Sparowany układ ściegów i magnesów do formowania mikrostudzienek o zmiennej geometrii wklęsłej

Summary

Ten manuskrypt przedstawia solidną metodę wytwarzania wklęsłych mikrostudzienek bez potrzeby skomplikowanych, kosztownych urządzeń. Wykorzystując siłę magnetyczną, stalowe kulki i układ otworów przelotowych, uformowano kilkaset mikrostudzienek w podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS) o wymiarach 3 cm x 3 cm.

Abstract

Kultura sferoidów jest użytecznym narzędziem do zrozumienia zachowania komórek, ponieważ zapewnia trójwymiarowe środowisko podobne do in vivo. Różne metody produkcji sferoidów, takie jak powierzchnie nieadhezyjne, kolby przędzalnicze, wiszące krople i mikrostudzienki, były stosowane w badaniach nad interakcją między komórkami, aktywacją immunologiczną, badaniami przesiewowymi leków, różnicowaniem komórek macierzystych i generowaniem organoidów. Wśród tych metod, mikrostudzienki o trójwymiarowej geometrii wklęsłej przyciągnęły uwagę naukowców i inżynierów, ze względu na ich zalety generowania sferoidów o jednolitych rozmiarach i łatwość, z jaką można monitorować reakcje poszczególnych sferoid. Mimo że zaproponowano opłacalne metody, takie jak zastosowanie elastycznych membran i litografia lodowa, techniki te wiążą się z poważnymi wadami, takimi jak trudności w kontrolowaniu rozmiarów wzorów, osiąganie wysokich proporcji i produkcja większych obszarów mikrostudzienek. Aby przezwyciężyć te problemy, proponujemy solidną metodę wytwarzania wklęsłych mikrostudzienek bez konieczności stosowania skomplikowanych, kosztownych urządzeń. Metoda ta wykorzystuje układ otworów przelotowych 30 x 30, kilkaset stalowych kulek rzędu mikrometrów i siłę magnetyczną do wytworzenia 900 mikrostudzienek w podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS) o wymiarach 3 cm x 3 cm. Aby zademonstrować możliwość zastosowania naszej metody w zastosowaniach biologicznych komórek, hodowaliśmy komórki macierzyste tłuszczu przez 3 dni i z powodzeniem wyprodukowaliśmy sferoidy za pomocą naszej platformy microwell. Ponadto przeprowadziliśmy symulację magnetostatyczną w celu zbadania mechanizmu, w którym siła magnetyczna została wykorzystana do uwięzienia stalowych kulek w otworach przelotowych. Uważamy, że proponowana metoda wytwarzania mikrostudzienek może być zastosowana w wielu badaniach komórkowych opartych na sferoidach, takich jak badania przesiewowe leków, regeneracja tkanek, różnicowanie komórek macierzystych i przerzuty raka.

Introduction

Komórki wyhodowane w formie sferoidalnej są bardziej podobne do prawdziwej tkanki w ciele niż dwuwymiarowa hodowla planarna¹. Biorąc pod uwagę tę przewagę, zastosowanie sferoidów zostało przyjęte w celu poprawy badań interakcji między komórkami^2,3, immuno-activation⁴, badanie przesiewowe leków^5, oraz differentiation⁶. Ponadto, sferoidy zawierające wiele typów komórek zostały ostatnio zastosowane w organoidach (prawie fizjologicznych tkankach trójwymiarowych (3D)), które są bardzo przydatne do badania rozwoju i chorób człowieka⁷. Do produkcji sferoidów zastosowano kilka metod. Najprostsza metoda polega na wykorzystaniu nieadhezyjnej powierzchni, tak aby komórki agregowały się ze sobą i tworzyły sferoidy. Szalka Petriego może być traktowana albuminą surowicy bydlęcej, pluronem F-127 lub hydrofobowym polimerem (np. metakrylanem poli 2-hydroksyetylu), aby jej powierzchnia była nieprzywierająca^8,9. Metoda spinner-flask to kolejny dobrze znany sposób wytwarzania dużych ilości sferoid^10,11. W tej metodzie komórki są utrzymywane w zawiesinie przez mieszanie, aby zapobiec ich przyczepieniu się do podłoża. Zamiast tego pływające komórki agregują się, tworząc sferoidy. Zarówno metoda powierzchni nieadhezyjnej, jak i metoda kolby obrotowej mogą wytwarzać duże ilości sferoid. Podlegają one jednak ograniczeniom, w tym trudnościom w kontrolowaniu wielkości sferoidy, a także śledzeniu i monitorowaniu każdej sferoidy. Jako remedium na takie problemy można zastosować inną metodę produkcji sferoidów, a mianowicie metodę wiszącej kropli¹². Polega to na osadzaniu kropli zawiesiny komórkowej na spodniej stronie pokrywki naczynia hodowlanego. Krople te mają zwykle wielkość od 15 do 30 μl i zawierają około 300 do 3000 komórek¹³. Gdy pokrywka jest odwrócona, krople są utrzymywane na miejscu przez napięcie powierzchniowe. Środowisko mikrograwitacji w każdej kropli koncentruje komórki, które następnie tworzą pojedyncze sferoidy na swobodnej granicy faz ciecz-powietrze. Zaletą metody wiszącej kropli jest to, że zapewnia dobrze kontrolowany rozkład wielkości, a jednocześnie łatwo jest śledzić i monitorować każdą sferoidę w stosunku do metody nieprzywierającej powierzchni i kolby obrotowej. Metoda ta ma jednak jedną wadę, ponieważ masowa produkcja sferoid i sam proces produkcji jest nadmiernie pracochłonny.

