Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowy test na zimną nocycepcję u larw Drosophila

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55568

⸱

3 kwietnia 2017

 ,  , 
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy nowatorski test do badania zimnej nocycepcji u larw Drosophila. Test ten wykorzystuje specjalnie skonstruowaną sondę Peltiera, zdolną do zastosowania ogniskowego szkodliwego bodźca zimna i skutkuje wymiernymi zachowaniami specyficznymi dla zimna. Technika ta pozwoli na dalszą komórkową i molekularną sekcję zimnej nocycepcji.

Streszczenie

Jak organizmy wyczuwają i reagują na szkodliwe temperatury, jest nadal słabo zrozumiane. Co więcej, mechanizmy leżące u podstaw uwrażliwienia maszynerii sensorycznej, takie jak u pacjentów doświadczających neuropatii obwodowej lub uczulenia wywołanego urazem, nie są dobrze scharakteryzowane. Genetycznie podatny model Drosophila został wykorzystany do zbadania komórek i genów niezbędnych do wykrywania szkodliwego ciepła, co zaowocowało wieloma konserwatywnymi genami. Niewiele jednak wiadomo o komórkach i receptorach ważnych dla szkodliwego wykrywania zimna. Chociaż Drosophila nie przetrwa długotrwałej ekspozycji na niskie temperatury (≤10 ºC) i będzie unikać chłodnych, preferując cieplejsze temperatury w testach preferencji behawioralnych, to, w jaki sposób wyczuwają i prawdopodobnie unikają szkodliwych bodźców zimna, zostało zbadane dopiero niedawno.

Tutaj opisujemy i charakteryzujemy pierwszy test behawioralny na szkodliwe zimno (≤10 ºC) u Drosophila. Za pomocą tego narzędzia i testu pokazujemy badaczowi, jak jakościowo i ilościowo oceniać zimne zachowania nocyceptywne. Można to zrobić w normalnych/zdrowych warunkach hodowli lub przypuszczalnie w kontekście choroby, urazu lub uczulenia. Co więcej, test ten można zastosować do larw wybranych do pożądanych genotypów, które mogą wpływać na termoczucie, ból lub uczulenie nocyceptywne. Biorąc pod uwagę, że ból jest wysoce konserwatywnym procesem, wykorzystanie tego testu do dalszych badań nad nocycepcją termiczną prawdopodobnie pozwoli uzyskać ważne zrozumienie procesów bólowych u innych gatunków, w tym kręgowców.

Wprowadzenie

Drosophila okazała się bardzo przydatna do identyfikacji nowych konserwatywnych genów i obwodów neuronalnych, które leżą u podstaw złożonych zachowań. Muchy dostarczają wyrafinowanego zestawu narzędzi genetycznych i uproszczonego układu nerwowego, który pozwala na precyzyjną manipulację genetyczną i neuronalną1,2,3,4 do analizy komórkowych i molekularnych podstaw nocycepcji5,6,7. Larwy są szczególnie przydatne w tych analizach, biorąc pod uwagę, że testy behawioralne dla delikatnego dotyku8,9,10, szkodliwe ciepło11,12,13 i mechaniczne odczuwanie szkodliwych bodźców4,11 zostały już ustalone, a przezroczysty naskórek larwalny pozwala na żywe lub stałe obrazowanie naskórka i leżących pod nim neuronów czuciowych. Ostatnio opracowano również test na szkodliwe zimno7, który opiszemy bardziej szczegółowo tutaj.

Używając cienkiej, stożkowatej sondy do pomiaru zimna, pokazujemy, że larwy Drosophila wykazują zestaw specyficznych dla zimna zachowań reaktywnych, odmiennych od zachowań obserwowanych podczas normalnego poruszania się, po delikatnym dotyku lub po ostrych bodźcach mechanicznych lub o wysokiej temperaturze7,8,11. Zachowania specyficzne dla zimna obejmują silny skurcz całego ciała (CT), uniesienie tylnych segmentów o 45-90º (PR) i jednoczesne podniesienie przednich i tylnych segmentów do kształtu litery U (US). Częstość występowania tych zachowań wzrasta wraz ze spadkiem temperatury, ale każde z nich osiąga szczyt przy nieco innych niskich temperaturach. Ostatnie prace sugerują, że w reakcjach CT pośredniczą inne obwodowe neurony czuciowe niż te, które reagują na szkodliwe ciepło lub ostre bodźce mechaniczne7.

