Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

DOI:

10.3791/55567

⸱

2 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory dostępne chirurgiczne i farmakologiczne metody leczenia chorób sercowo-naczyniowych (CVD) są ograniczone i często paliatywne. Jednocześnie terapie genowe i komórkowe są bardzo obiecującymi alternatywnymi metodami leczenia chorób układu krążenia. Jednak szerokie zastosowanie kliniczne terapii genowej jest znacznie ograniczone przez brak odpowiednich systemów dostarczania genów. Opracowanie odpowiednich wektorów dostarczania genów może stanowić rozwiązanie obecnych wyzwań w terapii komórkowej. W szczególności istniejące wady, takie jak ograniczona wydajność i niska retencja komórek w uszkodzonym narządzie, można przezwyciężyć poprzez odpowiednią inżynierię komórkową (tj. genetyczną) przed przeszczepem. Prezentowany protokół opisuje wydajną i bezpieczną przejściową modyfikację komórek śródbłonka za pomocą wektora dostarczania opartego na superparamagnetycznych nanocząstkach magnetycznych polietylenoiminy (PEI/MNP). Zdefiniowano również algorytm i metody charakterystyki komórek. Pomyślne wewnątrzkomórkowe dostarczanie mikroRNA (miR) do ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostało osiągnięte bez wpływu na żywotność komórek, funkcjonalność lub komunikację międzykomórkową. Co więcej, udowodniono, że takie podejście powoduje silny efekt funkcjonalny w przypadku wprowadzonego egzogennego miR. Co ważne, zastosowanie tego wektora opartego na MNP zapewnia namagnesowanie komórek, wraz z towarzyszącymi mu możliwościami celowania magnetycznego i nieinwazyjnego śledzenia MRI. Może to stanowić podstawę dla magnetycznie sterowanych, genetycznie modyfikowanych terapii komórkowych, które mogą być monitorowane nieinwazyjnie za pomocą rezonansu magnetycznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia genowa i komórkowa to potężne narzędzia, które mają potencjał, aby rozwiązać obecne wyzwania w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych. Pomimo faktu, że oba te podejścia są obecnie testowane w badaniach klinicznych, nie są jeszcze gotowe do szerokiego zastosowania klinicznego1. Warto zauważyć, że powszechnym podejściem do radzenia sobie z wyzwaniami związanymi z terapią genową i komórkową jest opracowanie wielofunkcyjnych wektorów dostarczania genów odpowiednich do zastosowań klinicznych. Brak bezpiecznych i wydajnych systemów dostarczania genów jest głównym problemem terapii genowej. Jednocześnie, inżynieria genetyczna produktów komórkowych przed przeszczepem może przezwyciężyć poważne wyzwania związane z terapią komórkową, takie jak niska skuteczność (np. w dziedzinie serca tylko ~ 5% poprawy funkcjonalnej osiąga się po przeszczepie komórek macierzystych1) i słaba retencja/wszczepienie w miejscu urazu (tj. retencja komórek spada poniżej 5 - 10% w ciągu kilku minut do godzin po aplikacji, Niezależnie od ścieżki administracyjnej2,3,4).

Do tej pory, wektory wirusowe znacznie przewyższają systemy niewirusowe pod względem skuteczności, co zaowocowało ich szerszym zastosowaniem w badaniach klinicznych (~ 67%)5. Jednak nośniki wirusa niosą ze sobą poważne zagrożenia, takie jak immunogenność (i następująca po niej reakcja zapalna z poważnymi powikłaniami), onkogenność i ograniczenia w wielkości przenoszonego materiału genetycznego6. Ze względu na te obawy dotyczące bezpieczeństwa i wysokie koszty produkcji wektorów wirusowych, w niektórych przypadkach preferowane jest stosowanie systemów niewirusowych7,8. Jest szczególnie przydatny w przypadku zaburzeń, które wymagają przejściowej korekty genetycznej, takich jak ekspresja czynników wzrostu kontrolujących angiogenezę (np. w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych) lub dostarczanie szczepionek.

W naszej grupie zaprojektowano system dostarczania polegający na połączeniu rozgałęzionych 25-kDa polietylenoiminy (PEI) i superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (MNP) połączonych ze sobą przez interakcję biotyna-streptawidyna9. Wektor ten jest potencjalnym narzędziem inżynierii genetycznej komórek, pozwalającym na ich jednoczesne namagnesowanie przed przeszczepem. To ostatnie stanowi podstawę do naprowadzania/zatrzymywania magnetycznego, co jest szczególnie obiecujące w dzisiejszych czasach, ponieważ z powodzeniem rozwijane są zaawansowane techniki kierowania magnetycznego10. Co więcej, powstałe komórki reagujące magnetycznie mogą być potencjalnie nieinwazyjnie monitorowane za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) lub obrazowania cząstek magnetycznych11,12.