Tablica mikrostudzienek to płaska płytka z wieloma mikro-rozmiarowymi dołkami, z których każda ma średnicę od 100 do 1000 μm. Zasada produkcji sferoidów przy użyciu mikrostudzienek jest podobna do tej stosowanej w przypadku metody powierzchni nieadhezyjnej. Korzyści obejmują fakt, że mikrostudzienki zapewniają przestrzenie między mikrostudzienkami w celu oddzielenia komórek lub sferoid, dzięki czemu łatwo jest kontrolować rozmiar sferoidy, a jednocześnie ułatwia monitorowanie każdej pojedynczej sferoidy. Dzięki dużej liczbie mikrostudzienek możliwa jest również wysokoprzepustowa produkcja sferoidów. Kolejną zaletą mikrostudzienek jest możliwość formowania studzienek o różnych kształtach (sześciościenne, cylindryczne, pryzmatyczne trygonalne) w zależności od unikalnych celów eksperymentalnych użytkowników. Ogólnie rzecz biorąc, trójwymiarowy (3D) wklęsły (lub półkulisty) kształt jest uważany za najbardziej odpowiedni do wytwarzania pojedynczych sferoid o jednolitych rozmiarach. W związku z tym przydatność wklęsłych mikrostudzienek została opisana w wielu badaniach z zakresu biologii komórki, takich jak te badające różnicowanie kardiomiocytów embrionalnych komórek macierzystych¹⁴, wydzielanie insuliny przez klastry komórek wysp trzustkowych¹⁵, aktywność enzymatyczna hepatocytów¹⁶ oraz lekooporność sferoidów nowotworowych¹⁷.

Niestety, produkcja mikrostudzienek często wymaga specjalistycznych urządzeń do mikrowzorów; konwencjonalne metody oparte na fotolitografii wymagają naświetlania i wywoływania, podczas gdy metody oparte na reaktywnym trawieniu jonowym wymagają sprzętu plazmowego i wiązki jonów. Taki sprzęt jest kosztowny, co w połączeniu ze skomplikowanym procesem produkcji stanowi wysoką barierę wejścia dla biologów, którzy nie mają dostępu do mikrotechnologii. Aby przezwyciężyć te problemy, zaproponowano inne opłacalne metody, takie jak litografia lodu¹⁸ (przy użyciu zamrożonych kropelek wody) oraz metoda elastycznej membrany¹⁴ (przy użyciu membrany, podłoża przewlekanego i próżni). Jednak metody te mają również poważne wady, takie jak trudność w kontrolowaniu rozmiarów wzorów, osiąganie wysokich proporcji i produkcja mikrostudzienek o większej powierzchni.