Podobnie jak nocyceptory kręgowców, wielorakie dendrytyczne (md) obwodowe neurony czuciowe Drosophila mają złożone struktury dendrytyczne, które arboryzują się nad naskórkiem1. Neurony MD są obecne w każdym segmencie ciała larwy, rzutując swoje aksony na brzuszny rdzeń nerwowy14. Neurony czuciowe MD są podzielone na cztery różne klasy (I-IV) w oparciu o morfologię dendrytyczną i mają różne funkcje czuciowe4,9,10,15,16,17. Podczas gdy neurony klasy IV są wymagane do reakcji larw na boczne przetaczanie ciała na wysokie temperatury lub ostre bodźce mechaniczne4, neurony klasy III są wymagane do delikatnych reakcji dotykowych9,10 i są nie tylko aktywowane przez zimno, ale są również wymagane do reakcji behawioralnych wywołanych zimnem7. Zarówno neurony klasy III, jak i klasy IV wykorzystują kanały dyskretnego przejściowego potencjału receptora (TRP), aby ułatwić reakcje behawioralne na szkodliwe7,11,18 i nieszkodliwe bodźce9,10,17,19. Co więcej, nocycepcja larw jest uwrażliwiona po urazie, na poziomie cellular20 i behawioralnym12,21.

Test opisany tutaj pozwala na ilościowe określenie normalnych lub potencjalnie zmienionych reakcji behawioralnych na niskie temperatury, począwszy od szkodliwego zimna (≤ 10 ºC), nieszkodliwego chłodu (11-17 ºC), aż do temperatury otoczenia (18-22 ºC). Niskie temperatury użyte w tym teście są zdolne do bezpośredniej aktywacji neuronów czuciowych klasy III, wywołując silny, powtarzalny wzrost wapnia i reakcje behawioralne wywołane zimnem, które można analizować jakościowo i ilościowo7. Test ten można zastosować do larw o praktycznie każdym genotypie, a także do larw narażonych na różne warunki środowiskowe (zmienione odżywianie, urazy, czynniki farmakologiczne) w celu określenia zarówno czynników genetycznych, jak i środowiskowych, które wpływają na zimną nocycepcję, uczulenie nocyceptywne lub plastyczność nocyceptywną. Biorąc pod uwagę, że termosensacja jest wszechobecna u wielu gatunków, test ten stanowi cenne narzędzie do badania nocycepcji i może odkryć nowe cele genowe lub interakcje neuronalne, które poprawią nasze zrozumienie nocycepcji kręgowców.

Specjalnie skonstruowana zimna sonda (zobacz zimna sonda, Tabela materiałów) wykorzystuje urządzenie Peltiera sterowane temperaturą w zamkniętej pętli, które chłodzi aluminiowy trzon i stożkową końcówkę poprzez przewodnictwo cieplne. Termistor jest osadzony wewnątrz aluminiowej stożkowej końcówki, która informuje o temperaturze w czasie rzeczywistym na jednostce sterującej. Radiator i wentylator są przymocowane do modułu termoelektrycznego w celu regulacji obciążenia cieplnego efektu Peltiera (Qc), tak aby można było osiągnąć żądany zakres temperatur (22-0 °C) (patrz Jednostka Kontroli Termicznej, Tabela Materiałów). Szkodliwy bodziec zimny końcówki sondy jest nakładany ręcznie na grzbietową linię środkową, na segment (segmenty) w równej odległości od przedniego i tylnego końca (mniej więcej segment A4, patrz rysunek 1A) larwy. W odpowiedzi na zimne bodźce larwy na ogół wytwarzają jedno z trzech zachowań wywołanych zimnem w ciągu 10 sekund: skurcz całego ciała (CT), podniesienie o 45-90º przednich i tylnych segmentów do kształtu litery U (US) lub podniesienie tylnych segmentów (PR) (opisane w Wyniki). Żadne z tych zachowań nie jest wykonywane podczas normalnej lokomocji perystaltycznej lub zachowań związanych z żerowaniem. Zachowania te różnią się również od delikatnych reakcji na dotyk i awersyjnej reakcji toczenia na wysoką temperaturę lub szkodliwe bodźce mechaniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie larw