W przypadku wektora PEI/MNP, poliamina zapewnia kondensację kwasów nukleinowych, a tym samym ochronę przed czynnikami degradującymi, internalizacją wektora w komórkach i ucieczką endosomalną5. MNP uzupełniają właściwości PEI, nie tylko pod względem prowadzenia magnetycznego, ale także poprzez zmniejszenie znanej toksyczności PEI7,13,14. Wcześniej właściwości wektora PEI/MNP były dostosowywane pod względem wydajności dostarczania (tj. pDNA i miRNA) oraz bezpieczeństwa przy użyciu fibroblastów i ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych15,16.

W tym manuskrypcie opisany jest szczegółowy protokół dotyczący stosowania PEI/MNPs do generowania komórek modyfikowanych miRNA17. W tym celu stosuje się HUVEC, które stanowią uznany model angiogenezy in vitro. Są trudne do przetransfekcji i są podatne na działanie toksyczne18,19,20. Ponadto udostępniamy algorytm do oceny takich komórek in vitro, w tym ich celowania, komunikacji międzykomórkowej i wykrywania MRI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pępowiny do izolacji komórek zostały pozyskane po porodzie od poinformowanych, zdrowych kobiet, które wyraziły pisemną zgodę na wykorzystanie tego materiału do badań zgodnie z Deklaracją Helsińską. Komisja etyczna Uniwersytetu w Rostocku zatwierdziła przedstawione badanie (nr rej. A 2011 06, przedłużony 23 września 2013 r.).

1. Przygotowanie kompleksów transfekcyjnych

  1. Biotynylacja polietylenoiminy (PEI).
    1. Rozgałęziony PEI rozpuścić w ultraczystej wodzie pod mieszaniem magnetycznym przy 300 - 400 obr./min przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT) i chronić przed światłem w celu uzyskania roztworu o masie 0,18 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
    2. Zmierz stężenie pierwszorzędowych grup aminowych w otrzymanym roztworze21,22.
      1. Użyj 2% roztworu odczynnika ninhydryny jako odczynnika do wykrywania amin23, mieszając 100 μl wstępnie rozcieńczonej próbki (1:200 z ultraczystą wodą) i 75 μl odczynnika ninhydryny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 80 °C. Schłodzić i dodać 100 μl 50% etanolu w celu stabilizacji. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm na spektrofotometrze absorpcyjnym.
      2. Utwórz krzywą standardową przy użyciu glicyny.
        1. Przygotować 0,1 M roztwór podstawowy amino-N (0,75 g glicyny w 100 ml wody dejonizowanej) i jego rozcieńczenia, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:100, 1:200 i 1:400, 1:600. Zmierz te roztwory jak w kroku 1.1.2.1 i utwórz wykres ze stężeniem i absorbancją na osiach.
        2. Na podstawie otrzymanego wykresu i zmierzonej absorbancji roztworu PEI określić stężenie grup α-aminowych w PEI.
          UWAGA: Uwaga. Roztwór odczynnika Ninhydrin musi być używany wyłącznie pod maską i powinien być przechowywany w atmosferze azotu. Nie nadaje się do użytku, gdy kolor roztworu zmienia się w wyniku utleniania.
    3. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić 100 mg łącznika biotyny w ultraczystej wodzie, aby uzyskać roztwór o wielkości 0,01 mM. Obliczyć wymaganą ilość biotyny do dodania do PEI, mnożąc stężenie grup α-aminowych w PEI (mierzone w kroku 1.1.2) przez 20 w celu uzyskania niezbędnej ilości (w molach) odczynnika biotynylowego.
      1. Dodać roztwór biotyny do roztworu PEI o pH 8-9 i inkubować przez 16 godzin przy mieszaniu magnetycznym w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć nieprzereagowaną biotynę za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar23. Stosować dostępne w handlu kolumny zawierające żelowe medium filtracyjne odpowiednie do oczyszczania PEI 25 kDA i postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Pobrać podwielokrotności po oczyszczeniu w celu zmierzenia stężenia aminy za pomocą odczynnika do wykrywania amin (etap 1.1.2) i określenia skuteczności koniugacji biotyny (etap 1.2.2). Otrzymany biotynylowany PEI należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Charakterystyka biotynylowanego PEI.
    1. Oznaczyć stężenie grup α-aminowych w PEI po biotynylacji, jak opisano w kroku 1.1.2.
    2. Określ stopień biotynylacji PEI, aby zweryfikować procedurę koniugacji. Do oceny ilościowej należy użyć dostępnego na rynku zestawu, który opiera się na zastosowaniu barwnika HABA (kwas 4'-hydroksyazobenzeno-2-karboksylowy), aby zapewnić prawidłowe kolorymetryczne określenie poziomów biotynylacji24,25. Postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta.
  3. Filtracja MNP i ich charakterystyka.
    1. Przefiltruj dostępny na rynku MNP pokryty streptawidyną przez filtr napędzany strzykawką 0,45 μm16 w celu wykluczenia większych toksycznych agregatów. Zmierz końcowe stężenie żelaza za pomocą standardowego testu fotometrycznego26.
    2. Zbadaj jakość przefiltrowanych MNP, rejestrując krzywą namagnesowania i obrazując TEM zgodnie ze standardowymi protokołami27,28.
      1. Rozcieńczyć zawiesinę MNP wodą destylowaną i umieścić 3 μl otrzymanej zawiesiny na siatce miedzianej pokrytej węglem Formvar o oczkach 300 w celu przeprowadzenia analizy TEM. Następnie umieść tę siatkę na szklanym szkiełku na płycie grzewczej i pozostaw do wyschnięcia.
      2. Przeanalizować próbkę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego pod napięciem 120 kV i zweryfikować zawartość pierwiastków za pomocą detektora promieniowania rentgenowskiego27.
  4. Znakowanie 3-kolorowe kompleksów transfekcyjnych do mikroskopii superrozdzielczej.
    1. Oznaczyć 0,5% zmierzonych pierwszorzędowych grup aminowych w PEI barwnikiem NHS-Ester Atto 488 zgodnie z instrukcjami producenta. Usunąć nadmiar niezwiązanego barwnika za pomocą chromatografii wykluczającej według wielkości, jak opisano powyżej (etap 1.1.4). Zmierzyć wynikowe stężenie grup aminowych za pomocą testu ninhydryny (krok 1.1.2).
    2. Oznaczyć dostępny w handlu zaszyfrowany miR (scr-miR) barwnikiem cyjanininy5 za pomocą odpowiedniego zestawu do etykietowania15 (wskazanego w Wykazie Materiałów). Zmierzyć otrzymane stężenie fluoroforu-miR spektrofotometrycznie.
    3. Świeżo oznaczyć MNP za każdym razem barwnikiem sprzężonym z biotyną (np. atto 565-biotyna) w stosunku 1:1,000 w/w. Barwnik należy nakładać bezpośrednio po dodaniu MNP do miR / PEI podczas tworzenia kompleksów transfekcyjnych, zgodnie ze szczegółami w Delyangina i wsp.16.

