycji obrazu. W przypadku korzystania z wielu kanałów fluorescencyjnych wybierz tryb akwizycji sekwencyjnej.
    UWAGA: Zacznij od próbek eksperymentalnych, w których SG zostały najsilniej wywołane, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji na kolejnych próbkach. Upewnij się, że nie ma prześwietlonych SG na całej głębokości ogniwa.
    1. Ustaw rozmiar bitowy 12 lub większy w ustawieniach mikroskopu, aby zapewnić dokładność analizy obrazu.
    2. Ustaw stosy obrazów tak, aby pokrywały całą głębokość komórki. Sprawdź różne kanały i różne znaczniki SG, aby upewnić się, że obejmuje cały zakres. Ustaw początek stosu u podstawy komórek, a wierzchołek stosów na wysokości u góry komórek, na której nie obserwuje się więcej znaczników SG.
    3. Zdobądź stos. Wysokość stosu powinna być taka sama dla wszystkich obrazów.
      UWAGA: Nie zmieniaj ustawień akwizycji między próbkami kontrolnymi i eksperymentalnymi, które będą używane do późniejszego porównania.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Tutaj opisana jest analiza SG na zwiniętych stosach przy użyciu freeware ICY. Analiza obrazu rekonstrukcji 3D może być również wykonywana przy użyciu innego specjalistycznego oprogramowania. Wykrywanie SG może odbywać się za pomocą w pełni zautomatyzowanego przepływu pracy ustanowionego dla tego protokołu (dostępnego pod adresem http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Aby skorzystać z tego protokołu, jądra muszą zostać wybarwione barwnikiem DNA, aby oprogramowanie mogło znaleźć środek każdej komórki, a krawędzie komórek muszą być oznaczone markerem cytoplazmatycznym (takim jak eIF3b) lub barwieniem aktyny, aby oprogramowanie zidentyfikowało granice komórki. Automatyczny przepływ pracy może być używany do walidacji wyników uzyskanych ręcznie lub bezpośrednio do analizy, gdy granice komórek są wykrywane z dużą pewnością, co będzie głównie zależało od gęstości komórek i markera użytego do wykrycia granic komórek.

  1. Korzystając z ImageJ lub Fiji, zwiń stosy obrazów (projekcja Image>Stacks>Z) i zapisz jako .tiff files.
    UWAGA: Utwórz nowy folder dla każdego obrazu, ponieważ oprogramowanie do analizy obrazu połączy jego wyniki z witryną oryginalnego obrazu.
  2. Załaduj obraz kontrolny i eksperymentalny .tiff na platformę analizy obrazu (File>Open). Przejdź do okna Sekwencja. Przewiń w dół w "Tabeli przeglądowej" do parametrów kanału.
  3. Dezaktywuj wszystkie kanały, klikając pole wyboru wszystkich zakładek kanałów. Kliknij kanał 0, a następnie wybierz preferowany kolor, klikając pasek kolorów powyżej. W razie potrzeby zwiększ intensywność kanału, aby zobaczyć wszystkie struktury, klikając i przesuwając linię w polu intensywności. Powtórz to dla wszystkich kanałów.
    UWAGA: Dezaktywuj kanały, które nie są wymagane dla danego zadania, aby zminimalizować odchylenia w analizie próbki.
  4. Przewiń w górę i na karcie Płótno powiększ do około 10 komórek na pole, dostosowując kartę powiększenia.
  5. Użyj narzędzi funkcji wielokąta (na górnym pasku), aby wyznaczyć granice komórek na obrazie. Użyj barwienia aktynowego lub markera cytozolowego do wyznaczenia granic komórek (np. eIF3b).
    1. Kliknij funkcję wielokąta w narzędziach "Plik i ROI". Rozpocznij wyznaczanie linii, klikając komórkę, a następnie przedłuż linię, tworząc kotwice poprzez wielokrotne klikanie wokół granicy komórki. Aby zakończyć ROI, kliknij ponownie funkcję wielokąta w narzędziach "Plik i ROI".
      UWAGA: Zidentyfikuj subpopulacje wyznaczonych komórek, które są zakażone. Próbka składa się z mieszanki zakażonych i niezakażonych komórek. Aby zidentyfikować bakterie, użyj barwnika DAPI lub bakterii fluorescencyjnych (takich jak bakterie wykazujące ekspresję GFP). Zwiększ intensywność, aby upewnić się, że wszystkie bakterie są widoczne.