  1. Hodowla stad lub krzyżówek genetycznych w inkubatorze o temperaturze 25 ºC.
    1. W przypadku hodowli krzyżówki należy użyć 20-25 dziewiczych samic i 15-20 samców na fiolkę zawierającą zwykłą pożywkę dla much z mąki kukurydzianej. Pozwól samicom złożyć jaja przez około 48 godzin przed przeniesieniem ich do nowej fiolki z pokarmem.
  2. 4-5 dni po złożeniu jaj zbierz larwy 3 stopnia rozwojowego o pożądanym genotypie, delikatnie spryskując strumień wody do papkowatego pokarmu i larw, a następnie wylej zawartość na średniej wielkości, czystą szalkę Petriego (60 mm x 15 mm).
  3. Następnie delikatnie posortuj larwy według wielkości za pomocą kleszczy lub pędzla, aby wykluczyć testowanie większych "wędrujących 3 stadiów" lub małych, chorych larw. Wyrzuć larwy zawierające jakiekolwiek niepożądane markery genetyczne lub równoważniki.
  4. Poproś kolegę z laboratorium, aby oznaczył naczynia lub pojemniki, w których zostaną umieszczone posortowane larwy, tak aby eksperymentator mógł być "ślepy" na warunki doświadczalne lub genotyp larw, jeśli ma to zastosowanie. Eksperymentator może zastosować zdekodowane etykiety do zebranych danych po eksperymencie za pomocą klucza wygenerowanego przez członka laboratorium.
  5. Za pomocą czerpaka przenieś niewielką ilość świeżej żywności na czystą, oznakowaną szalkę Petriego (35 mm x 10 mm lub 60 mm x 15 mm) wypełnioną do połowy wodą o temperaturze pokojowej.
  6. Delikatnie przenieś posortowane larwy na pokarm (aby zapobiec głodowi lub wysuszeniu, jeśli przewiduje się, że badanie potrwa dłużej niż 20 minut) za pomocą kleszczy lub pędzla.

2. Test zimnej sondy

  1. Włącz zimną sondę, pozwalając jej ostygnąć do żądanej temperatury przez kilka minut. W przypadku ustawienia na niższe temperatury, wzdłuż sondy prawdopodobnie utworzy się kondensacja.
  2. Zetrzyj nadmiar wilgoci chusteczką laboratoryjną przed nałożeniem na larwę. Gdy nie jest używany natychmiast, umieść nasadkę izolacyjną na sondzie, aby zarówno zaizolować, jak i utrzymać końcówkę w czystości i zapobiec uszkodzeniom.
  3. Umieść larwę w środkowym 3. stadium na cienkim kawałku ciemnego, ruchomego winylu (zazwyczaj użyj małego kawałka wyciętego z segregatora) pod mikroskopem jasnego pola. winyl pomaga w wizualizacji kontrastowej i w poruszaniu larwą bez dotykania jej, aby prawidłowo wyrównać ją z sondą.
  4. Dostosuj mikroskop (patrz tabela materiałów) i jednostkę światła (patrz tabela materiałów) na średnią jasność (maksymalna jasność 50-75%), aby zapewnić kontrast i zapobiec zbyt szybkiemu wysychaniu larwy.
  5. Wyrzuć wszystkie larwy, które nie wykazują najpierw normalnej lokomocji perystaltycznej, ponieważ mogą zakłócić wyniki. Larwa powinna być wilgotna od szalki Petriego z wodą, w przeciwnym razie larwa przyklei się do winylu, hamując normalne poruszanie się. Woda nie powinna tworzyć się wokół larwy.
  6. Przesuń sondę ręcznie w kierunku larwy pod kątem 90º do przednio-tylnej osi ciała, używając winylu, aby przesunąć larwę do właściwej pozycji (patrz rysunek 1A).
  7. Ustaw końcówkę sondy tak, aby delikatnie leżała na środkowej powierzchni grzbietowej larwy z sondą pod kątem około 45º do stolika mikroskopu.
  8. Po kontakcie z sondą uruchom zegar laboratoryjny. Zastosuj wystarczający nacisk w dół, aby lekko wciąć powierzchnię naskórka larwy, jednocześnie umożliwiając ruch do przodu lub do tyłu.
  9. Trzymaj sondę w miejscu do 10 s lub do momentu, gdy zaobserwuje się reakcję behawioralną wywołaną zimnem - w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Następnie wyjmij sondę.
  10. Rejestruj zaobserwowaną reakcję behawioralną i opóźnienie odpowiedzi. Larwy, które nie reagują w ciągu 10 sekund, są uważane za "niereagujące". Opóźnienia mogą być również rejestrowane dla respondentów i wykorzystywane do pomiaru zmian w odporności/amplitudzie odpowiedzi.
  11. Wyrzuć larwę i przygotuj następną.
  12. Powtarzać kroki 2.3-2.11, aż do osiągnięcia pożądanej liczby badanych larw (użyto tutaj trzech zestawów n = 20-40 larw).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Drosophila larvae poruszają się ruchem perystaltycznym, który obejmuje sporadyczne przerwy, obroty głowy i zmiany kierunku22. Jednak w odpowiedzi na miejscowe zastosowanie szkodliwego bodźca zimna larwy wykazują zestaw unikalnych zachowań, odmiennych od awersyjnego obrotu bocznego w odpowiedzi na szkodliwe ciepło i bodźce mechaniczne. Zachowania te różnią się również od reakcji na delikatny dotyk8,9

