Test wiązania kazey in vitro, który przewiduje przenikanie leku do zmian gruźliczych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę szybkiej dializy równowagowej (RED) do pomiaru wiązania leku z kazeum ze zmian i jam gruźlicy płuc. Protokół jest również stosowany z pienistą matrycą pochodzącą z makrofagów, która jest skutecznym substytutem kazeum.

Streszczenie

Wyeliminowanie gruźlicy wymaga schematów leczenia, które mogą przenikać przez wiele warstw skomplikowanych zmian w płucach. Dystrybucja leku w jądrzastych rdzeniach jam i zmian chorobowych jest szczególnie istotna, ponieważ są one siedliskiem subpopulacji bakterii tolerujących leki, powszechnie określanych również jako trwałe. Istniejące metody pomiaru przenikania leków do zmian gruźliczych wymagają kosztownych i czasochłonnych badań farmakokinetycznych in vivo w połączeniu z technikami bioanalitycznymi lub obrazowania. Pomiar in vitro wiązania leku z makrocząsteczkami kazeum został zaproponowany jako alternatywa dla takich technik, ponieważ wiązanie to utrudnia bierną dyfuzję cząsteczek leku przez kazeum. Dializa równowagowa szybka to szybki i niezawodny system do wykonywania badań wiązania białek osocza i tkanek. W tym protokole użyliśmy urządzenia do szybkiej dializy równowagi (RED) do pomiaru wiązania leku z homogenatami kazeum, które są wycinane ze zmian i jam królików zakażonych gruźlicą. Protokół opisuje również, w jaki sposób wygenerować macierz zastępczą z makrofagów THP-1 obciążonych lipidami, które można zastosować zamiast kazeum. Ten test wiązania kazeum/surogatu jest ważnym narzędziem w odkrywaniu leków na gruźlicę i może być dostosowany do badania dystrybucji leku w zmianach lub ropniach spowodowanych innymi chorobami.

Wprowadzenie

Leczenie gruźlicy płuc wymaga skutecznego rozprowadzania leków na różne rodzaje zmian. Martwicze zmiany i jamy zawierają jądrowate centra, w których znajdują się subpopulacje bakterii tolerujących leki lub "trwałych". ^1,2 Choroba jamowa wiąże się z gorszym wskaźnikiem wyleczalności i złym rokowaniem. ^3,4 Poprzednie badania wykazały, przy użyciu technik ilościowych i obrazowania, że zdolność do penetracji kazeum różni się znacznie w zależności od klasy leków. ^5,6 Metody te wymagają jednak użycia modeli infekcji zwierzęcych, które są powolne i żmudne. Zaprojektowano test in vitro, który mierzy wiązanie leku z kazeum ex vivo. Stwierdzono, że wiązanie to jest odwrotnie skorelowane z penetracją leku w ziarniniakach casesowatych, a zatem jest stosowane jako narzędzie predykcyjne. ⁷

Dializa równowagowa jest uważana za złoty standard w badaniach nad wiązaniem białek osocza. Urządzenie do szybkiej dializy równowagowej (RED) zapewnia szybki, łatwy w użyciu i niezawodny system do wykonywania takich testów. ⁸ Urządzenie składa się z dwóch elementów: jednorazowych, jednorazowych wkładów składających się z 2 komór oddzielonych pionowym cylindrem z półprzepuszczalnej membrany; oraz płyty bazowe wielokrotnego użytku, które mogą pomieścić do 48 wkładek jednocześnie. Membrana dializy ma wartość odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącą 8 kDa, która jest idealna do badań wiązania lek-makrocząsteczka. Wysoki stosunek powierzchni do objętości komory membranowej umożliwia szybką dializę i równowagę. Zarówno wkładki, jak i płyta podstawy zostały zatwierdzone pod kątem minimalnego niespecyficznego wiązania. Połączenie urządzenia RED z technikami bioanalitycznymi zapewnia dokładne oszacowanie niezwiązanych frakcji leków w osoczu. ^8,9

Chociaż pierwotnie zaprojektowane do pomiaru wiązania białek osocza, urządzenie RED było używane w kilku badaniach nad wiązaniem tkanek przy użyciu homogenatów. ^10,11 W tym protokole mierzymy wiązanie leku z caseum, martwiczymi pozostałościami usuniętymi z martwiczych zmian i jam królików zakażonych gruźlicą. Bezkomórkowy i nienaczyniowy charakter materiału caseous ułatwia homogenizację do jednorodnej zawiesiny, która jest zgodna z testem.