Aby przezwyciężyć powyższe problemy, proponujemy nowatorską metodę produkcji wklęsłych mikrostudni z wykorzystaniem podłoża przewlekanego, stalowych koralików i układu magnesów. Korzystając z tej metody, można wytworzyć setki wklęsłych sferycznych mikrostudzienek, wykorzystując mechanizm samoblokujących się metalowych kulek wspomaganych siłą magnetyczną (ryc. 1). Proces produkcji wiąże się z użyciem bardzo niewielu drogich i skomplikowanych urządzeń i nie wymaga wielu zaawansowanych umiejętności. W związku z tym nawet niewykwalifikowane osoby mogą z łatwością podjąć się tej metody wytwarzania. Aby zademonstrować proponowaną metodę, komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej wyhodowano we wklęsłych mikrostudzienkach w celu wytworzenia sferoid.

Protocol

1. Przygotowanie aluminiowej płyty z otworem przelotowym i tablicy magnetycznej

1. Przygotuj dwie płyty aluminiowe o wymiarach 50 mm x 50 mm (lub większe). Grubość każdej płytki wynosiła 300 μm, co stanowi połowę średnicy ściegu.
2. Uformuj układ otworów przelotowych 30 x 30 na jednej z aluminiowych płyt za pomocą grawerki obrotowej CNC z mikrowiertłem Φ550 μm o prędkości zanurzania 30 mm/s i prędkości wrzeciona 8000 obr./min. Odległość między każdym otworem (od środka do środka) wynosiła 1 mm (Rysunek 1a i Rysunek 2a, i).
3. Uformuj układ 30 x 30 otworów przelotowych Φ750-μm na drugiej płycie aluminiowej, stosując tę samą procedurę, co opisana w 1.2 (Rysunek 1a i Rysunek 2a, ii).
4. Przymocuj dwie płyty do siebie za pomocą taśmy klejącej i uformuj otwory wyrównujące Φ3 mm w każdym z czterech rogów obu aluminiowych płyt.
5. Namocz aluminiowe płyty w 15% kwasie siarkowym na 12 godzin, aby wyczyścić ich powierzchnie. Ponieważ cienka warstwa tlenku glinu na powierzchni aluminium sprawia, że jest ono odporne na korozję, średnica otworu i grubość płyty nie zmieniają się w wyniku tej obróbki kwasem.
6. Utwórz układ 30 × 30 magnesów neodymowych 1 x 1 x 1 mm (o sile magnetycznej 0,363 N). Upewnij się, że każdy magnes ma biegunowość przeciwną do sąsiedniego. Aby zapobiec pęknięciu lub rozproszeniu układu magnesów, przymocuj aluminiową płytkę o wymiarach 30 x 30 mm do dolnej części układu magnesów za pomocą taśmy dwustronnej (Rysunek 2a, iii i wstawka w Rysunek 2).

2. Proces zalewania koralików

1. Wyrównaj i ułóż dwie aluminiowe płyty (płyta górna: płyta z otworem 750 μm, płyta dolna: płyta z otworem 550 μm), korzystając z przygotowanych otworów wyrównujących w czterech rogach każdej płyty (Rysunek 1b).
2. Zablokuj obie płytki razem, wkładając M3 do otworów wyrównujących, a następnie zabezpiecz nakrętkami (Rysunek 1b).
3. Ułóż zespół płyty aluminiowej na przygotowanym układzie magnesów (Rysunek 1b, 2b i 2c). Wyrównaj układ magnesów i układ otworów przelotowych w płycie aluminiowej podczas procesu układania w stosy. Następnie użyj taśmy klejącej, aby ustalić położenie układu magnesów.
4. Umieść wystarczającą liczbę stalowych koralików SUJ2 Φ600 mm na zespole płyty i manipuluj koralikami za pomocą akrylowej (lub niemetalowej) płytki tak, aby koralik został uwięziony w każdym otworze (Rysunek 1c, 1d i 1e), jednocześnie usuwając nadmiar koralików, które nie utknęły w otworach.
5. Ostrożnie zdejmij górną płytę, aby uniknąć niepożądanego rozproszenia i przemieszczenia uwięzionych koralików ( Rysunek 1f).