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj test może być wykorzystany do jakościowej i ilościowej oceny nocycepcji lub uczulenia nocyceptywnego u larw o różnym pochodzeniu genetycznym, wpływach środowiska i/lub stanach wywołanych uszkodzeniem. Ponieważ test ten pozwala na ogniskowe zastosowanie bodźca zimnego, za pomocą tego narzędzia można ocenić funkcję podzbioru obwodowych neuronów czuciowych, w szczególności w reagowaniu na niskie temperatury. Co ciekawe, te wywołane zimnem zachowania wydają się wykorzystywać inne klasy neuronów czuciowych niż t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

W Stanach Zjednoczonych oczekuje się na zgłoszenie patentowe (CL) dotyczące projektu zimnej sondy. Dodatkowe informacje na temat szczegółów dotyczących numerów części i konstrukcji zimnej sondy, a także dodatkowe doradztwo w zakresie projektowania narzędzi zostaną dostarczone na życzenie.

Podziękowania

Dziękujemy Sarah Wu i Camille Graham za opracowanie wczesnych faz testu zimnej sondy, Bloomington Drosophila Stock Center za hodowlę much oraz członkom laboratorium Galko za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez NIH NRSA (NIH F31NS083306) dla HNT oraz przez NIH R01NS069828, R21NS087360 i stypendium MD Anderson Clark Fellowship na Uniwersytecie Teksańskim w zakresie badań podstawowych dla MJG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cold Pro-DevEngineeringBudowane na zamówienieNumery części i szczegóły konstrukcyjne mogą być dostarczone na żądanie
Jednostka kontroli termicznejTechnologia TENiestandardowa obudowaNumery części i szczegóły konstrukcyjne mogą być dostarczone na żądanie
Mikroskop Zeiss Stemi 2000
Fiber-Lite MI-150Branże Dolan-Jenner.A20500
Schott Podwójny światłowód światłowodowy na gęsiej szyi 23 caleSchott North America, Inc.Schott A08575
KleszczeFSTFS-1670Służy do sortowania i obchodzenia się z larwami. Pamiętaj, aby lekko wygładzić i tępe końcówki kleszczy, aby zmniejszyć ryzyko przypadkowego przebicia lub zranienia larw
PędzelDick Blick Art Materials06762-1002Służy do sortowania i obchodzenia się z larwami. Jest to pomocne, jeśli pędzel jest wilgotny podczas użytkowania.
35 mm x 10 mm Polistyrenowa szalka PetriegoFalcon351008
60mm x 10 mm Polistyrenowa szalka PetriegoFalcon351007
Kawałek czarnego winylu (co najmniej 2 cale x 2 cale)Służy do zapewnienia kontrastu i orientacji larw na zimnej sondzie
Fisherbrand Scoopula SzpatułkaFisher Scientific14-357QSłuży do przenoszenia żywności
Kimtech Science KimwipesFisher Scientific06-666ASłuży do suszenia larw i zimnej sondy w przypadku nadmiaru wilgoci
Oświetlacz o wysokiej intensywności Zeiss NT55-605

Bibliografia

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
  3. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
  4. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
  5. Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
  6. Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
  7. Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
  8. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
  9. Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
  10. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  11. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
  12. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
  13. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837(2012).
  14. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  15. Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
  16. Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
  17. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343(2011).
  19. Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39(2012).
  20. Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735(2015).
  21. Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
  22. Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
  23. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).
  24. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  25. Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
  26. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  27. Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
  28. Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
  29. Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
  30. Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test bodźca zimnaodpowiedź behawioralnasonda chłodzącanocycepcja termicznaanaliza genetycznatesty behawioralneekspresja genówobrazowanie fluorescencyjne
Nowy test na zimną nocycepcję u larw Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.