Biorąc pod uwagę, że caseum jest żmudne w produkcji i trudne do zdobycia, protokół został również zatwierdzony do użycia z matrycą zastępczą, która jest przygotowana z pienistych makrofagów. Makrofagi pochodzące z monocytów THP-1 są indukowane kwasem oleinowym w celu zgromadzenia wielu ciał lipidowych, które nadają im "pienisty" wygląd. Te naładowane lipidami komórki są zbierane i przetwarzane w celu wytworzenia matrycy, której używamy jako substytutu kazeum. Badanie to wykazało, że wiązanie leku z tą macierzyą zastępczą dobrze koreluje z wiązaniem z kazeum, skutecznie naśladując proces in vivo, który utrudnia penetrację leku w jądrowym rdzeniu ziarniniaków i jam.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) za zgodą Instytutional Animal Care and Use Committee NIAID (NIH) w Bethesda, MD. Wszystkie badania z wykorzystaniem M. tuberculosis przeprowadzono w laboratorium z trzecim poziomem bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3).

1. Model zakażenia królików i pobieranie caseum

1. Zainfekuj nowozelandzkie króliki białym szczepem M. tuberculosis, wykorzystując system ekspozycji aerozolowej wyłącznie przez nos, zgodnie z wcześniejszym opisem.^12,13 Pozostaw infekcję do rozwoju przez 12–16 tygodni. Podaj królikom dożylnie środki uspokajające: ketaminę w dawce 35 mg/kg oraz ksylazynę w dawce 5 mg/kg, a następnie przeprowadź eutanazję przy użyciu 0,22 mL/kg pentobarbitalu sodowego i fenytoiny sodowej podawanych dożylnie i przystąp do sekcji zwłok.
2. Za pomocą pęsety i skalpela wyjmij płuca z jamy klatki piersiowej. Z każdego płata płuca wyseparuj skalpelem poszczególne jamy oraz duże nekrotyczne ziarniniaki. Ostrożnie zeskrob caseum ze ścian jam i ziarniniaków. Zważ, zapisz i przechowuj próbki w probówkach z nakrętką o pojemności 2 mL w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
3. Próbki zakaźnego caseum poddaj irradiacji gamma dawką 3 MegaRad na suchym lodzie, aby wyeliminować zakaźność i umożliwić bezpieczne użytkowanie w laboratorium klasy BSL-2.

2. Generowanie substytutu caseum in vitro z komórek THP-1

1. Hodować monocyty THP-1 w medium RPMI 1640 (2 mM L-glutaminy i 10% płodowej surowicy bydlęcej) w kolbach do hodowli komórkowej T175 (80 mL/kolba). Inkubować kolby w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 3-4 dni.
2. Odwirować kulturę z kolby T175 w dwóch stożkowych probówkach 50 mL przy 150 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 10 mL medium RPMI 1640.
3. Napiperować 5 µL tej kultury do probówki 1,5 mL zawierającej 45 µL błękitu trypanu. Dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie. Przenieść 10 µL do hemocytometru i policzyć liczbę żywych monocytów THP-1 (niebarwionych) za pomocą mikroskopu świetlnego (powiększenie 10X). Obliczyć liczbę żywych komórek na 1 mL kultury. Rozcieńczyć ją medium RPMI do końcowej gęstości 1,25 x 10⁶ komórek/mL.
4. Nanieść 40 mL kultury na dużą płytkę do hodowli komórkowej (50 x 10⁶ komórek/płytkę). Dodać 40 µL 100 µM PMA (fosforbul mirystonian 13-octan, przygotowany w etanolu) i pozwolić komórkom przywrzeć przez noc w inkubatorze.
   UWAGA: Końcowe stężenie PMA wynosi 100 nM.
5. Rozcieńczyć czysty kwas oleinowy (OA) (0,89 g/mL) w etanolu do stężenia 0,1 M (t.j. 31,7 µL OA w 968,3 µL etanolu). Rozcieńczyć ten roztwór w świeżym, uprzednio ogrzanym medium RMPI do stężenia 10 mM. Rozcieńczyć tę zawiesinę OA do 0,4 mM (końcowe stężenie robocze) w medium RPMI uprzednio ogrzanym do 37 °C.
6. Usunąć istniejące medium i nieprzywierające komórki z płytek do hodowli komórkowej i delikatnie dodać 40 mL 0,4 mM OA do makrofagów THP-1 (THP-M). Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez noc.
7. Użyć mikroskopu świetlnego z 40-krotnym powiększeniem, aby wizualnie potwierdzić obecność licznych wtręć ciał lipidowych w każdym THP-M. Usunąć całe medium RPMI z płytek do hodowli komórkowej i delikatnie przemyć przywierające komórki dwukrotnie roztworem buforu fosforanowego (PBS), używając pipety serologicznej 50 mL.
   UWAGA: Ciała lipidowe pojawiają się jako małe, przejrzyste, sferyczne struktury w cytoplazmie THP-M.
8. Dodać 40 mL 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS do każdej płytki. Inkubować przez 15 min w temperaturze 37 °C.
9. Oddzielić makrofagi pianowate (FM) poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół nad powierzchnią całej płytki za pomocą pipety serologicznej 10-mL. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 50-mL i odwirować przy 150 x g przez 5 min.
10. Resuspendować osad komórkowy w 10 mL PBS (trzecie przemycie PBS) i przenieść do wcześniej zważonych stożkowych probówek 15-mL. Odwirować ponownie przy 150 x g przez 5 min. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej i odrzucić.
11. Poddać osady FM 3 cyklom zamrażania i rozmrażania w celu lizy komórek i inkubować je w temperaturze 75 °C przez 20-30 min, aby zdenaturować białka w macierzy. Przechowywać osady w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