    2. Aby nazwać ROI, przejdź do okna ROI po prawej stronie i kliknij interesującą Cię komórkę na obrazie. Spowoduje to podświetlenie odpowiedniego zwrotu z inwestycji w zakładce ROI. Kliknij dwukrotnie nazwę ROI i zmodyfikuj nazwę (np. zainfekowana komórka #1).
      UWAGA: Jeśli jeden obraz ma być używany do analizy zarówno zainfekowanych, jak i niezainfekowanych komórek, łatwiej jest zapisać obraz w dwóch oddzielnych folderach i oddzielnie wyznaczyć zainfekowane i niezainfekowane komórki, generując dwa różne arkusze kalkulacyjne, co ułatwi późniejszą analizę.
  6. Otwórz aplikację detektora punktowego w zakładce "Wykrywanie i śledzenie" (górny pasek). Na karcie Dane wejściowe zostanie wybrany bieżący obraz. Nie zmieniaj niczego. Na karcie Przetwarzanie wstępne wybierz kanał, który ma być analizowany.
    UWAGA: W danym momencie można analizować tylko jeden kanał. Analizę wsadową można tutaj wybrać, jeśli korzysta się z w pełni zautomatyzowanej sekwencji analizy, której parametry zostały sprawdzone w celu uzyskania satysfakcjonujących wyników.
    1. Na karcie Detektor wybierz "Wykryj jasne punkty na ciemnym tle". Następnie wybierz odpowiednią skalę i czułość. W tym celu należy przetestować różne ustawienia i sprawdzić wykrywanie punktowe zarówno w próbkach kontrolnych, jak i eksperymentalnych.
      UWAGA: W przypadku obrazu o rozdzielczości 2 048 x 2 048 i rozmiarze piksela 0,12 μm2 próg poziomu 2 o czułości od 25 do 100 jest ogólnie odpowiedni, ale każdy marker SG musi zostać przetestowany empirycznie. Ustaw wykrywanie punktowe tak, aby w próbce kontrolnej niepoddanej działaniu substancji plamki nie były wykrywane, podczas gdy w próbce eksperymentalnej z SG zliczane są wszystkie małe i duże SG.
    2. Na karcie ROI wybierz sugerowany zwrot z inwestycji z sekwencji. Na karcie Filtrowanie wybierz pozycję Brak filtrowania. Na karcie Output (Wyjście) wybierz odpowiedni output.
      UWAGA: Wybranie opcji Włącz określony plik jest pomocne w zapisywaniu różnych warunków wykrywania lub różnych kanałów. Wybranie eksportu obrazu binarnego i oryginalnego obrazu z ROI i wykrywaniem jest pomocne w analizie kontroli jakości.
    3. Zaznacz opcję "Usuń poprzednie miejsca renderowane jako ROI". Wybierz folder, w którym chcesz zapisać plik, klikając przycisk "nie wybrano pliku". Na karcie Wyświetlanie wybierz żądane opcje. Kliknij "Rozpocznij wykrywanie".
      UWAGA: Zostanie utworzony folder z wybraną nazwą i wybraną lokalizacją, który zawiera wyeksportowane opcje obrazowania. Obrazy te będą nadpisywane dla każdego nowego testowanego warunku. Aby zachować obrazy, zmień nazwę folderu, aby został utworzony nowy folder, lub przenieś obrazy z folderu zapisywania do nowego folderu. W celu kontroli jakości obrazów pomocne jest wybranie znaku wykrywania wyświetlacza, numeru wykrycia ROI oraz numeru i nazwy ROI.
  7. Skonsoliduj i zapisz dane dla różnych parametrów, korzystając z wygenerowanego arkusza kalkulacyjnego dla każdego testowanego obrazu lub warunku.
    UWAGA: Parametry, które należy przeanalizować, obejmują liczbę SG na ROI, powierzchnie SG oraz maksymalną, średnią i minimalną intensywność SG.