2. Przygotowanie komórek

  1. Izolacja HUVEC.
    1. Wyizoluj komórki z pępowiny bezpośrednio po uzyskaniu pępowiny za pomocą trawienia kolagenazą z wnętrza żyły pępowinowej; postępuj zgodnie z wcześniej opracowanym protokołem29.
      1. Inkubować każdą pępowinę z ~ 60 jednostkami/ml roztworu kolagenazy typu IV w buforze - załadowanym do żyły pępowinowej - w temperaturze 37 °C przez 13 minut.
    2. W przypadku wszystkich eksperymentów należy zebrać HUVEC od co najmniej 5 pacjentów.
      UWAGA: Uprawa nie powinna przekraczać 4-5 pasaży. Nie należy używać komórek zanieczyszczonych mykoplazmą, ponieważ powoduje to spadek skuteczności transfekcji. Skażenie mykoplazmą powinno zostać zbadane przed rozpoczęciem protokołu przy użyciu zestawu PCR do bardzo czułego wykrywania mykoplazm.
      1. Test na obecność mykoplazmy.
        1. Odwirować 1 ml supernatantu do hodowli komórkowych przez 10 minut (13 000 x g). Zawiesić osad w 17 μldH2O i gotować (93 °C) przez 3 minuty. Użyj 2 μl zawiesiny do amplifikacji regionu DNA, który koduje wysoce konserwatywne rybosomalne RNA (16S-rRNA) różnych gatunków mykoplazmy.
        2. Przeprowadzić PCR przy użyciu 10 pmol każdego startera (starter do przodu: 5′-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3′; starter odwrotny: 5′-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3′) w połączeniu z komercyjnym zestawem PCR w następujących warunkach: 94 °C przez 3 min; 45 cykli po 94 °C przez 30 s, 50 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
        3. Analizować produkt PCR (292 pz) za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    3. Otrzymane komórki należy przechowywać przez długi czas w ciekłym azocie lub hodować je w śródbłonkowym pożywce wzrostowej uzupełnionej 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  2. Charakterystyka HUVEC.
    1. Scharakteryzuj izolowane HUVEC pod względem ich zdolności funkcjonalnej do budowania rurek w macierzy błony podstawnej (np. Matrigel) i ekspresji markera śródbłonka CD31 (cząsteczka adhezyjna komórek śródbłonka płytek krwi, PECAM-1) zgodnie ze standardowymi protokołami30,31.