3. Test szybkiej dializy równowagowej (RED)

1. Przygotować roztwory zapasowe wszystkich badanych związków o stężeniu 10 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO). Przed każdym badaniem rozcieńczyć je do roztworów roboczych o stężeniu 500 µM w DMSO.
2. Zważyć probówkę zawierającą pellet substytutu caseum. Odjąć masę pustej probówki, aby uzyskać masę samego pelletu. Do każdej probówki dodać 2-3 metalowe kulki i za pomocą homogenizatora tkankowego przy 1 200 pociągnięciach/min przez 1 min rozbić caseum lub macierz substytutu w PBS (1:9 m/v), aby uzyskać 10-krotnie rozcieńczoną zawiesinę każdej macierzy.
3. Do 643,5 µL homogenatu dodać 6,5 µL roztworu badanego związku o stężeniu 500 µM, aby uzyskać stężenie końcowe 5 µM (≤1% DMSO), a następnie wymieszać w wortexie.
4. Umieścić wkłady RED w płycie podstawowej. Do komory donora (czerwony pierścień) każdego wkładu RED dodać 200 µL macierzy z dodatkiem leku, a do każdej komory odbiorczej 350 µL PBS. Przygotować 3 wkłady dla każdego badanego związku (próbki w trzech powtórzeniach). Uszczelnić płytę za pomocą przylepnej folii uszczelniającej i inkubować w 37 °C na termomikserze przy 200 rpm (1 x g) przez 4 h.
5. Po inkubacji delikatnie wymieszać zawartość komór donora i odbiorczej, pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Odpiwetować 20 µL aliquotów homogenatu z komór donora i dodać do 20 µL czystego PBS w probówce 1,5 mL (1:1). Podobnie odpikwetować 20 µL aliquotów próbek PBS z komór odbiorczych i dodać do 20 µL czystego homogenatu (dopasowanie macierzy).⁸
   UWAGA: Dopasowanie macierzy eliminuje konieczność sporządzania dwóch oddzielnych krzywych kalibracyjnych (w homogenacie i w PBS) do analizy ilościowej. Zawartość komory donora może z czasem osiadać. Przed pobraniem aliquotów delikatnie wymieszać zawartość poprzez pipetowanie.