  8. Przenieś dane i analizuj je za pomocą programu analitycznego zdolnego do analizowania, tworzenia wykresów i określania istotności statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby wyjaśnić i zademonstrować protokół opisany w niniejszym manuskrypcie, scharakteryzowaliśmy obraz ziarnistych ciał stresu (SGs) indukowanych klotrimazolem w komórkach HeLa zainfekowanych lub nie cytoplazmatycznym patogenem S. flexneri. Schemat procedury przedstawiono na Ryc. 1; obejmuje on pasianie wirulentnych i awirulentnych szczepów S. flexneri na płytkach z czerwienią Kongo, przygotowanie bakterii, infekcję, wywołanie stresu środowisk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje indukcję, lokalizację i analizę SG w komórkach niezakażonych i komórkach zakażonych cytozolowym patogenem S. flexneri w obecności lub braku stresu egzogennego. Korzystając z bezpłatnego oprogramowania do obrazowania, protokoły pozwalają na precyzyjną analizę jakościową i ilościową powstawania SG w celu identyfikacji i statystycznego rozwiązania różnic w danych fenotypach.

W protokole znajduje się kilka krytycznych etapów dla infekcji, indukcji SG i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

PS jest laureatem OPP1141322 grantowego Billa i Melindy Gatesów Grand Challenge. Projekt PV był wspierany przez stypendium Swiss National Science Foundation Early Postdoc Mobility Fellowship oraz stypendium podoktoranckie Roux-Cantarini. PJS jest wspierany przez grant HHMI i ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała pierwotne
eIF3b (N20), pochodzenie kozy Santa Cruzsc-16377Wytrzymały i szeroko stosowany marker SG. Barwienie cytozolowe umożliwia wyznaczenie komórek. Rozcieńczenie 1:300
eIF3b (A20), koza pochodzenia Santa Cruzsc-16378Ten sam cel co eIF3b (N20) i w naszych rękach był identyczny z eIF3b (N20). Rozcieńczenie 1:300
eIF3A (D51F4), pochodzenie królika (MC: monoklonalne)Sygnalizacja komórkowa3411Część wielobiałkowego kompleksu eIF3 z eIF3b . Rozcieńczenie 1:800
eIF4AI, pochodzenie kozy Santa Cruzsc-14211Polecany przez (Ref # 13). Rozcieńczenie 1:200
eIF4B, pochodzenie królikaAbcamab186856Dobry marker granulatu stresu w naszych rękach. Rozcieńczenie 1:300
eIF4B, pochodzenie królikaSygnalizacja komórkowa3592Zalecane przez Ref # 13. Rozcieńczenie 1:100
eIF4G, pochodzenie królikaSanta Cruzsc-11373Szeroko stosowany marker SG. (Ref # 13): może nie działać dobrze w liniach komórkowych myszy. Rozcieńczenie 1:300
G3BP1, pochodzenie królika (MC: monoklonalne)BD Biosciences611126Szeroko stosowany marker SG. Rozcieńczenie 1:300
Tia-1, pochodzenie kozy Santa Cruzsc-1751Szeroko stosowany marker SG. Można go również znaleźć w ciałach P, gdy SG są obecne (Ref # 13). Rozcieńczenie 1: 300
Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexą
A488 antykozioł, osioł pochodzeniaThermo FisherA-11055Wchłaniany krzyżowo. Rozcieńczenie 1:500
A568 antykozioł pochodzenia osiołThermo FisherA-11057Wchłonięty krzyżowo. Rozcieńczenie 1:500
A488 anty-mysz, pochodzenie osiołThermo FisherA-21202Rozcieńczenie 1:500
A568 anty-mysz, pochodzenie osiołThermo FisherA10037Rozcieńczenie 1:500
A647 anty-mysz, pochodzenie osiołThermo FisherA31571Rozcieńczenie 1:500
A488 anty-królik, pochodzenie osiołThermo FisherA-21206Rozcieńczenie 1:500
A568 przeciw królikom, pochodzenie osiołThermo FisherA10042Rozcieńczenie 1:500
Inne odczynniki
Shigella flexneriDostępne w różnych laboratoriach na życzenie
Tryptone Kazeina Soya (TCS) bulionBD Biosciences211825Standardowe podłoże do wzrostu Shigella, zastosowanie - rozwój bakterii