3. Transfekcja

  1. Trypsynizować podstawową hodowlę HUVEC (patrz krok 4.1.2) i ręcznie policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiewaj HUVEC na plastikowych płytkach dołkowych do hodowli komórkowych o odpowiedniej wielkości, o początkowej gęstości komórek około 13 000 komórek/cm2 powierzchni wzrostu, 48 godzin przed transfekcją, aż do osiągnięcia 70-80% zbieżności.
  2. Za każdym razem przygotuj świeże kompleksy miR/PEI/MNP.
    UWAGA: Najpierw należy uzyskać kompleksy miR/PEI (kroki 3.2.1 - 3.2.3); następnie MNP należy dodać do roztworu miR/PEI (krok 3.2.4) w celu uzyskania ostatecznej formuły miR/PEI/MNP użytej do transfekcji (krok 3.3).
    1. Obliczyć ilość odpowiedniego, dostępnego w handlu miR (zaszyfrowanego, oznakowanego lub funkcjonalnego, zob. krok 4), korzystając ze stężenia zapasu dostarczonego przez producenta. Użyj 2,5 pmol miR/cm2 powierzchni wzrostu komórki. Rozcieńczyć miR w 5% roztworze glukozy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 pmol miR/μL.
    2. Na podstawie ilości miR z kroku 3.2.1 i optymalnego stosunku NP 2532, oblicz wymaganą ilość PEI, używając zmierzonego stężenia (krok 1.1.2). Rozcieńczyć PEI (na obliczoną wymaganą objętość) w równej objętości 5% roztworu glukozy. Dodać otrzymany wstępnie rozcieńczony PEI do roztworu miR (z kroku 3.2.1) i wirować otrzymaną mieszaninę przez 30 s.
    3. Otrzymaną mieszaninę miR/PEI inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Sonikować MNP przy 35 kHz przez co najmniej 20 minut w sonikacyjnej łaźni wodnej (patrz Lista Materiałów) w temperaturze RT, dodać odpowiednią ilość roztworu MNP do miR/PEI (5 - 25 μg żelaza/ml przygotowanej mieszaniny miR/PEI/MNP16), wirować przez 30 s i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aż będzie gotowy.
  3. Przygotowaną mieszaninę miR/PEI/MNP dodawać kroplami bezpośrednio do pożywki hodowlanej na komórkach. Otrzymaną mieszaninę pożywki do hodowli komórkowych z miR/PEI/MNP rozcieńczoną w glukozie należy użyć jako roztworu do transfekcji. Zastąp tę mieszaninę świeżą pożywką hodowlaną 6 godzin po transfekcji.