3. Produkcja wklęsłych mikrostudzienek

1. Przenieś wklęsłą formę mikrostudzienki, wykonaną w krokach od 2.1 do 2.5 powyżej, na szalkę Petriego.
2. Wymieszaj monomer polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz zgodnie z instrukcjami producenta¹⁹ ze stosunkiem monomeru PDMS do utwardzacza wynoszącym 10:1.
3. Odgazować mieszaninę PDMS za pomocą eksykatora i pompy próżniowej w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków uwięzionych w mieszaninie PDMS.
4. Wlej mieszaninę PDMS do wklęsłej formy mikrostudzienkowej i ponownie odgazuj, stosując tę samą procedurę, jak opisano w 3.3 (Rysunek 1f).
5. Piecz mieszaninę PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 2 godziny, aby utworzyć podłoże PDMS zatopione w kulkach (Rysunek 1g).
6. Wyjmij utwardzony substrat PDMS z formy ( Rysunek 1g). W procesie usuwania spryskaj metanol za pomocą butelki do mycia, aby odłączyć podłoże PDMS od formy.
7. Za pomocą magnesu Φ15 mm x 2 mm usuń uwięzione stalowe koraliki z podłoża PDMS (Rysunek 1h). Do tego procesu można użyć dowolnego magnesu, który jest wystarczająco silny, aby wydobyć kulki z podłoża PDMS.

4. Kultura sferoidalna

1. Wytnij wklęsły substrat PDMS z mikrodołkiem za pomocą stempla do biopsji Φ14 mm, który ma być umieszczony w płytce 24-dołkowej w tym badaniu.
2. Wysterylizuj otrzymany substrat PDMS Φ14 mm w sterylizatorze autoklawy w temperaturze 121 °C i 15 psi.
3. Umieść wysterylizowany substrat PDMS na płytce 24-dołkowej.
4. Pokryj cały substrat PDMS 4% (w/v) roztworem pluronicznym F-127 przez noc, aby zapobiec przyczepianiu się komórek do powierzchni mikrostudzienki. Podczas procesu powlekania należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione we wklęsłych mikrostudzienkach za pomocą pipetowania lub użycia myjki ultradźwiękowej.
5. Przepłukać roztwór F-127 trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
6. Zasiew: 1 ml roztworu pożywki komórkowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (który zawiera 2 x 10⁶ komórek) na podłożu PDMS. Należy pamiętać, że gęstość wysiewu można zmienić w zależności od docelowego rozmiaru sferoidy i/lub typu komórki docelowej. W tym przypadku wykorzystano komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC).
7. Odessać 1 ml pożywki za pomocą pipety 1000 μl, aby usunąć nadmiar komórek, które nie zostały uwięzione w mikrostudzienkach (Rysunek 3).
8. Inkubować komórki w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5% CO_{2 .} W przypadku ASC użytych w naszym badaniu, komórki agregują się do sferoidy w ciągu 48 godzin.

Results

Wypukła forma i wzór mikrostudzienki zostały pomyślnie wytworzone zgodnie z krokami od 2.1 do 3.7. (Rysunek 4). Komercyjne stalowe kulki zostały uwięzione w układzie otworów przelotowych 30 x 30. Koraliki były trzymane mocno, bez żadnych przerw między koralikami a odpowiadającymi im otworami przelotowymi (Rysunek 4a). Kształt wyprodukowanej wklęsłej mikrostudzienki jest wklęsły półkulisty, o średnicy 600 μm, która jest taka sama jak w przypadku stal...

Discussion

Głównym wyzwaniem stojącym przed tą metodą produkcji było bezpieczne zamocowanie koralików w układzie otworów przelotowych w płycie aluminiowej. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystano siłę magnetyczną w postaci układu magnetycznego o wymiarach 30 x 30 w celu bezpiecznego zamocowania koralików, jak pokazano na rysunkach 6 i 7. Gęstość strumienia magnetycznego układu magnesów, który ma przeciwną biegunowość, jest najsilniejsza w środku każdej powierzchni magnesu. Ponieważ siła siły magnet...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grawer obrotowy CNC	Roland DGA	EGX-350
Wiertło Micro	HAM Prä zision	30-1301 TA	Φ 0,55 i 0,75 mm
Kwas siarkowy 98%	Daejung	7683-4100	Do czyszczenia płyty aluminiowej. Rozcieńczyć wodą destylowaną z 15% roztworem
Magnes neodymowy	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Łożysko kulkowe	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μ m koralik stalowy
Polidimetylosiloksan (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami do 4% (w/v) roztworu
Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)	ATCC	30-2002
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS)	ATCC	30-2200
Surowica płodowa bydlęca	ATCC	30-2020
Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej	ATCC	ATCC PCS-500-011