Agar TCSBD Biosciences236950Standardowy agar wzrostowy do Shigella, zastosowanie - wzrost bakterii
Czerwień kongijskaSERVA Electrophoresis GmbH27215.01Narzędzie do przycinania dla Shigell, które utraciły plazmid wirulencji, zastosowanie - wzrost bakterii
Poli-L-Lizyna (PLL)Sigma-AldrichP1274Przydatny do powlekania bakterii w celu zwiększenia infekcji, zastosowanie - infekcja
GentamycynaSigma-AldrichG1397Selektywne zabijanie bakterii zewnątrzkomórkowych, ale nie cytozolowych, zastosowanie - zakażenie
HEPESLife Technologies15630-056Bufor pH przydatny, gdy komórki są inkubowane w temperaturze RT, zastosowanie - hodowla komórkowa
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM)Life Technologies31885Standardowa pożywka hodowlana dla komórek HeLa, zastosowanie - hodowla komórkowa
Surowica cielęca płodu (FCS)BiowestS1810-1005% suplementacja stosowana do pożywki do hodowli komórkowych HeLa, zastosowanie - hodowla komórkowa
Aminokwasy endogenne (NEAA)Life Technologies11140Rozcieńczenie 1:100 stosowane do pożywki do hodowli komórek HeLa, zastosowanie - hodowla komórkowa
DMSOSigma-AldrichD2650Rozcieńczalnik odczynnika, zastosowanie - hodowla komórkowa
ArseninsoduSigma-AldrichS7400Silny induktor granulek stresu (Uwaga: wysoce toksyczny, wymagane specjalne obchodzenie się i utylizacja), zastosowanie - induktor stresu
KlotrimazolSigma-AldrichC6019Silny induktor granulek stresu (Uwaga: zagrożenie dla zdrowia, wymagane specjalne obchodzenie się i utylizacja), zastosowanie - induktor stresu
Paraformaldehyd (PFAElectron Microscopy Scences157144% PFA służy do standardowego utrwalania komórek, zastosowanie - utrwalanie
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Stosowany w stężeniu 0,03% do przepuszczalności komórek gospodarza przed barwieniem immunofluorescencyjnym, aplikacja - przepuszczalność
A647-falloidynaThermo FisherA22287Rozcieńczenie wynosi 1:40, najlepiej dodawać podczas wtórnego barwienia przeciwciałami, aplikacja - barwienie
DAPISigma-AldrichD9542Barwienie kwasem nukleidowym służące do wizualizacji zarówno jądra gospodarza, jak i bakterii, zastosowanie - barwienie
ParafilmSigma-AldrichBR701501Folia parafinowa przydatna do barwienia immunofluorescencyjnego szkiełek nakrywkowych, aplikacja - barwienie
Prolong GoldThermo Fisher36930Solidne medium montażowe, które dobrze sprawdza się w przypadku większości fluoroforów, zastosowanie - montaż
MowiolSigma-Aldrich81381Tanie i wytrzymałe podłoże montażowe, które dobrze sprawdza się w przypadku większości fluoroforów, zastosowanie - montaż
24-dołkowej płytki do hodowli komórkowychSigma-AldrichCLS3527Standardowe płytki do hodowli tkankowych, zastosowanie - hodowla komórkowa
12 mm  szklane szkiełka nakrywkoweNeuVitro1001/12Wspomaganie hodowli komórkowych do zastosowań immunofluorescencyjnych, zastosowanie - kleszcze do podtrzymywania komórek
Sigma-Aldrich81381Tani i wytrzymały nośnik montażowy, który dobrze współpracuje z większością fluoroforów, zastosowanie - montaż
Programy i sprzęt
PrismGraphPad SoftwareAnaliza danych i program do tworzenia wykresów z solidnymi opcjami testów statystycznych, zastosowanie - analiza danych
Leica SP5Leica Microsystems Mikroskopkonfokalny, zastosowanie - obraz akwizycja
ImarisBitplaneProfessional program do analizy obrazu, aplikacja - analiza danych
ExcelMicrosoftProgram do analizy i tworzenia wykresów danych, aplikacja - analiza danych

Bibliografia

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788(2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnadetektor punktowymarker G3BP1marker EIF3Bkom rki HeLaShigella flexnerianaliza obrazu

Powiązane artykuły