4. Analiza bezpieczeństwa wektorów

  1. Badanie żywotności komórek.
    1. Transfekować HUVEC wysiane na 24-dołkowej płytce hodowlanej (kroki 3.1 i 3.2); użyć Cy3-miR jako sond testowych i zakodowanych miR (scr-miR) jako kontrolnych sond bramkujących do cytometrii przepływowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 24 godziny.
    2. Zebrać supernatant i transfekowane komórki przez trypsynizację przy użyciu 1x trypsyny-EDTA rozcieńczonej w PBS dodanej do komórek przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Wirować przy 300 x g przez 10 minut i użyć do analizy.
    3. Zbadaj żywotność komórek i wydajność absorpcji miR 24 godziny po transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej, stosując dostępne w handlu barwienie w celu rozróżnienia żywych i martwych komórek; użyj standardowych protokołów15. Stosować nietransfekowane komórki jako pozytywną kontrolę żywotności.
  2. Zbadaj bezpieczeństwo kompleksów miR/PEI/MNP dla komórek w testach funkcjonalnych.
    1. Oceń aktywność proliferacyjną transfekowanych komórek.
      1. Transfekcyjne HUVEC wysiewane na 12-dołkowej płytce hodowlanej (kroki 3.1 i 3.2) z funkcjonalnym antysensownym miR (np. anty-miR92a dla HUVEC31) i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 24 godziny.
      2. Użyj dostępnego na rynku zestawu, aby określić liczbę proliferujących komórek poprzez barwienie EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyna) i skanowanie za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej. Użyj następujących ustawień mikroskopii: obiektyw 40X z zanurzeniem w olejku; laser wzbudzający 633 nm (dla barwnika 647 nm); 5 losowych pól, które należy zarejestrować w każdej próbce. Oblicz szybkość proliferacji komórek, dzieląc liczbę jąder barwionych EdU przez całkowitą liczbę jąder (barwione Hoechstem).
    2. Oceń zdolność transfekowanych komórek do tworzenia struktur przypominających rurki, zgodnie z wcześniejszym opisem17,31.
      1. Zawiesiny HUVEC wysiane na 24-dołkowej płytce hodowlanej (etapy 3.1 i 3.2) należy przetransfekować scr-miR i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 . Zebrać transfekowane komórki (jak w kroku 4.1.1).
      2. Wysiew 3,5 x 104 zmodyfikowanych HUVEC w 24-dołkowych płytkach pokrytych 140 μl macierzy błony podstawnej. Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
      3. Rejestruj obrazy 10 losowych pól w każdej studzience za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej (różnicowa interferencja kontrastowa) i analizuj za pomocą oprogramowania ImageJ z wtyczką "Angiogenesis Analyzer". W ocenie uwzględnij takie parametry, jak całkowita długość odgałęzień, liczba rozgałęzień i liczba skrzyżowań. Porównaj to z nieleczoną kontrolą.
  3. Zbadaj możliwy toksyczny wpływ kompleksów transfekcyjnych na komunikację międzykomórkową za pośrednictwem złącza szczelinowego (GJ) (GJIC), testując odzyskiwanie fluorescencji 3D po fotowybielaniu (FRAP)33 w 3D.
    1. Zasiaj komórki na szkiełkach pokrytych żelatyną z cienkim dnem odpowiednim do obrazowania żywych komórek (zanurzenie w oleju). Przetransfekować komórki w sposób opisany powyżej w kroku 3.2 za pomocą nieznakowanego, niefunkcjonalnego miR (scr-miR) i inkubować przez 24 godziny.
    2. Przygotuj komórki do obrazowania, ładując je kalceiną bezpośrednio przed mikroskopią. W szczególności należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką zawierającą 5 μM kalceiny, inkubować przez 20 minut, przemyć PBS i dodać świeżą pożywkę hodowlaną. Rozgrzej inkubator mikroskopu do 37 °C i dostosuj stężenie CO2 do 5%.
      UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być ciepłe, aby uniknąć skurczu komórek przed pomiarem.
    3. Użyj lasera wzbudzającego 561 nm do wizualizacji komórek i eksperymentu FRAP. Najpierw ręcznie wybierz komórki do pomiaru jako obszary zainteresowania (ROI); Komórki testowe powinny mieć co najmniej 3 sąsiadujące ze sobą komórki. Zdefiniuj komórkę odniesienia o jasnej, stabilnej fluorescencji, która nie zostanie wybielona. Zdefiniuj limity stosu z. Zapisz fluorescencję od góry komórek do dołu, aby uwzględnić 10-15 warstw.
    4. Wybielić badane komórki za pomocą 100% mocy lasera i zarejestrować późniejszy odzysk fluorescencji (spowodowany specyficznym dla GJ transferem barwnika z sąsiednich komórek) w ciągu następnych 15 minut. Rejestruj surowe dane w stosach z co 60 s. W sumie należy wykonać pomiary FRAP z nie mniej niż 5 - 10 komórkami testowymi na eksperyment. Porównaj wyniki z komórkami nietransfekowanymi.

5. Testowanie efektywności transfekcji

  1. Badanie wychwytu miR.
    1. Przygotuj sondy zgodnie z opisem w kroku 4.1 i użyj ich jednocześnie do określenia wychwytu miR za pomocą cytometrii przepływowej.
  2. Potwierdź i opisz wewnątrzkomórkową lokalizację kompleksów transfekcyjnych za pomocą konfokalnej i nadrozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM).
    1. Wysiewać HUVEC na pokrytych żelatyną szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowych płytek hodowlanych, jak opisano wcześniej (krok 3.1). Przetransfekować komórki za pomocą znakowanego 3-kolorem miR/PEI/MNP (krok 1.4) i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
    2. Szkiełka nakrywkowe należy najpierw przemyć 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie tylko PBS. Napraw komórki poprzez inkubację w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 37 °C przez 15 minut i wybarwić jądra DAPI zgodnie ze standardowymi protokołami16. Umyj 3 razy na shakerze (15 minut każdy), aby usunąć nadmiar barwnika.
      UWAGA: PFA jest rakotwórczy i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    3. Przygotowane szkiełka nakrywkowe umieścić na szkiełkach mikroskopowych za pomocą odpowiedniego podłoża mocującego, pozostawić do wyschnięcia na co najmniej 1 godzinę i użyć ich do mikroskopii, jak opisano poniżej.
    4. Rejestruj obrazy za pomocą obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 63X i następujących ustawień karty SIM: linie laserowe 405, 488, 561 i 633 nm do wzbudzenia; tryb Z-Stack z 32-bitową głębią pod 5 kątami, 5 fazami, ze średnią 4; Siatka G2 z linią laserową 405, G3 z 488, G4 z 561 i G5 z 633.
  3. Oceń funkcjonalność dostarczonego miR za pomocą RT-qPCR w miR/PEI/MNP-HUVEC w porównaniu z nieleczonymi.
    1. Transfekcję HUVEC wysianych na 12-dołkowej płytce hodowlanej etapy (3.1 i 3.2) z funkcjonalnym antysensownym miR (np. anty-miR92a dla HUVECs31) i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
    2. Oceń dostarczanie i przetwarzanie anty-miR92a za pomocą RT-qPCR przy użyciu dostępnych na rynku zestawów (patrz materiały); postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano w innym miejscu17,31. Równolegle zbadaj ekspresję docelowego genu (np. ITGA531).
      UWAGA: Dostarczanie AntagomiR przeciwko endogennemu miR jest preferowane w stosunku do mimiki, ponieważ zapewnia pomiar rzeczywistego wyniku miR, a nie tylko jego akumulacji wewnątrzkomórkowej.