4. Ilościowe oznaczanie LC-MS i analiza danych

1. Do każdej probówki dodać 160 µL mieszaniny metanolu z acetonitrylem w stosunku 1:1 zawierającej 500 ng/mL diklofenaku lub 10 ng/mL werapamilu (standard wewnętrzny), a następnie wymieszać na wirówce wortex, aby wytrącić białka. Wir Likes w 10,000 x g przez 5 min w celu osadzenia wytrąconego materiału i przenieść nadsączniki do głębokich płytek 96-dołkowych do analizy metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas (LCMS).⁷
2. Sporządzić krzywe kalibracyjne w zakresie 1-1,000 nM dla każdego badanego związku, zachowując taki sam skład macierzy jak w powyższych próbkach. Ilościowo oznaczyć stężenie badanego związku w próbkach z komór dawczej i odbiorczej przy użyciu metody LC-MS.
3. Obliczyć frakcję nie związaną (f_u) leku w rozcieńczonej macierzy, korzystając z równania 1. Obliczyć f_u w nierozcieńczonej macierzy, korzystając z równania 2 (D = czynnik rozcieńczenia wynoszący 10).¹⁴
   
   
4. Sprawdzić odzysk (bilans masy) każdego związku za pomocą równania 3, aby zidentyfikować związki z problemami dotyczącymi stabilności, metabolizmu lub niespecyficznego wiązania.
   UWAGA: Odzysk zazwyczaj mieści się w przedziale od 70% do 130%.¹⁵
   

Wyniki

Stosując niniejszy protokół, przetestowaliśmy setki związków opracowywanych jako leki przeciwgruźlicze pod kątem ich przewidywanej wydajności w przenikaniu przez caseum. Rysunek 1 wizualizuje podstawowe założenia analizy RED. Membrana dializacyjna wkładów RED umożliwia dyfuzję niezwiązanych małych cząsteczek z dołka donora do dołka odbiorcy, aż do osiągnięcia stanu równowagi między oboma przedziałami. Małe cząsteczki związane z makrocząsteczkami, takimi jak białka lub lip...

Dyskusja

Martwicze zmiany i jamy płuc u pacjentów zakażonych gruźlicą zawierają subpopulacje bakterii, które są oporne na leczenie farmakologiczne. Jądra tych struktur są szczególnie odpowiedzialne za utrzymywanie tych przetrwałych w środowisku zewnątrzkomórkowym. ¹⁶ Uważa się, że korzystne rozmieszczenie środków przeciwbakteryjnych w tych odległych miejscach jest ważnym czynnikiem decydującym o skuteczności leków przeciwgruźliczych. Przed walidacją tego protokołu nie było dostępnych technik in vitro

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nowozelandzkie białe króliki
Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Ketathesia (Ketamina) 100 mg/ml C3N	Henry Schein Animal Health	56344
Anased (Ksylazyna) 100 mg/ml	Henry Schein Zdrowie zwierząt	33198
Euthasol (pentobarbital sodu i fenytoina sodowa) Roztwór	Virbac	710101
monocytowa linia komórkowa THP-1	ATCC	ATCC TIB-202
175 cm² Kolba z powłoką TC (T175)	Fisher Scientific	T-3400-175
RPMI 1640 podłoże bez glutaminy	Fisher Scientific	MT-15-040-CV
Hyklonowa płodowa surowica bydlęca, napromieniowana promieniami gamma	Fisher Scientific	SH3091003IR
Hyclon L-glutamina, 200 mM	Fisher Scientific	SH3003401
Cellstar TC naczynie, 145 mm x 20 mm, wentylowana	Fisher Scientific	T-2881-1
12-mirystynian 13-octanu (PMA)	Fisher Scientific	BP685-1
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma	E6758
Kwas oleinowy	Fisher Scientific ICN15178101
Pierce RED Płyta bazowa wielokrotnego użytku	Fisher Scientific	PI-89811
Wkładki do urządzenia Pierce RED, 50 sztuk w opakowaniu	Fisher Scientific	PI-89809
Narzędzie do usuwania wkładek Pierce RED	Fisher Scientific	89812
Uszczelka samoprzylepna	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)	Technologie życiowe	10010-049
DMSO	Sigma 472301
Acetonitryl	Sigma	34998
Metanol	Sigma	34860
Chlorowodorek werapamilu	Sigma	V4629
Sól sodowa diklofenaku	Sigma	93484
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	Fisher Scientific	15-250-061
Etanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-451
2010 Geno/Grinder	SPEX SamplePrep	2010
Akcesoria do homogenizatora młynka do koralików, metalowe kulki luzem	Fisher Scientific	15-340-158
484R Cobalt 60 Naświetlacz	JL Shepard	7810-484-1
INCYTO  Jednorazowe hemacytometry C-Chip	Fisher Scientific	22-600-100
Mikroskop światła pionowego	Leica	DM1000
Binarny system chromatografii cieczowej	Agilent	1260	Multi-compenent
Spektrometr masowy	AB Sciex	4000

Covance-HN878