6. Ocena celowania w komórki i magnetyczna separacja komórek

  1. Celowanie w komórki w warunkach statycznych in vitro.
    1. Transfekować HUVEC na 24-dołkowej płytce (2,5 pmol/cm2 scr-miR, NP 25 i 15-25 μg/ml MNP), inkubować przez 24 godziny, przemyć i zebrać zgodnie z powyższym opisem (krok 4).
    2. Wymieszaj osad komórkowy otrzymany z 1 dołka z 1 ml świeżej pożywki hodowlanej i umieść go w dołkach 12-dołkowej płytki. Przymocuj mały magnes lokalnie (z boku) na dole płyty za pomocą taśmy.
    3. Inkubować zawiesinę komórek przez 24 godziny i obserwować przyczepianie się i wzrost komórek w obszarze nad magnesem oraz w obszarze bez magnesu. Do oceny jakościowej należy użyć konwencjonalnego mikroskopu odwróconego.
  2. Celowanie w komórki w symulowanych warunkach dynamicznych in vitro.
    1. Transfekować HUVEC na 24-dołkowej płytce zgodnie z etapami 3.1 i 3.2 (2,5 pmol/cm2 Cy3-miR, NP 25 i 15 - 25 μg/ml MNP), inkubować przez 24 godziny, przemywać i zbierać przez trypsynizację przy użyciu 1x trypsyny-EDTA rozcieńczonej w PBS dodawanej do komórek przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Wirować przy 300 x g przez 10 min.
    2. Wymieszaj osad komórkowy uzyskany z 1 dołka z 1 ml świeżej pożywki hodowlanej i umieść go w dołku na 12-dołkowej płytce. Przymocuj mały magnes lokalnie (z boku studni) za pomocą taśmy. Umieścić płytkę hodowlaną na wytrząsarce i inkubować zawiesinę komórek przez 12 godzin z prędkością 150 obr./min, aby zasymulować warunki dynamiczne34.
    3. Umyj komórki i utrwal je za pomocą 4% PFA. Wybarwić jądra za pomocą DAPI16. Rejestruj przyczepienie komórek za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej z laserem wzbudzającym 514 nm, trybem z-stack (5 - 12 warstw) w celu uzyskania surowych danych i przetwarzaniem obrazu projekcyjnego o maksymalnej intensywności w celu tworzenia obrazów do analizy.
  3. Analiza ilościowa komórek reagujących i niereagujących magnetycznie.
    1. Transfekować HUVEC na 24-dołkowej płytce (2,5 pmol/cm2 scr-miR, NP 25 i 15-25 μg/ml MNP), inkubować przez 24 godziny, przemyć i zebrać zgodnie z opisem powyżej (krok 6.2.1). Wstępnie podgrzany PBS i bufor do sortowania komórek (sterylizowany przez filtrację, patrz Wykaz materiałów) do temperatury 37 °C. Ponownie zawiesić osad komórkowy uzyskany z każdej studzienki za pomocą 500 μl buforu do sortowania komórek.
    2. Nałóż tę zawiesinę komórek na magnetyczne kolumny sortujące zamocowane za pomocą dostarczonego magnesu, umyj kolumny na magnesie 3 razy świeżym buforem do sortowania komórek i zbierz przepływ jako frakcję magnetycznie niereagującą (mag-).
    3. Wyjmij kolumny z magnesu i natychmiast zbierz magnetycznie reagującą frakcję komórek (mag+), przepychając świeży bufor do sortowania komórek przez kolumnę za pomocą tłoka.
    4. Odwirować zarówno mag-, jak i mag+ przy 300 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS, policzyć komórki i ocenić żywotność komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego35. Otrzymany osad komórkowy należy wykorzystać do długoterminowej analizy (tj. ponownego zasiania i oceny po 24, 48 i 72 godzinach w culture17) lub bezpośrednio do cytometrii przepływowej (krok 4.1.).
  4. Określ obciążenie żelazem transfekowanych komórek.
    UWAGA: Podczas przygotowania należy unikać kontaktu sond celowych z materiałami i narzędziami z tlenku żelaza.
    1. Zebrać transfekowane HUVEC i nietransfekowaną kontrolę (jak w kroku 4.1.1). Zebrane komórki przemyć dwukrotnie w 2% BSA w PBS36, ostrożnie mieszając komórki z 1 ml tego buforu myjącego, a następnie odwirowując przy 300 x g przez 10 min. Otrzymany osad komórkowy zawiesić ponownie w 250 μl PBS, dodać 100 μl 4% PFA i inkubować przez 20 minut w celu utrwalenia komórek. Umyj 3 razy PBS, jak opisano powyżej.
    2. Ponownie zawiesić powstały osad o stałych komórkach w 110 μl PBS i przenieść go do probówek PCR o pojemności 100 μl.
      1. Weź 10-μl podwielokrotności do zliczania komórek, a pozostałą próbkę użyj do spektroskopii magnetyczno-cząsteczkowej (MPS).
    3. Wykonaj pomiar na dostępnym na rynku urządzeniu MPS. Podczas pomiaru należy zastosować następujące ustawienia: pole magnetyczne Bnapęd = 25 mT i częstotliwość f0 = 25 kHz. W celu ilościowego oznaczania zawartości żelaza w próbkach, należy znormalizować trzecią harmoniczną A3 widma MPS do odpowiadającej jej A3,ref próbki referencyjnej MNP o znanej zawartości żelaza 2,1 μg37. Używaj nieleczonych komórek jako kontroli.

7. Definiowanie limitów wykrywania MRI

  1. Przygotowanie komórek.
    1. Wysiać HUVEC na płytce 6-dołkowej i transfekować (2,5 pmol/cm2 scr-miR, NP 25 i 15 - 25 μg/ml MNP) w duplikatach lub trzykrotnościach zgodnie z wymaganą ilością komórek (do przygotowania fantomowego). Inkubować komórki przez 24 godziny, umyć, zebrać i utrwalić je 4% PFA, jak opisano wcześniej (krok 4).
    2. Policz otrzymane komórki, przygotuj porcje o odpowiednich numerach komórek (np. 103, 104, 105 itd.) i dostosuj ich objętość do 50 μL.
  2. Preparat fantomowy z agarozy
    1. Przygotuj kilka warstw 2% agarozy w probówkach o pojemności 50 ml z różnymi ilościami transfekowanych komórek osadzonych między warstwami38. Podczas przygotowania, poddaj sonikacji i odwiruj gorącą agarozę38, aby zniszczyć pęcherzyki powietrza, które powodują artefakty.
      UWAGA: Co ważne, fantomy zawierające 5,5 x 105 HUVEC poddane działaniu niemagnetycznych kompleksów miR/PEI powinny być przygotowane w ten sam sposób, aby służyły jako kontrole.
  3. Zeskanuj uzyskane fantomy in vitro za pomocą systemu MRI zwierząt 7,1 T po umieszczeniu fantomu centralnie w cewce, równolegle do osi z pola magnetycznego.
    1. Zastosować następujące parametry sekwencji dla akwizycji sekwencji gradientowo-echowej: TR = 66 ms; TE1/TE2/TE3/TE4/TE5/TE6 = 1,44/2,88/4,51/6,11/7,60/9,01 ms; kąt odwrócenia = 3°; macierz = 128 × 128, interpolowana do 256 x 256; pole widzenia = 42 mm; 100%; średnie = 1, długość pociągu echa = 1; grubość plastra = 1,5 mm; i 16 plasterków.
    2. Oceń zanik sygnału we wszystkich czterech czasach echa i oblicz mapy R2* (R2* = 1/T2*) za pomocą odpowiedniego oprogramowania, jak opisano w innym miejscu39.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem proponowanego protokołu jest wyprodukowanie magnetycznie reagujących komórek zmodyfikowanych miR i przeprowadzenie ich dokładnej charakterystyki (Rysunek 1). W rezultacie należy uzyskać skutecznie transfekowane komórki, reagujące na selekcję i naprowadzanie magnetyczne oraz wykrywalne za pomocą MRI.

Po pierwsze, tożsamość izolowanych HUVEC została potwierdzona przez typowe barwienie markerem śródbł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja genetycznie modyfikowanych komórek obciążonych superparamagnetycznymi nanocząstkami w celu ich dalszego sterowania magnetycznego jest przedstawiona w obecnym protokole. Skuteczne zastosowanie tej strategii pozwala na rozwiązanie niektórych trudności związanych z terapią komórkową, takich jak niska retencja i słabe wszczepienie w uszkodzony obszar 2,3,4, poprzez dostarczenie docelowego produktu komórkowego do przeszczep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować G. Fulda (Centrum Mikroskopii Elektronowej, Uniwersytet w Rostocku, Niemcy) za wsparcie techniczne w pozyskiwaniu obrazów TEM przefiltrowanych superparamagnetycznych nanocząstek i w przeprowadzaniu ich analizy rentgenowskiej. Prace prowadzone w RTC Rostock były wspierane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Niemiec (FKZ 0312138A, FKZ 316159 i VIP+03VP00241) oraz kraj związkowy Meklemburgia-Pomorze Przednie z funduszy strukturalnych UE (ESF/IV-WM-B34-0030/10 i ESF/IV-BM-B35-0010/12) oraz przez DFG (DA 1296-1), Damp-Foundation i German Heart Foundation (F/01/12). Frank Wiekhorst otrzymał wsparcie w ramach unijnego programu badawczego "Nanomag" FP7-NMP-2013-LARGE-7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335
PD-10 Kolumny odsalająceGE Healthcare17085101zawierające Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Roztwór odczynnika 2%Sigma Aldrich7285
GlycineSigma Aldrich410225
Zestaw do kwantyfikacji biotynyPierce Thermo Scientific28005
Czytnik mikropłytek Model 680Bio-Rad
Streptawidyna MagneSphere Cząstki paramagnetycznePromegaZ5481
Millex-HV Filtr PVDF MerckSLHV013SL0,45 i mikro; m
Transmisyjny mikroskop elektronowy Libra 120ZeissNapięcie przyspieszenia 120 
Detektor promieniowania rentgenowskiego kV SapphireEDAX-Amatek
Plastikowa hodowla komórkowaTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label Zestaw ITMirus BioMIR 9650
Biotyna Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
Kolagen Typ IV GibcoThermo Scientific17104019
Podłoże do wzrostu śródbłonka, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
Penicylina/StreptomycynaThermo Scientific 15140122100 U/mL, 100 &mikro; g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
przeciwciało anty-PECAM-1Santa Cruzsc-1506
MS kolumny MACSMiltenyi Biotec 130-042-201
Zestaw do barwienia żywych/martwych komórek w bliskiej podczerwieniThermo ScientificL10119
Cy3 Znakowana barwnikiem kontrola negatywna Pre-miRThermo ScientificAM17120"Cy3-miR" lub "Cyanina-miR3" w manuskrypcie
Cząsteczki prekursorowe miRNA Pre-miR - kontrola negatywna Thermo ScientificAM17110"scr-miR" w manuskrypcie Syntetyczny
inhibitor anty-has-miR92a-3p System Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1Zeiss
ParaformaldehydeSigma Aldrich1581274% roztwór w
barwieniu jądrowym PBS DAPIThermo ScientificD1306
Zestaw do izolacji RNA NucleoSpinMachery-Nagel740955
mirVana Zestaw do izolacji miRNAThermo ScientificAM1560
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqManThermo Scientific4366596
System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlusApplied Biosystems
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo Scientific4368814
has-miR-92a Test TaqManThermo Scientific000431Sekwencja dojrzałego miRNA: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 Test TaqManTest Thermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B Test TaqManThermo Scientific001093
18S rRNA Kontrola endogennaThermo Scientific4333760F
ŻelatynaSigma AldrichG7041
CellTrace Calcein Czerwono-pomarańczowyThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS buforMiltenyi Biotec 130-091-221
AgarozaSigma AldrichA9539
7.1 System MRI zwierząt TeslaOprogramowanie Bruker CorporationA7906
ImageJNational Institutes of Healthzaktualizowane o urządzenie AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPSBruker Biospin
MatlabMathworks
Magnes pierścieniowy neodymowy magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; remanescencja wynosi ~ 1,3  T, przymus ≥ 955 kA/m
Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 647Thermo ScientificC10340
Odczynnik FluorSaveMerck345789
Kąpiel ultradźwiękowaBandelin elektronicznaTyp: RK 100 SH
Oprogramowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27(2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023(2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23(1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159(2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30(2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85(2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184(2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149(2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Endothelial CellsMicroRNA DeliveryMagnetic NanoparticlesCell TransfectionConfocal MicroscopyFlow CytometryCell ViabilityTube FormationGap Junction CommunicationMRI Tracing

Powiązane artykuły